陰道菌群多樣性與早產(chǎn)相關(guān)性*

楊倩文,程 吉,陶 峰,楊湘玲,陳紅波

[安徽醫(yī)科大學(xué)附屬婦幼保健院(安徽省婦幼保健院)婦產(chǎn)科,合肥 230001]

我國(guó)新生兒死亡原因中早產(chǎn)約占27.3%，存活的早產(chǎn)兒可發(fā)生各種感染、腦癱等近遠(yuǎn)期并發(fā)癥[1]。早產(chǎn)的高危因素眾多、病因復(fù)雜，陰道微生態(tài)紊亂導(dǎo)致羊膜腔亞臨床感染是其中原因之一[2]。已有的臨床研究認(rèn)為,細(xì)菌性陰道病(bacterial vaginosis，BV)與自發(fā)性早產(chǎn)相關(guān)。Brown等[3]發(fā)現(xiàn)，陰道乳酸桿菌屬豐度降低、鏈球菌屬等其他條件致病菌屬豐度升高增加早產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)。Blostein等[4]證實(shí)，妊娠早期陰道菌群多樣性對(duì)早產(chǎn)的發(fā)生有預(yù)測(cè)價(jià)值。但也有部分研究認(rèn)為，早產(chǎn)孕婦與足月孕婦陰道菌群結(jié)構(gòu)并無(wú)顯著差異[5]。正常婦女陰道菌群結(jié)構(gòu)存在種族差異，如10%亞裔婦女陰道菌群中優(yōu)勢(shì)菌群為厭氧菌，而這一比例在非洲和西班牙裔婦女中為30%。妊娠不同時(shí)期陰道菌群多樣性也出現(xiàn)相應(yīng)變化，但相關(guān)研究較少[6]。本研究通過(guò)陰道微生態(tài)檢測(cè)和高通量測(cè)序技術(shù)探討妊娠晚期菌群多樣性與早產(chǎn)的相關(guān)性，為早產(chǎn)的防治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2021年1月至2021年7月因先兆早產(chǎn)在安徽省婦幼保健院住院的80例孕婦。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)孕28～35+6周胎膜完整孕婦，有規(guī)律或不規(guī)律宮縮，伴有宮頸管進(jìn)行性縮短，但宮口未開(kāi)；(2)單胎妊娠；(3)取樣前1月內(nèi)未使用抗生素(口服、靜脈及陰道內(nèi)用藥)；(4)近2周內(nèi)未使用益生菌制劑及陰道保胎制劑,無(wú)性生活3d以上,24h內(nèi)未使用污染陰道菌群的外用藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)宮頸機(jī)能不全及子宮畸形者；(2)前置胎盤及胎盤早剝者；(3)羊水過(guò)多者；(4)醫(yī)源性早產(chǎn)；(5)陰道分泌物B族鏈球菌檢測(cè)陽(yáng)性；(6)胎兒先天發(fā)育異?；蛉旧w畸形者。臨床處理：按照口服硝苯地平、靜滴利托君、靜滴阿托西班階梯選用宮縮抑制劑，早產(chǎn)不可避免或孕齡達(dá)36周時(shí)停用宮縮抑制劑；依據(jù)早產(chǎn)診療規(guī)范指導(dǎo)孕婦休息,給予促胎肺成熟治療；孕齡小于32周早產(chǎn)不可避免時(shí)加用硫酸鎂[7]。80例孕婦中，足月分娩52例(足月組)，早產(chǎn)28例(早產(chǎn)組)。選取同期正常孕檢婦女42例為對(duì)照組。本研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)審批，孕婦均簽署知情同意書(shū)。3組的一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

