陳佳寧 呂 志 蘇建榮* 康熙雄

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院臨床檢驗中心，北京100050;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院實驗診斷中心，北京100050)

正常陰道菌群以乳酸桿菌為優(yōu)勢菌，同時含有少量其他類型的厭氧菌等微生物［1］。陰道菌群維持著陰道微生態(tài)環(huán)境的平衡。

細(xì)菌性陰道病(bacterial vaginosis，BV)是一種菌群失衡的疾病狀態(tài)，其特征是陰道菌群中以乳酸桿菌為主的正常定植菌數(shù)量減少和(或)種類缺失，而以厭氧菌為主的條件致病菌占據(jù)了優(yōu)勢菌的地位，從而導(dǎo)致了陰道微生態(tài)的失衡，容易引起一系列的合并癥，如早產(chǎn)、盆腔炎性反應(yīng)甚至腫瘤等［2-3］。目前引起B(yǎng)V陰道菌群失衡的病因?qū)W機制尚未明確［4］，乳酸桿菌與其他條件致病性厭氧菌之間的關(guān)系仍有待深入研究。

陰道菌群中的大多數(shù)細(xì)菌為苛刻厭氧菌，難以進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)和分離，只能利用分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定。本研究采用16S rRNA PCR方法對陰道菌群中的8種細(xì)菌進(jìn)行檢測，包括正常陰道菌群中常見的3種乳酸桿菌:卷曲乳酸桿菌(lactobacillus crispatus，L.crispatus)、詹氏乳酸桿菌(lactobacillus jensenii，L.jensenii)和惰性乳酸桿菌(lactobacillus iners，L.iners);5種在BV陰道菌群中分離率較高的細(xì)菌［5］:包括陰道加德納菌(gardnerella vaginalis，G.vaginalis)、陰道阿托波菌(atopobium vaginae，A.vaginae)、普雷沃菌屬(prevotella sp)、纖毛菌屬(leptotrichia sp)和巨球菌屬(megasphaera sp)。對這8種細(xì)菌的分離率進(jìn)行分析，研究陰道菌群中乳酸桿菌和BV相關(guān)條件致病菌之間以及致病菌和致病菌之間的關(guān)系，以加深對BV陰道菌群構(gòu)成狀況的理解，為實驗室更準(zhǔn)確地診斷BV奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

篩選170例18～45歲非妊娠期育齡婦女，研究對象均來自首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院婦科門診和北京市房山區(qū)婦幼保健院門診，除外滴蟲、真菌等特異性陰道感染性疾病，除外梅毒等性傳播疾病。按照Amsel標(biāo)準(zhǔn)［1］和Nugent積分方法進(jìn)行分組。符合Amsel標(biāo)準(zhǔn)、同時Nugent積分≥7的劃入BV組，共86例;不符合Amsel標(biāo)準(zhǔn)且Nugent評分為0～6分的劃入非BV組(對照組)，共84例。

Amsel標(biāo)準(zhǔn):① 分泌物外觀稀薄、均勻黏附于陰道壁;② 陰道pH值＞4.7;③ 胺試驗陽性;④ 分泌物涂片中找到線索細(xì)胞。找到線索細(xì)胞為必備項目，同時需有其他任意2項陽性。

1.2 標(biāo)本采集

無菌棉拭子在受檢者陰道壁下1/3處采集分泌物，放入無菌試管中立即送檢。

1.3 主要試劑和儀器

1)試劑:細(xì)菌基因組DNA試劑盒(美國OMEGA公司)，瓊脂糖(北京賽百盛基因技術(shù)有限公司，中國)。

2)儀器:ABI7300PCR分析儀(美國 ABI公司)，DYY-10C型電泳儀(北京六一儀器廠，中國)，Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.4 細(xì)菌基因組DNA提取

棉拭子在PBS緩沖液中懸浮振蕩30 s，12 000 r/min離心5 min，取菌體沉淀按照DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA。提取的總DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，－20℃保存。

