楊 尚，宋興亞，趙 鵬，呂穎賢，于 翔，袁 穎，黃永震，朱緒偉*

（1.河南省蠶業(yè)科學(xué)研究院，河南 鄭州 450000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物科技學(xué)院；3.河南省農(nóng)學(xué)會；4.河南省動物衛(wèi)生監(jiān)督所）

家蠶又名桑蠶，是一種具有極高經(jīng)濟(jì)價值的鱗翅目昆蟲，不僅用于養(yǎng)蠶業(yè)，還用于許多科學(xué)領(lǐng)域。從農(nóng)耕文明的養(yǎng)蠶繅絲到工業(yè)文明的輕紡工業(yè)，家蠶一直扮演著重要角色。在我國悠久的養(yǎng)蠶歷史中，不同地區(qū)因地制宜，飼養(yǎng)適應(yīng)當(dāng)?shù)貤l件的家蠶品種。自然條件和人為干預(yù)的選擇使得分布在不同地區(qū)家蠶的遺傳資源更加復(fù)雜化和多樣化，這為選育工作提供了豐富的原始資料。對家蠶品種選育方法的改進(jìn)可以提高養(yǎng)蠶的生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效益，從而推動整個家蠶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 家蠶選育的必要性

家蠶養(yǎng)殖技術(shù)起源于中國，隨著“一帶一路”倡議在國際上被廣泛認(rèn)同，南亞、東南亞及非洲等地的一些國家對蠶絲的熱情格外高漲［1］。豐富的土地資源和廉價的勞動力使得這些國家發(fā)展桑蠶產(chǎn)業(yè)有著得天獨厚的優(yōu)勢。印度的蠶絲生產(chǎn)量已經(jīng)緊隨中國之后，位居世界第二，而巴西雖然產(chǎn)業(yè)規(guī)模小，但能生產(chǎn)世界最優(yōu)質(zhì)的生絲，成為一些世界奢侈品的原料專供地［2］。這些國家蠶桑業(yè)的發(fā)展使得我國蠶桑業(yè)遭受極大的考驗，發(fā)展環(huán)境不容樂觀。加快產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型和品種培育便是提高我國蠶桑產(chǎn)品國際競爭力的出路。因此，培育出“體質(zhì)強健、多抗好養(yǎng)、優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)、繁育能力強”的優(yōu)質(zhì)蠶種勢在必行。

2 家蠶育種基本思路

2.1 確定合理的育種目標(biāo)

育種目標(biāo)的確定是為了讓動物生產(chǎn)獲得更大的經(jīng)濟(jì)效益，這是育種工作中最為重要的決策。目標(biāo)的偏離或是不合理，會導(dǎo)致動物世代間的遺傳進(jìn)展極大降低甚至背道相馳。因此，合理的育種目標(biāo)可以為育種計劃的制定指明方向，讓育種工作少走彎路。

確定合理的育種目標(biāo)需要綜合多方面因素全面考慮，主要需要包括以下要素：

2.1.1 市場需求

動物生產(chǎn)的最終目的都是為人類提供服務(wù)，這決定了家蠶育種也必須以市場需求為出發(fā)點，明確在育種中應(yīng)該提升或改變哪些性狀。綜合考慮家蠶和蠶絲的相關(guān)性狀來順應(yīng)市場需求，這樣的育種工作才有意義。但同時因為育種的效果存在滯后性，即育種群的遺傳進(jìn)展要經(jīng)過雜交繁育的代代傳遞，并且世代之間取得的遺傳進(jìn)展有限，同時我國的家蠶良種繁育采用嚴(yán)格的三級繁育、四級制種制度，一個優(yōu)良家蠶品種從理論育成到實際推廣，需要幾年時間。所以在制定育種目標(biāo)的時候不能只簡單地看到當(dāng)下的市場需求，必須要對市場做出一定的預(yù)測，預(yù)測短期、中期、長期的市場需求。