1.2 檢測(cè)方法 用兩根無(wú)菌棉拭子同時(shí)采集陰道上1/3側(cè)壁相同部位分泌物，一根棉拭子進(jìn)行陰道微生態(tài)檢查，另一根即刻-80℃凍存后進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.2.1 陰道微生態(tài)檢測(cè) 由本院檢驗(yàn)科完成，試劑盒及檢測(cè)儀器由山東仕達(dá)思公司提供。陰道微生態(tài)評(píng)價(jià)：陰道菌群的密集度和多樣性均在Ⅱ～Ⅲ級(jí)、優(yōu)勢(shì)菌為乳酸桿菌、pH≤4.5、H2O2濃度≥2μmol/L、LE及唾液酸苷酶(SnaSe)均陰性，其中任一項(xiàng)出現(xiàn)異常為陰道微生態(tài)失調(diào)；Nugent評(píng)分≥7分診斷為BV,AV評(píng)分≥3分診斷為AV,顯微鏡檢發(fā)現(xiàn)芽孢和(或)假菌絲診斷為外陰陰道假絲酵母菌病(vulvovaginal candidiasis,VVC),顯微鏡下可見(jiàn)白細(xì)胞增多及呈波狀運(yùn)動(dòng)的滴蟲(chóng)可診斷為滴蟲(chóng)性陰道炎(trichomonal vaginosis,TV)，同時(shí)存在兩種以上病原體或同時(shí)滿足兩種以上陰道炎癥診斷標(biāo)準(zhǔn)為混合性陰道炎[8-9]。

1.2.2 高通量測(cè)序 從3組標(biāo)本中隨機(jī)選取10例樣本進(jìn)行檢測(cè)，在Illumina NovaSeq6000平臺(tái)進(jìn)行雙端250bp測(cè)序(合肥諾為爾基因科技服務(wù)有限公司)。

1.2.2.1 DNA提取 CTBA法提取細(xì)菌DNA，使用紫外分光光度計(jì)(波長(zhǎng)為570)測(cè)定純度和濃度，以細(xì)菌總DNA為模板，使用上游引物341F：5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'；下游引物805R：5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3',對(duì)所有細(xì)菌的16S rDNA的V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：Phusion?Hot Start Flex 2X Master Mix(NEB，北京)12.5μL，F(xiàn)orward Primer(1μmol/L)2.5μL，Reverse Primer(1μmol/L)2.5μL，Template DNA 50ng，再以ddH2O補(bǔ)足體積為25μL；PCR擴(kuò)增條件：98℃ 30s,(98℃ 10s，54℃ 30s，72℃ 30s)?劏?35個(gè)循環(huán)，72℃ 10min，-80℃凍存。

1.2.2.2 16S rDNA可變區(qū)擴(kuò)增及Illumina高通量測(cè)序 PCR產(chǎn)物與相同體積的1×負(fù)荷緩沖液混合，在2%瓊脂糖凝膠電泳上檢測(cè)。選擇400～450bp樣品條進(jìn)行進(jìn)一步試驗(yàn)。使用AMPure XT beads(Beckman Coulter Genomics,Danvers,MA,USA)純化PCR產(chǎn)物。使用Kapa Biosciences,Woburn,MA試劑盒(Illumina,USA)文庫(kù)定量試劑盒進(jìn)行評(píng)估，并使用Qubit熒光儀(Invitrogen,USA)和Agilent Bioanalyzer 2100系統(tǒng)分析。

1.2.2.3 生物信息學(xué)分析 使用Cutadapt(v3.3)、Vsearch(v2.18.0)、Qiime(v2)軟件對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，對(duì)低質(zhì)量數(shù)據(jù)過(guò)濾去除，得到最終有效序列。采用Vsearch(v2.18.0)、Qiime(v2)軟件按97%相似性對(duì)最終有效序列進(jìn)行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚類，得到OTU代表序列。采用Qiime(v2)軟件，使用uclust算法對(duì)OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并在各個(gè)水平統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本的群落組成。采用Qiime(v2)軟件進(jìn)行Alpha多樣性、Beta多樣性分析，采用LDA Effect Size(LEfSe)分析不同分組患者間的陰道菌群在豐度上有顯著差異的物種。選取門水平、屬水平相對(duì)豐度大于0.001的物種，比較其相對(duì)豐度，繪制ROC曲線分析差異菌屬相對(duì)豐度對(duì)早產(chǎn)的預(yù)測(cè)效能。

