基于環(huán)境DNA宏條形碼的柴河浮游藻類研究

呂嘉誠，林淵源，李愛軍，趙 崢

（1.昆明學(xué)院，昆明市河湖健康評估與修復(fù)院士工作站，云南省高校河湖健康評估與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650214；2.云南省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，云南 昆明 650034）

0 引言

浮游藻類是水生態(tài)系統(tǒng)關(guān)鍵類群之一[1]。浮游藻類多樣性可反映水生態(tài)系統(tǒng)健康狀況，對指導(dǎo)受損水生態(tài)系統(tǒng)的修復(fù)有重要作用，廣泛應(yīng)用于河湖生態(tài)健康評估和修復(fù)[2]。近年來滇池浮游藻類群落結(jié)構(gòu)引起人們的廣泛關(guān)注，學(xué)者們探尋其群落結(jié)構(gòu)的變化特征[3]，研究影響群落結(jié)構(gòu)的環(huán)境因子[4]，為滇池的治理和修復(fù)提供了諸多基礎(chǔ)信息。柴河是滇池的主要入湖河流，由于河流周邊持續(xù)的農(nóng)業(yè)活動(dòng)，成為滇池流域典型的農(nóng)業(yè)面源污染河道[4]。研究發(fā)現(xiàn)柴河從上游到下游浮游藻類檢出率、藻密度與河流位置無關(guān)，與采樣點(diǎn)具體環(huán)境有關(guān)，石門坎水庫未能檢出浮游藻類，且在甸頭人民壩發(fā)生柵藻（Scenedesmus）水華現(xiàn)象[5]。

環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)的應(yīng)用，為分析浮游藻類多樣性提供了新途徑[6]。許多研究已經(jīng)證明了環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)在監(jiān)測浮游藻類方面的出色效果[7]。有研究表明環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)與傳統(tǒng)方法相比在顯示浮游藻類豐度方面有顯著提升，同時(shí)能監(jiān)測到更為豐富的浮游藻類多樣性[8]。在評估水生生物多樣性方面結(jié)果可靠，并在描述水生生態(tài)景觀差異時(shí)展現(xiàn)出很大潛力[9]。已有研究人員使用環(huán)境DNA高通量測序方法對太湖等典型湖泊藻類進(jìn)行了監(jiān)測，證明環(huán)境DNA高通量測序是一種潛在代替?zhèn)鹘y(tǒng)監(jiān)測方法的優(yōu)秀工具[10-13]。

基于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的浮游藻類研究，對專業(yè)要求較高且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。為了高效快速地監(jiān)測柴河浮游藻類狀況，本研究于2021年7月，在柴河水庫及水庫上下游的三個(gè)采樣點(diǎn)，通過環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)及顯微鑒定計(jì)數(shù)法調(diào)查柴河浮游藻類的群落組成和分布，旨在探討環(huán)境DNA宏條形碼對柴河浮游藻類研究的適用性，并科學(xué)評價(jià)其水質(zhì)，為柴河水資源保護(hù)提供基礎(chǔ)資料。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 采樣點(diǎn)布設(shè)和環(huán)境樣品采集

柴河位于昆明市晉寧區(qū)。作為滇池南岸主要入湖河流，柴河承擔(dān)著防洪、灌溉等任務(wù)。柴河流域以第一產(chǎn)業(yè)為主，農(nóng)藥化肥使用量較大，流域內(nèi)農(nóng)田污染物隨降雨進(jìn)入河道，是滇池湖泊富營養(yǎng)化的驅(qū)動(dòng)力之一[14]。在雨季（2021年7月）對柴河水進(jìn)行環(huán)境DNA測序及顯微鏡鑒定計(jì)數(shù)進(jìn)行浮游藻類多樣性分析。研究中，在柴河選擇了柴河水庫及其上下游三個(gè)采樣點(diǎn)位（24°31′～24°37′N，102°40′～102°41′E），點(diǎn)位海拔（1955～1916 m），這些地點(diǎn)包括了位于六街鎮(zhèn)的柴河源頭和承擔(dān)生活用水的柴河水庫以及段七村旁的柴河主河道（圖1）。