1.5 細(xì)菌特異性16S rRNA PCR檢測及擴增產(chǎn)物分析

1)PCR:以樣本總DNA為模板，分別采用卷曲乳酸桿菌、詹氏乳酸桿菌、惰性乳酸桿菌、陰道加德納菌、陰道阿托波菌、普雷沃菌屬、纖毛菌屬和巨球菌屬共8種細(xì)菌特異性引物擴增其中的16S rRNA片段。引物序列、PCR擴增片段長度及擴增條件見本課題組已發(fā)文章［5-6］。

2)產(chǎn)物分析:擴增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠(含0.15 mg/L溴化乙啶)中以100 V電壓電泳30～40 min，全自動凝膠圖像分析系統(tǒng)顯像觀察。符合片段大小的陽性擴增產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后由上海英俊生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA測序，并通過BLAST與Gene Bank比對。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。任意2種細(xì)菌之間的相關(guān)性利用χ2檢驗和Spearman等級相關(guān)系數(shù)(Spearman’s rank correlation coefficient，rs)進(jìn)行分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，相關(guān)性顯著。rs相關(guān)程度判斷標(biāo)準(zhǔn):0.9～1.0，存在非常高的相關(guān)性;0.7 ～0.9，高度相關(guān);0.5 ～0.7，中度相關(guān);0.3 ～0.5，低度相關(guān);0～0.3，微相關(guān);0為無線性相關(guān)。3種及3種以上的細(xì)菌間相關(guān)性判斷利用Kendall和諧系數(shù)W進(jìn)行W假設(shè)檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測乳酸菌和BV相關(guān)細(xì)菌

卷曲乳酸桿菌、詹氏乳酸桿菌在非BV組的檢出率明顯高于BV組(P＜0.05)，而惰性乳酸桿菌在2組的檢出率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。陰道加德納菌、陰道阿托波菌、普雷沃菌屬、巨球菌屬以及纖毛菌屬在BV組的檢出率明顯高于非BV組(P＜0.05)，詳見表1。

表1 乳酸桿菌和BV相關(guān)細(xì)菌在BV組及非BV組的PCR檢測結(jié)果Tab.1 Distribution of lactobacilli and bacterial vaginosis associated bacteria in women in non-BV and BV groups determined by PCR n(%)

2.2 卷曲乳酸桿菌、詹氏乳酸桿菌與惰性乳酸桿菌之間的關(guān)系

170位BV及非BV婦女中，卷曲乳酸桿菌的檢出率為51.2%(87/170)，詹氏乳酸桿菌為27.6%(47/170)，惰性乳酸桿菌為45.3%(77/170)。任意2種乳酸桿菌之間存在顯著的正相關(guān)性，相關(guān)程度為低度相關(guān)(表2)。對Kendall和諧系數(shù)進(jìn)行W假設(shè)檢驗，結(jié)果說明3種乳酸桿菌之間也存在顯著的相關(guān)性(χ2=26.000，P ＜0.001)。

以卷曲乳酸桿菌為例，在檢出卷曲乳酸桿菌的標(biāo)本中，詹氏乳酸桿菌和惰性乳酸桿菌的檢出率明顯升高，詳見表3。

表2 乳酸桿菌之間的Spearman等級相關(guān)系數(shù)(rs)Tab.2 Spearman’s rank correlation coefficient(rs)of lactobacillus

表3 卷曲乳酸桿菌存在和不存在時不同細(xì)菌的檢出率Tab.3 Prevalence of various bacteria according to the presence or absence of L.crispatus

2.3 BV相關(guān)致病菌之間的關(guān)系

陰道加德納菌、陰道阿托波菌、普雷沃菌屬、纖毛菌屬、巨球菌屬在170名被檢婦女中的檢出率依次為52.9%(90/170)、31.8%(54/170)、43.5%(74/170)、22.4%(38/170)、17.1%(29/170)。陰道加德納菌與陰道阿托波菌(rs=0.415，P ＜0.05)、普雷沃菌屬(rs=0.210，P ＜0.05)以及纖毛菌屬(rs=0.273，P＜0.05)存在顯著的正相關(guān)關(guān)系(表4)，在陰道加德納菌存在的標(biāo)本中，此3種細(xì)菌的檢出率明顯升高(表5)。巨球菌屬與陰道加德納菌沒有相關(guān)性(rs=0.107，P＞0.05)。陰道阿托波菌和其他4種 BV 相關(guān)細(xì)菌均具有顯著的正相關(guān)性，普雷沃菌屬和纖毛菌屬也是如此。陰道阿托波菌與陰道加德納菌、纖毛菌屬間為中等程度的正相關(guān)，其余存在相關(guān)性的任意2種BV相關(guān)致病菌間均為低度相關(guān)。Kendall和諧系數(shù)的W假設(shè)檢驗結(jié)果顯示5種BV相關(guān)致病菌之間存在顯著的相關(guān)性(χ2=87.612，P ＜ 0.001)，詳見表4。

