高心雨，葉 玲，曾廣豐，李 婷*

（1.深圳市深業(yè)航天食品與環(huán)境檢測(cè)科技有限公司，廣東 深圳 518040；2.廣州檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證集團(tuán)有限公司 國(guó)家加工食品質(zhì)量檢驗(yàn)中心（廣東），廣東 廣州 511447；3.廣州海關(guān)技術(shù)中心 廣東省動(dòng)植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510623）

桂皮是我國(guó)日常調(diào)味品中一種常見(jiàn)的原料，由樟科樟屬植物樹(shù)皮經(jīng)過(guò)晾曬或烘烤干燥后制得[1]，因?yàn)槠浜袚]發(fā)油、丁香酚、香豆素等易揮發(fā)性物質(zhì)，具有芳香氣味，因而常被用于復(fù)合調(diào)味料的制作或在烹飪中直接使用。其中，所含有的香豆素具有抗炎鎮(zhèn)痛的功效[2-3]，同時(shí)還在抗腫瘤藥物的開(kāi)發(fā)領(lǐng)域得到廣泛的關(guān)注[4]。近年來(lái)，也有研究表明，香豆素的合成衍生物和仿生香豆素類(lèi)似物對(duì)乳腺癌細(xì)胞有一定的抑制作用[5-7]。然而，也有相關(guān)研究表明，香豆素的代謝產(chǎn)物具有一定的毒性，可影響肝臟功能[8-9]。2017年世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)也將香豆素列為3類(lèi)致癌物。由于香豆素香味獨(dú)特，常被作為增味劑添加到食品中，容易出現(xiàn)違法添加及用量超標(biāo)的情況。因此，建立桂皮中香豆素的檢測(cè)方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，將有助于企業(yè)規(guī)避貿(mào)易壁壘的風(fēng)險(xiǎn)。

目前，國(guó)標(biāo)GB 5009.284—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的測(cè)定》建立了嬰幼兒配方食品、糕點(diǎn)、飲料、乳制品以及小麥粉中香蘭素及香豆素的相關(guān)測(cè)定方法，但天然香辛料中香豆素的測(cè)定相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及法律法規(guī)尚未建立，檢測(cè)方法的相關(guān)報(bào)道也較少。2021年11月30日，印度食品安全標(biāo)準(zhǔn)局（food safety standards authority of India，F(xiàn)SSAI）發(fā)布公告對(duì)進(jìn)口肉桂中的香豆素展開(kāi)檢驗(yàn)，要求所有進(jìn)口肉桂均需檢驗(yàn)香豆素含量，且香豆素含量不得超過(guò)0.3%。我國(guó)年均出口貿(mào)易數(shù)量逐年增加，都在215萬(wàn)t以上。由于印度是香料消費(fèi)大國(guó)，有不少企業(yè)從我國(guó)進(jìn)口桂皮。

目前，已報(bào)道的香豆素及其同系物的測(cè)定方法主要集中在高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）[10-13]、高效液相色譜-質(zhì)譜法（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）[14-17]和氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）[18-22]，而桂皮中香豆素的相關(guān)測(cè)定方法報(bào)道較少。對(duì)于大部分的化合物測(cè)定，高效液相色譜法選擇性較低，前處理凈化步驟復(fù)雜，且儀器檢出限較高[23]。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法和氣相色譜-質(zhì)譜法對(duì)目標(biāo)物的選擇性較高，但受基質(zhì)干擾明顯，可能會(huì)存在假陽(yáng)性的情況[24]。因此，本研究通過(guò)響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化桂皮中香豆素的提取條件，建立超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法（ultra performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF/MS）測(cè)定桂皮中香豆素的含量，并進(jìn)行方法學(xué)考察，以期為桂皮中香豆素及其同系物的測(cè)定提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桂皮：市售；香豆素和香豆素-d4（純度均≥98.5%）：天津阿爾塔科技有限公司；甲酸、乙腈、乙酸乙酯、甲醇（均為色譜級(jí)）：美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

API5600+質(zhì)譜儀：美國(guó)AB SCIEX公司；LC-30AD液相色譜儀：日本島津公司；Milli-Q Advantage A10超純水設(shè)備：法國(guó)默克密理博公司；1-14K高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)希格瑪公司；MultiReax渦旋振蕩器：德國(guó)Heidolph公司；KQ-800DB超聲波清洗儀：昆山超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