2 結(jié) 果

2.1 陰道炎及陰道微生態(tài)失調(diào)情況 早產(chǎn)組的陰道微生態(tài)失調(diào)發(fā)生率高于足月組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，后兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；早產(chǎn)組的AV發(fā)生率高于足月組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；3組的BV、VVC、混合性陰道炎發(fā)生率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；所有孕婦均未檢測(cè)出TV。見(jiàn)表2。

表2 三組BV、VVC、AV、混合性陰道炎及陰道微生態(tài)失調(diào)情況比較[n(%)]

2.2 H2O2、LE、SnaSe陽(yáng)性率 早產(chǎn)組的H2O2陽(yáng)性率高于足月組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；早產(chǎn)組的LE陽(yáng)性率高于足月組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；3組的SnaSe陽(yáng)性率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 三組H2O2、LE、SnaSe陽(yáng)性率比較[n(%)]

2.3 測(cè)序信息 共測(cè)30個(gè)樣本，過(guò)濾低質(zhì)量、短長(zhǎng)度和嵌合體后共得到2098533條序列數(shù)，平均每一個(gè)樣本中含69951.1條序列數(shù)，有效序列長(zhǎng)度多分布于420～440bp。

2.4 Alpha多樣性分析 早產(chǎn)組的Shannon指數(shù)顯著高于足月組和對(duì)照組(P=0.047，P=0.017)。早產(chǎn)組Simpson指數(shù)顯著高于足月組和對(duì)照組(P=0.043，P=0.012)。3組間Chao1指數(shù)和Observed species指數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.153，P=0.111)。

2.5 Beta多樣性分析 主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)顯示第一主成分PCA1(44.74%)，第二主成分PCA2(20.65%)，PCA1和PCA2貢獻(xiàn)率之和為65.39%，說(shuō)明其已能反映樣本中大部分信息。3組樣本間Beta多樣性存在一定差異，其中早產(chǎn)組與足月組陰道菌群呈現(xiàn)分別聚類分布趨勢(shì)，差異顯著；但足月組與對(duì)照組陰道菌群不能顯著分開(kāi)，兩組間部分樣本有明顯相似性。

2.6 物種組成分析 在門水平，厚壁菌門(Firmicutes)在3組中均為豐度最高的菌門，在對(duì)照組、早產(chǎn)組、足月組中分別占95.16%、64.42%、88.28%；放線菌門(Actinobacteriota)在各組中的含量?jī)H次于厚壁菌門，在對(duì)照組、早產(chǎn)組、足月組中分別占3.35%、28.88%、10.12%；擬桿菌門(Bacteroidota)在早產(chǎn)組中占4.20%，在對(duì)照組和足月組中分別占0.19%和0.57%。

在菌屬水平，對(duì)照組主要含有兩大菌屬，分別為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)和加德納菌屬(Gardneralla)，含量分別為94.42%和3.19%；足月組主要由乳酸桿菌屬(85.04%)和奇異菌屬(Atopobium)(9.43%)組成。與對(duì)照組和足月組相比，早產(chǎn)組物種組成更加豐富，包括乳酸桿菌屬、加德納菌屬、奇異菌屬、普雷沃氏菌屬(Prevotella)、鏈球菌屬(Streptococcus)、支原體(Mycoplasma)、小桿菌屬(Dialister)、普拉梭菌屬(Faecalibacterium)、巨球菌屬(Megasphaera)(分別占46.78%，25.78%，2.41%，3.66%，3.35%，3.06%，2.37%，1.35%，1.28%)。

2.7 物種差異性分析 對(duì)3組陰道菌群進(jìn)行LEfSe分析，52個(gè)類群的LDA值大于3。在門和屬水平上，足月組主要富集于Patescibacteria門、Candidatus_Saccharimonas屬、Amylibacter屬。早產(chǎn)組主要富集于放線菌門、普雷沃菌屬、小桿菌屬、支原體屬。對(duì)照組主要富集于厚壁菌門、乳酸桿菌屬。