2.1.2 育種素材

預(yù)測市場需求后，育種工作的開展已經(jīng)有了方向，但要實際開展，必須要有物質(zhì)條件——育種素材，有滿足條件的育種素材才可以繼續(xù)進(jìn)行實際的育種工作。因此，必須充分了解現(xiàn)有的育種群，包括核心群數(shù)量、群體結(jié)構(gòu)、性狀均值、遺傳參數(shù)、近交系數(shù)和群體之間的配合力等等。然后再根據(jù)這些育種群的情況，來選擇符合育種目標(biāo)的育種群進(jìn)行雜交，標(biāo)準(zhǔn)品種不能滿足需要的時候可以引進(jìn)地方品種血統(tǒng)。

2.2 選擇育種素材

根據(jù)育種目標(biāo)選定改良的性狀，選出符合條件的純種群體，如育成帶有對生產(chǎn)影響大的家蠶疾病抗性基因的蠶種、某些產(chǎn)品對蠶絲品質(zhì)有更高的要求、部分地區(qū)受氟污染影響嚴(yán)重需要選育出耐氟品種等等。當(dāng)前主要通過多元雜交的方式進(jìn)行育種，這就要選擇帶有不同突出性狀的種群作為父本和母本，從而把雙親的性狀綜合到新品種身上。

2.3 預(yù)測育種效果

我國家蠶品種資源豐富，僅根據(jù)育種目標(biāo)初步篩選出的育種群，可能會有很多群體進(jìn)入備選名單。如果直接開展雜交試驗，結(jié)果不盡人意，就會耗費大量人力物力和時間，因此在進(jìn)行雜交之前，需要對不同組合的雜交效果進(jìn)行大致估計，以此篩選出成功率較高、雜交效果好的組合進(jìn)行雜交試驗。

長期以來人們一直在探索可以準(zhǔn)確預(yù)測出雜交效果的方法，現(xiàn)在被廣泛應(yīng)用的方法主要有兩種：一是遺傳距離法；二是配合力預(yù)測法。遺傳距離法利用基因的相對距離來反映基因交換的概率，但其只能估計群體間的差異程度，對單獨性狀的生產(chǎn)性能無法準(zhǔn)確預(yù)測。之前有研究通過DNA 多態(tài)性遺傳距離來預(yù)測雜交效果，結(jié)果顯示以DNA 多態(tài)性遺傳距離篩選出的雜交組合能夠獲得更優(yōu)的生產(chǎn)性能［3］。配合力預(yù)測法目前發(fā)展較為成熟，在生產(chǎn)實踐中廣泛應(yīng)用。在其他動物的研究中有將配合力預(yù)測放在基因組水平上的報道［4］，可以在早期選種節(jié)約時間，提高選擇效率，目前在家蠶中尚未見有此研究。

2.4 新品系選育

根據(jù)確定好的育種目標(biāo)和雜交組合，采用雜交的方式，再對子代進(jìn)行系統(tǒng)選擇，一般雜交進(jìn)行到第3、4代后，換為同蛾區(qū)交配的方式，即互為全同胞的雌雄個體之間交配，可以比較容易地得到更加穩(wěn)定的遺傳性狀。

3 育種技術(shù)進(jìn)展

20世紀(jì)以來，連續(xù)個體選擇法和系統(tǒng)選擇法的出現(xiàn)，使得家蠶育種取得兩次飛躍性的進(jìn)步［5］，也將家蠶育種推向了一個高峰。隨著時間的遷移，傳統(tǒng)育種方法的局限性慢慢顯露出來：有限的遺傳資源在漫長的時間里幾乎被發(fā)掘完全。

但隨著技術(shù)的快速進(jìn)步，分子生物學(xué)等領(lǐng)域取得許多技術(shù)創(chuàng)新和技術(shù)突破，并被迅速應(yīng)用在動物育種上，讓育種工作可以在基因水平挖掘品種的潛力，為育種工作的開展注入新的活力［6］。