圖1 柴河采樣點(diǎn)位

eDNA方法和顯微鑒定計(jì)數(shù)法在相同點(diǎn)位采樣，兩種方法在水體表層分別采集水樣2 L。采樣時(shí)對現(xiàn)場進(jìn)行觀察并做好采樣記錄。樣品采集好后帶回實(shí)驗(yàn)室，放置在4℃冰箱中保存至過濾前。過濾前將水樣混勻，然后使用真空過濾泵經(jīng)0.45 mm濾膜得到三組重復(fù)樣品，三個(gè)重復(fù)的樣本來自同一采樣點(diǎn)。在每個(gè)采樣點(diǎn)使用過濾相同體積去離子水的方法，建立空白對照，過濾后濾膜儲(chǔ)存在-80℃冰箱內(nèi)至分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)前。

1.2 浮游藻類多樣性分析的傳統(tǒng)方法

研究中鑒定浮游藻類使用的傳統(tǒng)方法是顯微鑒定計(jì)數(shù)法，每個(gè)采樣點(diǎn)用采水器采集2 L水樣，水樣放入棕色瓶并加入30 mL魯哥氏液固定，使用當(dāng)天采集的水樣獲取采樣點(diǎn)浮游藻類數(shù)據(jù)。這種方法確保了兩種方法之間確定的浮游藻類數(shù)據(jù)差異不是由外在水質(zhì)變化等因素造成的。在采樣點(diǎn)采集樣品時(shí)，將同一點(diǎn)位采集的樣本混勻，最大限度提高了檢測浮游植物的準(zhǔn)確性和概率。采樣后將采樣瓶放入冷凍保溫箱保存，并及時(shí)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，具體操作根據(jù)《SC/T 9402-2010 淡水浮游生物調(diào)查技術(shù)規(guī)范》進(jìn)行[15]，浮游藻類形態(tài)學(xué)鑒定由云南省生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心專家進(jìn)行鑒定。

1.3 DNA宏條形碼技術(shù)監(jiān)測分析方法

1.3.1 DNA提取與PCR擴(kuò)增

水環(huán)境DNA提取實(shí)驗(yàn)在“昆明市河湖健康評估與修復(fù)院士工作站” “云南省高校河湖健康評估與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)室具備完成本項(xiàng)目研究的儀器設(shè)備和工作條件。按照提取試劑盒的操作步驟，使用PowerWater水樣DNA提取試劑盒提取DNA，但根據(jù)實(shí)際情況需稍加修改使用。每個(gè)采樣點(diǎn)水樣搖勻后取500 mL經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，將濾膜放入到研磨管中，在SP buffer和Lysis S Buffer作用下，通過劇烈震蕩，基因組DNA被釋放出來。通過離心，去除大部分雜質(zhì)。加入沉淀腐殖酸、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的DA buffer，然后加入有適當(dāng)鹽分及pH值的Bingding Buffer，DNA被特異性吸附在Biospin離心柱膜上。通過洗滌，將金屬離子等殘留的雜質(zhì)去除。最后使用Elution Buffer將DNA從濾膜上洗脫下來，獲得基因組DNA。過濾的空白對照和陰性對照與樣品一起提取，并與樣品采用相同的方案。經(jīng)提取的環(huán)境DNA使用超微量紫外分光光度計(jì)測定DNA濃度，并同時(shí)在1%瓊脂糖凝膠中檢測。使用超微量紫外分光光度計(jì)測定過濾空白和陰性對照的環(huán)境DNA濃度，空白和陰性對照結(jié)果應(yīng)顯示為空白及陰性。