2.8 陰道菌群門和屬水平相對(duì)豐度比較 與足月組和對(duì)照組比較，在門水平，早產(chǎn)組厚壁菌門相對(duì)豐度降低(P=0.024，P=0.042)，在屬水平，早產(chǎn)組乳酸桿菌屬相對(duì)豐度減少(P=0.020，P=0.020)；早產(chǎn)組加德納菌屬聯(lián)合普雷沃氏菌屬的相對(duì)豐度升高(P=0.005，P=0.020)。見(jiàn)表4。

表4 門、屬水平三組陰道菌群相對(duì)豐度比較[M(P25～P75)]

2.9 陰道菌群差異細(xì)菌相對(duì)豐度對(duì)早產(chǎn)的預(yù)測(cè)價(jià)值 陰道加德納菌屬聯(lián)合普雷沃菌屬相對(duì)豐度預(yù)測(cè)早產(chǎn)發(fā)生的AUC最高為0.880，但與以厚壁菌門、乳酸桿菌屬相對(duì)豐度預(yù)測(cè)早產(chǎn)發(fā)生的AUC相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.633,P=0.778)。以陰道加德納菌聯(lián)合普雷沃菌屬相對(duì)豐度0.009為cut-off值時(shí)，其敏感度為80%，特異性為85%。見(jiàn)表5、圖1。

表5 陰道菌群差異細(xì)菌相對(duì)豐度對(duì)早產(chǎn)的預(yù)測(cè)價(jià)值分析

圖1 陰道菌群差異細(xì)菌對(duì)早產(chǎn)的預(yù)測(cè)價(jià)值分析的ROC曲線

3 討 論

臨床及亞臨床的宮內(nèi)感染與自發(fā)性早產(chǎn)相關(guān)[10]，下生殖道的病原體經(jīng)宮頸管逆行向上感染胎膜胎盤是宮內(nèi)感染最常見(jiàn)途徑[11]。妊娠晚期婦女陰道上皮細(xì)胞糖原含量增加、陰道黏膜水腫、陰道血液循環(huán)豐富等因素導(dǎo)致其易受各種病原體感染。BV被認(rèn)為是導(dǎo)致早產(chǎn)的重要危險(xiǎn)因素，且有孕周特異性。妊娠早期BV與早產(chǎn)的相關(guān)性顯著，但其能否作為獨(dú)立的高危因子還有待進(jìn)一步研究。Machado等[12]發(fā)現(xiàn)，妊娠期BV發(fā)生率為3.88%，其中陰道加德納菌檢出率達(dá)67.48%。Wang等[13]發(fā)現(xiàn)，妊娠期陰道炎發(fā)生率為59.0%，BV發(fā)生率為3.4%，妊娠期BV增加胎膜早破的風(fēng)險(xiǎn)但不增加早產(chǎn)發(fā)生率。本研究顯示，早產(chǎn)組BV發(fā)病率與足月組和對(duì)照組無(wú)顯著差異，但樣本量較小且均采自妊娠晚期孕婦。?，摰萚14]發(fā)現(xiàn)，妊娠晚期VVC發(fā)病率約為6.61%，并認(rèn)為妊娠晚期陰道微生態(tài)失調(diào)增加早產(chǎn)發(fā)生率。本研究發(fā)現(xiàn)，早產(chǎn)組、足月組及對(duì)照組的VVC發(fā)病率無(wú)明顯差異，但早產(chǎn)組陰道微生態(tài)失調(diào)發(fā)生率較高，與馬小星[15]研究結(jié)果一致，提示妊娠晚期陰道微生態(tài)失調(diào)與早產(chǎn)有相關(guān)性。