表4 BV相關(guān)致病菌之間的Spearman等級相關(guān)系數(shù)(rs)Tab.4 Spearman’s rank correlation coefficient(rs)of BV-associated bacteria

表5 陰道加德納菌存在和不存在時BV相關(guān)細(xì)菌的檢出率Tab.5 Prevalence of BV-associated bacteria according to the presence or absence of G.vaginalis

2.4 乳酸桿菌與BV相關(guān)致病菌之間的關(guān)系

卷曲乳酸桿菌與普雷沃菌屬存在顯著的負(fù)相關(guān)性，而其他4種BV相關(guān)細(xì)菌的檢出率與卷曲乳酸桿菌無顯著關(guān)聯(lián)(表6)。惰性乳酸桿菌與陰道加德納菌呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。普雷沃菌屬、巨球菌屬和纖毛菌屬的檢出率與惰性乳酸桿菌存在與否沒有顯著的關(guān)聯(lián)。詹氏乳酸桿菌與陰道加德納菌、陰道阿托波菌和纖毛菌屬呈負(fù)相關(guān)。普雷沃菌屬和巨球菌屬與詹氏乳酸桿菌沒有相關(guān)性。乳酸桿菌與對應(yīng)有關(guān)聯(lián)的BV相關(guān)致病菌間相關(guān)程度均為低度。

Kendall和諧系數(shù)的W假設(shè)檢驗結(jié)果顯示乳酸桿菌與BV相關(guān)致病菌之間有顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(χ2=99.142，P ＜0.001)。

表6 乳酸桿菌與BV相關(guān)致病菌間的Spearman等級相關(guān)分析Tab.6 Spearman’s rank correlation coefficient(rs)between lactobacilli and BV-associated bacterium

3 討論

細(xì)菌性陰道病是陰道菌群失衡的一種疾病狀態(tài)，正常優(yōu)勢菌乳酸桿菌的比例下降或缺失、陰道加德納菌和其他厭氧菌的比例升高，陰道的正常微生態(tài)環(huán)境被破壞［7］。

正常陰道定植的乳酸桿菌種類很多，大量的研究［8-11］認(rèn)為乳酸桿菌特別是產(chǎn)過氧化氫的乳酸桿菌在維持陰道自潔、抑制致病微生物過量繁殖中起著重要的作用。本研究選擇了卷曲乳酸桿菌、詹氏乳酸桿菌和惰性乳酸桿菌3種陰道常見乳酸桿菌［12-13］進(jìn)行研究。Antonio等［14］報道，卷曲乳酸桿菌和詹氏乳酸桿菌產(chǎn)過氧化氫的能力最強。惰性乳酸桿菌是已知產(chǎn)過氧化氫較弱的乳酸桿菌。在現(xiàn)有的報道中，幾乎所有的卷曲乳酸桿菌和詹氏乳酸桿菌的菌株都可以產(chǎn)生過氧化氫，而惰性乳酸桿菌僅有約9%的菌株能夠產(chǎn)生過氧化氫［14-15］。

本研究中，卷曲乳酸桿菌和詹氏乳酸桿菌在非BV組的檢出率顯著高于BV組，而惰性乳酸桿菌在2組間的檢出率無顯著差別，與Tamrakar等［13］的報道相符。這也符合乳酸桿菌的產(chǎn)過氧化氫理論，即在BV時產(chǎn)過氧化氫能力強的卷曲乳酸桿菌和詹氏乳酸桿菌明顯減少，而產(chǎn)過氧化氫能力弱的惰性乳酸桿菌在BV陰道菌群與非BV陰道菌群中變化不明顯。