稱(chēng)取0.5 g桂皮樣品（打粉后過(guò)3號(hào)篩，50目）于50 mL離心管中，加入25 mL甲醇，渦旋混勻，于50 ℃水浴超聲提取25 min（超聲儀工作參數(shù)為功率480 W，頻率40 kHz）。然后置于離心機(jī)中以10 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液于50 mL比色管中。殘?jiān)?5 mL甲醇重復(fù)提取一次，10 000 r/min離心5 min，合并上清液，采用甲醇定容至50 mL。取上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，移取0.9 mL濾液加入0.1 mL的5 mg/L香豆素-d4（內(nèi)標(biāo)）溶液，混勻，采用UPLC-Q-TOF/MS測(cè)定香豆素含量。

1.3.2 UPLC-Q-TOF/MS分析條件

色譜條件：Waters BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，3.0 μm）；流動(dòng)相以乙腈為A相，0.1%甲酸水溶液為B相，流速0.4 mL/min；進(jìn)樣體積5 μL；柱溫35 ℃；梯度洗脫程序：0～5 min，20～90%A；5～7 min，90%A；5～7 min，90%A；7～7.5 min，90%～20%A；7.5～10 min：20%A。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧電離和大氣壓化學(xué)電離復(fù)合源，以正離子模式進(jìn)行掃描；一級(jí)飛行時(shí)間質(zhì)譜（time of flight mass spectrometry，TOF-MS）掃描質(zhì)量范圍為50～1 000 m/z；二級(jí)信息依賴(lài)型質(zhì)譜（information dependent acquisition mass spectrometry，IDA-MS）掃描準(zhǔn)確質(zhì)量范圍為50～1 000 m/z；校正液流速0.5 mL/min；氣簾氣為氮?dú)猓∟2），流速35 psi；離子源霧化氣N2流速50 psi；離子源加熱輔助氣N2流速50 psi；離子源溫度450 ℃；離子源電壓5 500 V；去簇電壓DP為90 V；碰撞能量為（30±10）eV；監(jiān)測(cè)模式：飛行時(shí)間結(jié)合信息依賴(lài)型掃描（TOF-IDA-MS）；每10個(gè)樣品自動(dòng)校正1次。

定性、定量：以母離子的精確質(zhì)量數(shù)及出峰時(shí)間進(jìn)行定性，另外兩對(duì)響應(yīng)較高的子離子的精確質(zhì)量數(shù)輔助定性。采用內(nèi)標(biāo)法定量。香豆素及香豆素-d4的具體離子參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 香豆素及香豆素-d4的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 Parameters of coumarin and coumarin-d4 analyzed by mass spectrometry

1.3.3 桂皮中香豆素提取條件優(yōu)化

單因素試驗(yàn)：以甲醇用量20 mL、超聲20 min、提取溫度30 ℃、重復(fù)提取2次為初始提取條件，依次考察提取溶劑（50%甲醇-水、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、水）、提取溶劑體積（10 mL、15 mL、20 mL、25 mL、30 mL）（合并兩次提取液后，定容至100 mL）、提取溫度（30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃）及提取時(shí)間（10 min、15 min、20 min、25 min、30 min）對(duì)香豆素響應(yīng)強(qiáng)度的影響。

響應(yīng)面試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以香豆素響應(yīng)強(qiáng)度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，甲醇用量（A）、提取時(shí)間（B）及提取溫度（C）為考察因素，采用Design Expert 8.0.6設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表2[23，25]。

表2 桂皮中香豆素提取條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface tests for optimization of extraction conditions of coumarin in cinnamon

1.3.4 方法學(xué)驗(yàn)證

按照桂皮樣品本底值附近的1、2、5倍水平，在樣品中添加不同質(zhì)量濃度的香豆素標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)前處理方法處理后，供儀器測(cè)定分析。通過(guò)平行試驗(yàn)測(cè)定回收率和計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。另外，以信噪比3倍和10倍為基準(zhǔn)，通過(guò)稀釋樣品液的方法測(cè)定方法檢出限（limit of detection，LOD）和方法定量限（limit of quantitation，LOQ）[26-29]。

1.3.5 實(shí)際樣品的檢測(cè)