3.1 物理誘變制造育種素材

物理誘變是制造基因突變的有效手段，但由于其誘變方向的不確定性和生物安全問題，物理誘變在動物育種中的應(yīng)用不如在植物和微生物中的廣泛。誘變方向的不確定性使得誘變育種在動物育種上的應(yīng)用極大受限，原因是動物相較于植物和微生物而言，存在繁殖力低、世代間隔長、培育成本高等特點。家蠶作為昆蟲，與其他動物相比，繁殖性能強且世代間隔短，因此，20 世紀(jì)末一些科研院所應(yīng)用物理誘變的方法來獲取新的家蠶育種材料。

安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所和中國科學(xué)院等離子體物理所聯(lián)合開展低能氮離子（N+）對家蠶的誘變育種研究：將N+注入家蠶雌蛹及卵中，誘發(fā)基因突變，隨后在獲得的變異群體中選擇表現(xiàn)優(yōu)于對照組，即獲得有益突變的個體，作為育種素材，用以培育新的優(yōu)良品種［7］。山東蠶業(yè)科學(xué)研究所育成的“C66”和“煙6”以及遼寧蠶業(yè)科學(xué)研究所選育的“多絲3 號”都是采用激光照射處理蠶卵或蠶蛹獲得的柞蠶新品種［8］，也可參考用在家蠶的誘變育種中。

3.2 基因組技術(shù)挖掘育種潛力

隨著基因組技術(shù)的發(fā)展，我國在1996 年提出家蠶基因組計劃，在2004年公布了家蠶基因組序列草稿，隨后以西南大學(xué)為主的跨國研究團(tuán)隊于2008年在此基礎(chǔ)上完成了家蠶基因組精細(xì)圖譜，將家蠶全長cDNA序列整合成長度為432Mb、包含14 623 個基因的完整基因組序列、次年以29 種家蠶和11 種野生蠶為材料進(jìn)行了全基因組重測序，鑒定了基因組多態(tài)性，構(gòu)建了單堿基對解析的高精度家蠶遺傳變異圖。有關(guān)專家基于重測序數(shù)據(jù)構(gòu)建了第1個針對家蠶的CNV圖譜，并在家蠶基因組中共鑒定出319個CNVs。這些研究在家蠶基因組中篩選出了大量穩(wěn)定存在的SNPs 和SVs 等遺傳突變，提出了許多與家蠶的生長發(fā)育及經(jīng)濟(jì)性狀等關(guān)聯(lián)的候選基因，可作為家蠶分子育種的分子標(biāo)記，揭示家蠶雜交育種機理的同時，為廣泛開展分子育種工作打下了基礎(chǔ)。

3.3 基因編輯拓寬育種道路

越來越多物種基因組的公布，基因組編輯也應(yīng)運而生。ZFN、TALEN 等基因核酸酶的發(fā)現(xiàn)，還有被稱為“基因魔剪”的CRISPR使得基因編輯技術(shù)在世界范圍內(nèi)引起空前關(guān)注。

3.3.1 依賴ZFNs的基因組編輯

ZFN基因編輯技術(shù)適用于家蠶育種，將ZFN mRNA直接注射到胚胎中，可以省去構(gòu)建表達(dá)載體等步驟并且不需要酶的異位表達(dá)，極大地縮減了進(jìn)行家蠶基因編輯的時間。該技術(shù)另一個主要的優(yōu)勢在于ZFs 可以進(jìn)行自定義修飾，以構(gòu)建具有新的切割特異性的核酸酶。

3.3.2 依賴TALEN的基因組編輯

TALEN可以對基因進(jìn)行定點突變是基于細(xì)菌TAL效應(yīng)蛋白的作用，步驟包括TALEN 的組裝，離體TALEN RNA 的合成、胚胎顯微注射及突變檢測和PCR 分析。有關(guān)專家同樣用BmBLOS2 基因來表示TALEN 基因編輯的準(zhǔn)確性，結(jié)果證實TALEN有更高的成功率，該結(jié)論在其他動物中也得到了驗證，并且TALENs的設(shè)計和構(gòu)建非常簡單和快速。