使用引物序列為“TCCCTGCCHTTTGTACAC AC”的正向引物，序列為“CCTTCYGCAGGTTC ACCTAC”的反向引物擴(kuò)增真核浮游藻類的18S rRNA的V9區(qū)。采用序列為“ACCTACGGGRSGC WGCAG”的正向引物，序列為 “TTACCGCGGC KGCTGG”的反向引物擴(kuò)增原核浮游藻類的基因，以識(shí)別原核浮游藻類種類，該引物針對核糖體小亞基16S rRNA的V3區(qū)[16-17]。DNA擴(kuò)增再在Applied Biosystems VeritiPro PCR平臺(tái)進(jìn)行，對每個(gè)樣本做三次PCR重復(fù)。PCR反應(yīng)體系為 30 μL，包括15 μL 2×Rapid Taq Master Mix， 12 μL ddH2O，1.5 μL正向引物，1.5 μL反向引物以及1 μL的DNA模板（環(huán)境樣品、過濾空白和陰性對照）。對于所有樣本反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性3 min，然后對反應(yīng)進(jìn)行33個(gè)循環(huán)（95℃保持 15 s，58℃保持15 s，72℃保持3 s）最后72℃保持5 min以達(dá)到徹底延伸。PCR擴(kuò)增后，在2%的瓊脂糖凝膠中檢測PCR產(chǎn)物，并保證過濾空白和陰性對照都沒有擴(kuò)增跡象。

1.3.2 文庫構(gòu)建及高通量測序

使用膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物，并用TE緩沖液洗脫回收目標(biāo)DNA片段。使用IIIumina公司TruSeq DNA PCR-Free Sample Prep Kit（FC-121-30001/3003）。

測序采用PE300測序方式，測序試劑盒使用IIIumina公司MiSeq Reagent Kit v3（600 Cycle）。

1.3.3 生物信息學(xué)分析

使用QIIME25軟件完成生物信息操作。為了獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)，對測序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行序列拼接，并根據(jù)Barcode區(qū)分樣品，初步篩選過濾，消除低質(zhì)量數(shù)據(jù)，使用基于OTU的方法構(gòu)建特征表，并去除低頻率OTU以降低假陽性結(jié)果[18]。將OTU序列通過國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）GenBank數(shù)據(jù)庫下載的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，如果序列存在，則認(rèn)為屬于一個(gè)物種。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)分析

計(jì)算eDNA的生物多樣性指數(shù)時(shí)，使用R語言的R studio操作界面加載vegan包后進(jìn)行計(jì)算[19]。測序數(shù)據(jù)與顯微鏡直接計(jì)數(shù)的數(shù)據(jù)一起輸入EXCEL軟件。將物種序列數(shù)豐富度數(shù)據(jù)與顯微鏡直接計(jì)數(shù)法數(shù)據(jù)分別計(jì)算，后將數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，物種的相對豐度根據(jù)OTU豐度表和物種計(jì)數(shù)表計(jì)算。使用SPSS19軟件計(jì)算以確定樣本組之間存在的差異[20]。平行間交叉情況計(jì)算公式為[7]：

1.3.5 基于浮游植物多樣性指數(shù)的水質(zhì)生物學(xué)評估

Shannon-Wiener多樣性指數(shù)H'在0～1代表重污染，H'在1～2代表中污染，H'在2～3代表輕污染，H'＞3代表清潔。[21]

Pielou均勻度指數(shù)J在0～0.3代表重污染，J在0.3～0.5代表中污染，J＞0.5代表輕污染或無污染[21]。

2 結(jié)果分析

2.1 柴河浮游藻類多樣性監(jiān)測

2.1.1 柴河浮游藻類門水平群落組成

用顯微鑒定計(jì)數(shù)法對3個(gè)點(diǎn)位采集的水樣進(jìn)行藻類鑒定分析，鑒定了6門16目18科24屬的浮游藻類（表1）。在顯微鑒定計(jì)數(shù)法觀察到的浮游植物中，以細(xì)胞數(shù)區(qū)分優(yōu)勢門類，優(yōu)勢門中，藍(lán)藻門（Cyanophyta）占95.35%、硅藻門（Bacillariophyta）占1.4%、隱藻門（Cryptophyta）占1.13%、綠藻門（Chlorophyta）占1.06%（圖2a）。在顯微鑒定計(jì)數(shù)法發(fā)現(xiàn)的24屬浮游藻類中，藍(lán)藻門假魚腥藻屬（Pseudanabaena）占76.84%、藍(lán)纖藻屬（Dactylococcopsis）占9.36%、尖頭藻屬（Raphidiopsis）占4.06%。