使用優(yōu)化后的前處理參數(shù)和儀器參數(shù)對(duì)市售的10個(gè)隨機(jī)桂皮樣品進(jìn)行處理和測(cè)定，每個(gè)樣品重復(fù)6次平行試驗(yàn)。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016軟件繪圖；化合物的碎片信息使用Analyst TF 1.6軟件采集；采用Design Expert 8.0.6設(shè)計(jì)響應(yīng)曲面試驗(yàn)，并進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 香豆素提取條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取溶劑的選擇

由于實(shí)驗(yàn)前處理方式為直接提取，且一般桂皮中所含的香豆素本底含量較大，因此前處理?xiàng)l件的優(yōu)化，以香豆素的響應(yīng)強(qiáng)度代替回收率為指標(biāo)進(jìn)行考察。不同提取溶劑對(duì)香豆素響應(yīng)強(qiáng)度的影響見(jiàn)圖1。

圖1 不同提取溶劑對(duì)香豆素響應(yīng)強(qiáng)度的影響Fig.1 Effect of different extraction solvents on the response strength of coumarin

由圖1可知，甲醇提取的香豆素響應(yīng)強(qiáng)度最高，其次是50%甲醇-水和乙腈，而乙酸乙酯和水較低，可能是因?yàn)橐宜嵋阴O性較低，在提取香豆素的同時(shí)，提取了較多雜質(zhì)，造成了一定的基質(zhì)效應(yīng)，而水則可能因?yàn)闃O性較大，香豆素在水中溶解度相對(duì)其他溶劑較低[28]。最終選擇甲醇作為提取溶劑。

2.1.2 甲醇用量的確定

甲醇用量對(duì)香豆素響應(yīng)強(qiáng)度的影響見(jiàn)圖2。由圖2可知，香豆素的響應(yīng)強(qiáng)度隨甲醇用量的增大呈先升高后穩(wěn)定的趨勢(shì)。分析原因可能是，當(dāng)甲醇用量＜20 mL之前，由于甲醇較少，提取不充分，因此響應(yīng)強(qiáng)度較低；當(dāng)甲醇用量達(dá)到20 mL時(shí)，香豆素的響應(yīng)強(qiáng)度基本達(dá)到最佳值，用量繼續(xù)增加時(shí)，響應(yīng)強(qiáng)度增加不明顯。由于考慮到使用25 mL以上提取液提取兩次，需要定容至100 mL，不但溶劑消耗大，而且會(huì)降低方法整體靈敏度。綜合定容體積、使用溶劑量及方法檢出限考慮，最終選擇甲醇用量為20 mL。

圖2 甲醇用量對(duì)香豆素響應(yīng)強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of methanol dosage on the response strength of coumarin

2.1.3 提取時(shí)間的確定

雖然香豆素性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，不會(huì)因?yàn)槌晻r(shí)間過(guò)長(zhǎng)而造成分解，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)效率，增加檢驗(yàn)成本，因此，考察提取時(shí)間對(duì)香豆素響應(yīng)強(qiáng)度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)香豆素響應(yīng)強(qiáng)度的影響Fig.3 Effect of extraction time on the response strength of coumarin

由圖3可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，香豆素的響應(yīng)強(qiáng)度呈先升高后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。當(dāng)提取時(shí)間較短時(shí)，提取不充分，響應(yīng)強(qiáng)度低。但當(dāng)超聲時(shí)間＞20 min之后，響應(yīng)強(qiáng)度變化不明顯，說(shuō)明在超聲20 min，提取率基本能達(dá)到要求，最終選擇超聲時(shí)間為20 min。

2.1.4 提取溫度的確定

由于香豆素在加熱條件下不易揮發(fā)，因此可以通過(guò)加熱，加快提取速度，并且提高提取率。提取溫度對(duì)香豆素響應(yīng)強(qiáng)度的影響見(jiàn)圖4。由圖4可知，隨著提取溫度的升高，香豆素的響應(yīng)強(qiáng)度呈先升高后降低的趨勢(shì)，分析原因可能是隨著溫度的升高，提取速率增大，但溫度高于50 ℃之后，香豆素遭到一定的破壞，從而造成提取量損失，影響提取率。由于提取溫度為40 ℃和50 ℃時(shí)，香豆素的響應(yīng)強(qiáng)度差異不大，因此，選擇提取溫度為40 ℃。

圖4 提取溫度對(duì)香豆素響應(yīng)強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the response strength of coumarin