3.3.3 依賴CRISPR-Cas的基因組編輯

在當(dāng)下各種基因編輯方法中，避免脫靶效應(yīng)至關(guān)重要。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)以其高效率、高保真性和簡單性，從而成為最受歡迎和最廣泛應(yīng)用的系統(tǒng)。CRISPR/Cas9通常由一個Cas9蛋白質(zhì)與單一引導(dǎo)RNA（gRNA），兩者形成一個蛋白質(zhì)-RNA 復(fù)合物，然后切割目標(biāo)。使用CRISPR-Cas 系統(tǒng)對家蠶的大多數(shù)研究都集中在使用CRISPR-Cas系統(tǒng)進(jìn)行功能基因分析，以闡明某些機制，或增強蠶對BmNPV 的抵抗力。

有關(guān)專家首次報道了使用CRISPR-Cas9 工具編輯家蠶基因組的成功操作：作者針對一個必需基因BmBlos2，它與人類Blos2 基因直系同源。設(shè)計了兩個sgRNA（23-bp）以誘導(dǎo)導(dǎo)致靶基因功能喪失的突變。由1 個sgRNA 和Cas9 核酸酶形成的每個復(fù)合物都被注射到前胚層胚胎階段。通常，幼蟲體被不透明，但當(dāng)BmBlos2 基因功能喪失，外皮變成半透明。這種效應(yīng)可以被視為突變體檢測的表型標(biāo)記。

有關(guān)專家在家蠶中利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)獲得去除家蠶核多角體病毒的轉(zhuǎn)基因個體，揭示了一種通過使用強大的CRISPR-Cas 方法抑制不同家蠶的有前景的策略。IGFLP已被證實在家蠶體內(nèi)參與成長過程，有關(guān)學(xué)者使用CRISPR/Cas9基因組編輯工具敲除IGFLP基因，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，IGFLP 基因的缺失導(dǎo)致卵巢更小，產(chǎn)卵數(shù)量更少。

為了讓家蠶能夠生產(chǎn)高性能纖維，有關(guān)專家使用CRISPR-Cas9 成功敲入了蠶基因組中的蜘蛛絲基因，為了避免干擾蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，將蜘蛛絲基因敲入BmFibL或BmFibH 的內(nèi)含子之一，證明了在家蠶中使用CRISPR-Cas9 在工業(yè)規(guī)模上獲得具有增強機械性能絲綢的可行性。

有關(guān)專家發(fā)現(xiàn)了兩個新的CRISPR 系統(tǒng)Saca 9 和AsCpf 1，這兩個系統(tǒng)也可以進(jìn)行高效的位點特異性基因組編輯，并構(gòu)建了完整的CRISPR系統(tǒng)，通過集成系統(tǒng)，在平均6.5個堿基對中就找到一個可定位的靶點，極大地便利了基因組水平開展的育種工作。

此外，CRISPR-Cas 還被用于家蠶中進(jìn)行表觀遺傳修飾。在這種情況下，有關(guān)專家探討甲基化對家蠶發(fā)育的影響。該研究為研究靶位點DNA 甲基化重要性提供了一種策略，具有重要意義。此外，他們的研究代表了探索DNA 甲基化狀態(tài)對家蠶及其他不同表型影響的起點。

家蠶育種在我國已經(jīng)有近千年的歷史，技術(shù)的飛快進(jìn)步和育種工作者的辛勤勞動給家蠶育種行業(yè)注入了源源不斷的動力。育種工作從確定育種目標(biāo)到選擇育種素材、從預(yù)測育種效果到選育新品系，步步是關(guān)鍵。21世紀(jì)生物技術(shù)的飛速發(fā)展，從隨機突變到精確敲除、從單純的基因突變體制作到多樣化的基因組精確編輯，家蠶全基因組的公布和基因編輯工具的升級給家蠶的研究與育種帶來了變革性的影響，抓住機遇，家蠶育種將進(jìn)入全新的高速時代。