與傳統(tǒng)的陰道分泌物鏡檢和特異的生化鑒定所構(gòu)建的陰道微生態(tài)評(píng)價(jià)體系相比，第二代高通量測(cè)序技術(shù)不僅可快速、高效、準(zhǔn)確地在細(xì)菌種屬水平對(duì)微生物進(jìn)行鑒定和分型，而且還可對(duì)樣本中含量少、不易被顯微鏡鏡檢出的微生物組成進(jìn)行定性和定量分析，從而全面深入地描述菌群信息。研究表明，陰道菌群豐富度與多樣性隨孕周增加而增加，孕晚期陰道菌群豐富度和多樣性指數(shù)對(duì)早產(chǎn)的預(yù)測(cè)有更好的靈敏度，但特異度比孕中期低[16]。本研究結(jié)果顯示,Alpha多樣性指數(shù)中，早產(chǎn)組Shannon指數(shù)顯著高于足月組和對(duì)照組，提示早產(chǎn)組群落中物種多樣性較高。Serrano等[17]對(duì)613例早產(chǎn)孕婦的研究亦發(fā)現(xiàn)，陰道微生物多樣性明顯增多且主要以非乳酸桿菌的雜菌增多為主，與本研究結(jié)果基本一致。Beta多樣性反映不同樣本群落結(jié)構(gòu)的相似性，樣本集中則聚類好。本研究PCA分析發(fā)現(xiàn)三組樣本存在交疊現(xiàn)象，但組間存在差異。