通過eDNA宏條形碼技術(shù)在3個(gè)點(diǎn)位鑒定出了來自9門25目33科43屬的浮游藻類（表1）。在eDNA高通量測序得到的有關(guān)浮游藻類的124個(gè)OTU中，最具代表性的門類，藍(lán)藻門（Cyanophyta）占31.39%、綠藻門（Chlorophyta）占23.81%、黃藻門（Xanthophyta）占21.06%、硅藻門（Bacillariophyta）占8.69%（圖2b）。環(huán)境DNA高通量測序平均每個(gè)點(diǎn)位發(fā)現(xiàn)浮游藻類32屬，監(jiān)測到豐度最高的藻類同樣是藍(lán)藻門假魚腥藻屬。從發(fā)生頻率來看，前三位中，藍(lán)藻門假魚腥藻屬（Pseudanabaena）占22.68%、黃藻門周泡藻屬（Vacuolaria）占21.06%、綠藻門腎形藻屬（Nephroselmis）占20.05%。

表1 eDNA宏條形碼技術(shù)和顯微鑒定計(jì)數(shù)法在柴河檢測到的浮游藻類類群數(shù)量

結(jié)合顯微鑒定計(jì)數(shù)法和eDNA高通量測序數(shù)據(jù)顯示優(yōu)勢門為：藍(lán)藻門（Cyanophyta）占63.37%、綠藻門（Chlorophyta）占12.44%、黃藻門（Xanthophyta）占10.53%、硅藻門（Bacillariophyta）占5.03%。通過這兩種方法共同發(fā)現(xiàn)了藍(lán)藻門（Cyanophyta）、綠藻門（Chlorophyta）、硅藻門（Bacillariophyta）、甲藻門（Dinophyta）、隱藻門（Cryptophyta）、裸藻門（Euglenophyta）（圖2a、2b、2c）。

圖2 兩種方法監(jiān)測到的柴河浮游植物門類組成

2.1.2 柴河浮游藻類屬水平分布

通過eDNA宏條形碼技術(shù)監(jiān)測結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)選取的3個(gè)采樣點(diǎn)水平浮游藻類相對豐度差異很大。點(diǎn)位一位于人類活動(dòng)相對較少的六街鎮(zhèn)楊樹種植區(qū)，樣品中衣藻屬（Chlamydomonas）相對豐度最高，其次是隱藻屬（Cryptomonas）、菱形藻屬（Nitzschia）、鐘罩藻屬（Dinobryon）。點(diǎn)位二地處柴河水庫，樣品中假魚腥藻屬相對豐度最高，其次是周泡藻屬（Vacuolaria）、微囊藻屬（Microcystis）。點(diǎn)位三位于段七村，樣品中菱形藻屬（Nitzschia）、剛毛藻屬、假魚腥藻屬是優(yōu)勢藻屬（圖4）。

圖4 eDNA宏條形碼各位點(diǎn)相對豐度

顯微鏡直接計(jì)數(shù)法監(jiān)測到點(diǎn)位一水樣中隱藻屬、小環(huán)藻藻屬（Cyclotella）、柵藻屬（Scenedesmus）為優(yōu)勢藻屬。點(diǎn)位二中假魚腥藻屬、尖頭藻屬（Raphidiopsis）是優(yōu)勢藻屬。點(diǎn)位三優(yōu)勢藻門為硅藻門，但相應(yīng)藻屬未辨別出名稱（圖3）。