本研究顯示，卷曲乳酸桿菌、詹氏乳酸桿菌、惰性乳酸桿菌3種乳酸桿菌具有顯著的共存性。證明陰道菌群中乳酸桿菌是多種類并存的。

在本研究涉及的5種BV相關(guān)致病菌中，只有普雷沃菌屬與卷曲乳酸桿菌存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，即在卷曲乳酸桿菌不存在的標(biāo)本中，普雷沃菌屬的檢出率增高，陰道加德納菌等的檢出率和卷曲乳酸桿菌的存在與否并無明確關(guān)聯(lián)，這與卷曲乳酸桿菌的強產(chǎn)過氧化氫能力似乎不符。因為本研究是基于定性PCR檢測，不能反映檢測菌的量和比例關(guān)系，所以也可以推斷可能是陰道菌群中卷曲乳酸桿菌的量和比例關(guān)系決定了其對BV相關(guān)細(xì)菌的影響。

詹氏乳酸桿菌與陰道加德納菌、陰道阿托波菌和纖毛菌屬均存在顯著的負(fù)相關(guān)，證明這3種BV相關(guān)致病菌通常不與詹氏乳酸桿菌共存于陰道菌群中。說明詹氏乳酸桿菌的存在對陰道加德納菌、陰道阿托波菌和纖毛菌屬有明顯的負(fù)性影響，即可能會抑制這3種菌的生長。這與詹氏乳酸桿菌的強過氧化氫產(chǎn)生能力相符合。普雷沃菌屬、巨球菌屬與詹氏乳酸桿菌無明確關(guān)聯(lián)。

惰性乳酸桿菌與陰道加德納菌呈負(fù)相關(guān)，陰道阿托波菌、普雷沃菌屬、纖毛菌屬和巨球菌屬的檢出率與惰性乳酸桿菌無明確關(guān)聯(lián)，這與Tamrakar等［15］的報道相反。Tamrakar等［15］研究認(rèn)為惰性乳酸桿菌與BV相關(guān)細(xì)菌有共存關(guān)系。本文的結(jié)果表明惰性乳酸菌作為陰道正常定植乳酸菌的一種，與陰道加德納菌有顯著的“不共存性”，而與陰道阿托波菌、普雷沃菌屬、纖毛菌屬和巨球菌屬之間也無明顯依存關(guān)系。這或可說明惰性乳酸桿菌對BV常見的致病菌陰道加德納菌具有一定的抑制作用，也可能惰性乳酸桿菌是通過與其他乳酸桿菌的共生來達(dá)到某種穩(wěn)態(tài)以抑制陰道加德納菌的生長。而惰性乳酸桿菌與其他4種BV相關(guān)致病菌無顯著關(guān)聯(lián)性，這與其較弱的過氧化氫產(chǎn)生能力是相符的。

本研究對BV相關(guān)致病菌分析后發(fā)現(xiàn)，除陰道加德納菌與巨球菌屬無明顯關(guān)聯(lián)外，5種BV相關(guān)細(xì)菌之間均存在正相關(guān)關(guān)系。這證明BV陰道菌群是多種致病菌共存的復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境，并非單一致病菌在起作用。本研究顯示陰道阿托波菌與陰道加德納菌、普雷沃菌屬和纖毛菌屬的共存關(guān)系較強，并且3種常見乳酸桿菌與5種BV相關(guān)致病菌之間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，即不共存性。由此可見，單獨對某一種BV相關(guān)細(xì)菌進(jìn)行檢測不能對BV進(jìn)行有效的診斷，更不能反映陰道菌群的真實情況。對具有顯著共存關(guān)系的BV相關(guān)細(xì)菌進(jìn)行聯(lián)合測定，能夠給臨床提供更準(zhǔn)確的診斷結(jié)果和更真實的陰道菌群構(gòu)成情況。通過本研究可推斷聯(lián)合檢測陰道阿托波菌、普雷沃菌屬、纖毛菌屬會為BV提供更準(zhǔn)確的診斷。如果同時引入與BV相關(guān)細(xì)菌有顯著不共存關(guān)系的乳酸桿菌加入到上述聯(lián)合檢測中，也可能會有意想不到的良好效果。

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