本研究還顯示，在門水平，厚壁菌門在對(duì)照組、足月組、早產(chǎn)組中分別占95.16%、88.28%、64.42%，與Bayar等[18]研究結(jié)果基本一致。健康的陰道微生物菌群是以厚壁菌門為主導(dǎo)，其他少量菌群共存的動(dòng)態(tài)平衡體系，厚壁菌門中最重要的乳酸桿菌屬可能在維持陰道微生態(tài)平衡中發(fā)揮了不可或缺的作用[19]。在屬水平，早產(chǎn)組菌屬種類明顯增加，如乳酸桿菌屬、加德納菌屬、奇異菌屬、普雷沃氏菌屬、鏈球菌屬等，其中乳酸桿菌屬僅占46.78%，豐度明顯下降，而以加德納菌為主的厭氧菌屬豐度明顯升高。正常妊娠狀態(tài)下，陰道上皮細(xì)胞在體內(nèi)升高的雌孕激素作用下糖原含量增加，血供增加；乳酸桿菌可分解細(xì)胞內(nèi)增多的糖原產(chǎn)生更多乳酸、H2O2、抗菌物質(zhì)，維持陰道菌群處于一種有利于妊娠的狀態(tài)[20]，若陰道非乳酸菌群落占優(yōu)勢(shì)可能增加早產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)。本研究亦發(fā)現(xiàn)，早產(chǎn)組較足月組和對(duì)照組H2O2濃度降低，提示陰道微生態(tài)失調(diào)，而微生態(tài)失調(diào)多提示存在陰道炎癥，與目前國(guó)內(nèi)外研究結(jié)果一致[21-22]。陰道炎癥的治療目前主張補(bǔ)充優(yōu)勢(shì)益生菌促進(jìn)陰道微生態(tài)的恢復(fù)[23]。另外，乳酸桿菌可分為不同亞種，其中卷曲乳酸桿菌產(chǎn)乳酸能力很強(qiáng)，而惰性乳酸桿菌幾乎不產(chǎn)乳酸也不能產(chǎn)生H2O2，早產(chǎn)婦女中惰性乳酸桿菌含量明顯增多[24-25]。本研究未在種水平檢測(cè)出全部物種，下一步將進(jìn)行相關(guān)研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，早產(chǎn)患者陰道菌群中普雷沃氏菌屬含量較足月組及對(duì)照組明顯增高。普雷沃氏菌是一種常見(jiàn)的革蘭氏陰性厭氧桿菌，可細(xì)分為50多個(gè)亞種，作為條件致病菌廣泛存在于人體的腸道、口腔及陰道等環(huán)境中，且在機(jī)體不同部位的致病機(jī)制不完全相同[26-28]。在細(xì)菌性陰道病中該菌屬可與Toll樣受體2(Toll like receptors 2,TLR2)作用后刺激樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)釋放白細(xì)胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、IL-6、IL-23，繼而介導(dǎo)輔助T細(xì)胞(Th17)產(chǎn)生IL-17，激活中性粒細(xì)胞，引起炎癥反應(yīng)。DC還產(chǎn)生IL-12，介導(dǎo)Th1細(xì)胞的激活。而陰道上皮細(xì)胞可分別通過(guò)產(chǎn)生IL-8和趨化因子配體5[Chemokine(C-C motif)ligand 5，CCL5]促進(jìn)中性粒細(xì)胞和Th細(xì)胞的募集，加快機(jī)體對(duì)微生物的清除。譚莉莎等[21]研究發(fā)現(xiàn)，早產(chǎn)孕婦陰道菌群中普雷沃菌數(shù)量明顯高于足月分娩孕婦，與本研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果顯示，厚壁菌門和乳酸桿菌屬對(duì)早產(chǎn)預(yù)測(cè)價(jià)值的特異度高，但敏感度較低，有一定的局限性。加德納菌屬聯(lián)合普雷沃氏菌屬相對(duì)豐度預(yù)測(cè)早產(chǎn)的曲線下面積為0.880，cut-off值為0.009時(shí)(即當(dāng)妊娠晚期陰道內(nèi)加德納菌屬和普雷沃氏菌屬總的相對(duì)豐度達(dá)到0.009時(shí)),預(yù)測(cè)早產(chǎn)的靈敏度可達(dá)到80%、特異度為85%。研究表明，普雷沃菌屬不僅可分解上皮細(xì)胞內(nèi)的糖原產(chǎn)生丁二酸，還可分解氨基酸產(chǎn)生胺，陰道加德納菌可利用胺合成氨基酸[26]，兩者協(xié)同刺激相互促進(jìn)生長(zhǎng)，進(jìn)而可誘發(fā)早產(chǎn)、子宮內(nèi)膜炎和其他子宮炎性疾病[27-28]。Gilbert等[29]通過(guò)建立普雷沃菌屬與陰道加德納菌屬共同感染的BV小鼠模型，發(fā)現(xiàn)陰道加德納菌可提升普雷沃菌屬逆行向上感染宮腔的能力。Odogwu等[30]采用巢氏病例對(duì)照研究的方法收集38例孕婦的陰道分泌物(孕17～21周)，發(fā)現(xiàn)自發(fā)性早產(chǎn)患者陰道阿托波菌屬、厭氧消化鏈球菌屬、陰道加德納菌屬、普雷沃菌屬、Parvimonas屬、Aerococcus屬較足月分娩顯著增多，孕中期陰道阿托波菌屬作為預(yù)測(cè)早產(chǎn)的微生物標(biāo)記物的敏感度和特異度分別為95.1%和100%。Fettweis等[31]認(rèn)為，孕晚期早產(chǎn)患者陰道菌群結(jié)構(gòu)與足月分娩的孕婦相比存在更多差異，進(jìn)一步分析研究得出纖毛菌屬、細(xì)菌性陰道病相關(guān)致病菌1(bacterial vaginosis-associated bacteria1,BVAB1)、普雷沃氏菌屬和BVAB-TM7可用于預(yù)測(cè)早產(chǎn)，其敏感度和特異度分別為77.4%和76.3%。

綜上所述，妊娠晚期陰道微生態(tài)失衡與早產(chǎn)發(fā)生密切相關(guān)，陰道加德納菌屬聯(lián)合普雷沃氏菌屬總的相對(duì)豐度對(duì)預(yù)測(cè)早產(chǎn)發(fā)生有較高的靈敏度和特異度。本研究還存在一些不足之處，如未對(duì)孕期菌群構(gòu)成進(jìn)行妊娠不同時(shí)期的縱向研究，測(cè)序樣本量較少，未對(duì)高?；颊哌M(jìn)行外源性補(bǔ)充益生菌等干預(yù)性措施，后續(xù)將進(jìn)一步補(bǔ)充相關(guān)研究。