圖3 顯微鑒定計(jì)數(shù)法各位點(diǎn)相對豐度

2.2 環(huán)境DNA宏條形碼監(jiān)測的精準(zhǔn)性

2.2.1 平行樣本間監(jiān)測情況

eDNA高通量測序從9個(gè)送檢樣本中共檢出真核浮游藻類13051條18srDNA序列，原核浮游藻類7689條16srDNA序列。最終有124個(gè)OUT被注釋到43屬浮游藻類上，涵蓋了藍(lán)藻門、綠藻門、硅藻門、甲藻門、隱藻門、裸藻門、金藻門、紅藻門、黃藻門等主要浮游藻類類群。在準(zhǔn)確性方面，檢測到目標(biāo)類群的平行樣本中，3個(gè)平行樣品的交叉率達(dá)到34.96%，至少出現(xiàn)在兩個(gè)平行樣品的屬所占比例為55.01%（表2）。

表2 eDNA宏條形碼監(jiān)測數(shù)據(jù)的精確性評價(jià)結(jié)果 （%）

2.2.2 環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)與傳統(tǒng)方法的交叉情況

檢測出的浮游藻類中有9個(gè)屬是由eDNA和顯微鏡直接觀察法共同檢測出來的，有34屬和15屬分別由eDNA和顯微鏡直接觀察法單獨(dú)檢測出。通過兩種方法共同檢測到的科有色球藻科（Chroococcaceae）、念珠藻科（Nostocaceae）、假魚腥藻科（Pseudanabaenaceae）、柵藻科（Sc-enedesmaceae）、水網(wǎng)藻科（Hydrodictyaceae）、小球藻科（Chlorellaceae）、雙星藻科（Zygnemataceae）、圓篩藻科（Cosscinodiscaceae）、舟形藻科（Naviculaceae）、異極藻科（Gomphonemaceae）、多甲藻科（Peridiniaceae）、隱鞭藻科（Cryptomonadaceae）、裸藻科，占顯微鑒定計(jì)數(shù)法的72.2%（圖5a）。共同檢測到的屬有假魚腥藻屬、微囊藻屬、席藻屬、柵藻屬，小環(huán)藻屬、異極藻屬、多甲藻屬、隱藻屬、裸藻屬，占顯微鑒定計(jì)數(shù)法的37.5%（圖5b）。

圖5 通過顯微鑒定計(jì)數(shù)法與eDNA宏條形碼技術(shù)監(jiān)測的浮游藻類科（a）、屬（b）交叉情況

2.3 柴河各位點(diǎn)浮游藻類多樣性分析

α多樣性指數(shù)（Alpha Diversity）常用于衡量樣品內(nèi)的生物群落多樣性。其中Pielou均勻度指數(shù)與物種累積數(shù)越大，表明樣本的生物種類越多，豐富度越高；Shannon指數(shù)綜合考慮物種數(shù)及物種頻度分布的均勻性，其值越高，說明群落多樣性越高，物種分布越均勻?；?8S V9及16S V3引物的宏條形碼測序數(shù)據(jù)所注釋的OTUs及其序列數(shù)，分析使用R語言的R studio操作界面加載vegan包后進(jìn)行計(jì)算，得到各樣品中的生物群落多樣性指數(shù)見表2。C3點(diǎn)位樣品的Shannon指數(shù)、Pielou均勻度指數(shù)都顯著高于C1和C2點(diǎn)位樣品，C3點(diǎn)位生物多樣性顯著高于C1和C2。C2點(diǎn)位樣品物種累計(jì)數(shù)更高，說明點(diǎn)位三群落均勻度更高，物種相較于一、二點(diǎn)位更豐富（表3）。生物多樣性指數(shù)結(jié)果與起初設(shè)想的景觀差異有些許出入，但與采樣時(shí)所觀察的水質(zhì)理化因素密切相關(guān)。

表3 Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)

2.4 基于浮游植物多樣性指數(shù)的水質(zhì)生物學(xué)評價(jià)

通過常用的浮游藻類評價(jià)水體水質(zhì)的方法[21]，根據(jù)分子生物學(xué)方法得到的浮游植物多樣性指數(shù)，柴河Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H'）對源頭評價(jià)為中污染，柴河水庫為中污染，柴河主河道為輕污染，Pielou均勻度指數(shù)（J）對源頭評價(jià)為中污染，柴河水庫為中污染，柴河主河道為輕污染（表4）。

表4 柴河水質(zhì)生物學(xué)評價(jià)結(jié)果

3 討論

3.1 環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)表征柴河浮游藻類多樣性

基于環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)在柴河共鑒定出9門25目33科43屬浮游藻類單元。水庫上游優(yōu)勢藻屬為衣藻屬，水庫段為假魚腥藻屬，水庫下游為菱形藻屬。這一監(jiān)測結(jié)果與顯微鑒定計(jì)數(shù)法接近，eDNA宏條形碼技術(shù)在科、屬水平鑒定的浮游植物種類分別占顯微鑒定計(jì)數(shù)法的72.2%，37.5%。資料顯示柴河歷史共出現(xiàn)67屬浮游藻類[22]，eDNA宏條形碼監(jiān)測技術(shù)方法與歷史記錄的浮游植物重合度高，極大程度地貼合了柴河浮游藻類的狀態(tài)。對水生生物群落結(jié)構(gòu)沿城市化發(fā)展進(jìn)程的響應(yīng)做了傳統(tǒng)方法以及eDNA方法監(jiān)測，發(fā)現(xiàn)eDNA方法比傳統(tǒng)方法更加準(zhǔn)確，且eDNA方法與水質(zhì)關(guān)系更緊密[23]。運(yùn)用分子生物學(xué)方法可以得到描述群落多樣性的物種豐富度和均勻度指數(shù)，并將其運(yùn)用于水質(zhì)生物學(xué)評估[24]。

3.2 柴河不同點(diǎn)位浮游藻類生物多樣性差異

水庫上游浮游藻類Shannon-Wiener指數(shù)為1.426，Pielou均勻度指數(shù)為0.406，生物學(xué)水質(zhì)評價(jià)結(jié)果為中污染。結(jié)合現(xiàn)場采樣時(shí)對取樣點(diǎn)周邊環(huán)境記錄觀察發(fā)現(xiàn)，該采樣點(diǎn)為天然河段，采樣點(diǎn)周邊沒有明顯污染源，河水渾濁，水體流速快，河道中幾乎沒有沉水植物，對水質(zhì)凈化能力差。柴河水庫浮游藻類Shannon-Wiener指數(shù)為1.564，Pielou均勻度指數(shù)為0.452，水庫內(nèi)假魚腥藻屬占絕對優(yōu)勢，生物學(xué)水質(zhì)評價(jià)結(jié)果為中污染。水庫下游位于段七村旁主河道，浮游藻類Shannon-Wiener指數(shù)為2.358，Pielou均勻度指數(shù)為0.692，水質(zhì)生物學(xué)評價(jià)結(jié)果為輕污染。采樣時(shí)水庫分水閘沒有放水，水庫水對點(diǎn)位三水樣影響不大，且河道內(nèi)有大量沉水植物，起到了凈化水質(zhì)的作用，是水庫下游浮游藻類生物多樣性優(yōu)于前兩個(gè)點(diǎn)位的原因。

4 結(jié)論與展望

環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)在柴河浮游藻類監(jiān)測物種識(shí)別方面與顯微鑒定計(jì)數(shù)法具有一致性。兩種方法識(shí)別出的優(yōu)勢藻屬相同?；诃h(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)的浮游藻類監(jiān)測可反映不同河段水質(zhì)差異。作為一種新方法，eDNA宏條形碼技術(shù)可監(jiān)測評估柴河浮游藻類多樣性，為柴河水生態(tài)健康評估和保護(hù)提供依據(jù)。

未來，還要進(jìn)一步完善統(tǒng)一環(huán)境DNA的操作流程，并完善本土物種DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，使測序數(shù)據(jù)的可重復(fù)性、準(zhǔn)確性提升。環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)在監(jiān)測浮游藻類多樣性及其相關(guān)工作具有較高可靠性，有望提升流域內(nèi)水生藻類監(jiān)測工作的水平。