2.2 香豆素提取條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以香豆素響應(yīng)強(qiáng)度（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選擇甲醇用量（A）、提取時(shí)間（B）和提取溫度（C）為考察因素進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，結(jié)果與分析見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

采用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，得到回歸方程：Y=12 822+75.25A+475.25B＋1 775.5C+778.5AB-297AC+414.5BC+435.5A2-1 001.5B2+338C2。由表4可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說(shuō)明該模型中，香豆素響應(yīng)強(qiáng)度與其他變量之間對(duì)應(yīng)關(guān)系良好。決定系數(shù)R2為0.911 0，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj為0.796 5，說(shuō)明79.65%的試驗(yàn)與該模型符合，適用于大多數(shù)情況。由表4亦可知，一次項(xiàng)C對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），二次項(xiàng)B2對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），其他項(xiàng)對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface tests

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

采用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)模型進(jìn)行求解，得到香豆素的最優(yōu)提取條件為甲醇用量24.8 mL、提取時(shí)間23.9 min和提取溫度49.9℃，該模型預(yù)測(cè)的最大響應(yīng)強(qiáng)度為15813.7cps。為了方便實(shí)際操作，將提取條件修正為甲醇用量25 mL，提取時(shí)間25 min，提取溫度50 ℃。在此條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，香豆素的響應(yīng)強(qiáng)度實(shí)際值為15 774.4 cps，與預(yù)測(cè)值差異不大。最終確定香豆素的最優(yōu)提取條件為甲醇用量25 mL，提取時(shí)間25 min，提取溫度50 ℃。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

由于試驗(yàn)采用純甲醇提取的前處理方式，且沒(méi)有經(jīng)過(guò)凈化，因此提取液中可能會(huì)含有較多的雜質(zhì)，從而使結(jié)果受到基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）的影響。采用UPLC-QTOF/MS對(duì)多個(gè)桂皮樣品進(jìn)行測(cè)定，選擇香豆素含量相對(duì)較低的桂皮的提取液配制香豆素，繪制香豆素基質(zhì)曲線，回歸方程為Y=861.46X+52 551；采用甲醇配制香豆素，繪制香豆素標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=1 051.59X+85 240，將此基質(zhì)曲線的斜率K1與純甲醇配制的外標(biāo)曲線斜率K2作對(duì)比，以其比值作為ME，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，香豆素的ME值為81.9%，說(shuō)明基質(zhì)效應(yīng)明顯，抑制效果超過(guò)10%。因此，定量計(jì)算時(shí)，需要用基質(zhì)曲線或內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校正，但由于桂皮中不存在香豆素陰性樣品，因此同一基質(zhì)曲線對(duì)不同樣品進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果可能會(huì)有一定的偏差，操作也較繁瑣，因此最終使用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系及靈敏度

以香豆素外標(biāo)（香豆素）質(zhì)量濃度和內(nèi)標(biāo)（香豆素-d4）質(zhì)量濃度比值（X）為橫坐標(biāo)，外標(biāo)響應(yīng)強(qiáng)度和內(nèi)標(biāo)響應(yīng)強(qiáng)度比值（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行一次回歸方程擬合，所得線性方程為Y=2.237 8X-0.007 9，作為內(nèi)標(biāo)曲線（內(nèi)標(biāo)法）進(jìn)行定量，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 3，說(shuō)明曲線線性關(guān)系良好，能準(zhǔn)確定量。同時(shí)，按照儀器的3倍信噪比和10倍信噪比得到測(cè)定方法的檢出限（LOD）為0.3 mg/kg，定量限（LOQ）為1.0 mg/kg，說(shuō)明本方法整體的靈敏度能滿足一般樣品香豆素含量的測(cè)定要求。

2.4.2 方法的回收率及精密度

方法的回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果的RSD見(jiàn)表5。由表5可知，平均回收率為89.9%～99.9%，精密度試驗(yàn)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.58%～3.22%。根據(jù)最終試驗(yàn)結(jié)果可知，回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均能滿足一般樣品的檢測(cè)要求。

表5 回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of recovery rate and precision tests

2.5 桂皮樣品中香豆素的檢測(cè)

隨機(jī)選擇市售的10個(gè)桂皮樣品，采用最優(yōu)方法處理并測(cè)定其香豆素含量，結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知，桂皮樣品中的香豆素含量為20.2～661.0 mg/kg，對(duì)于不同含量的樣品，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均＜10%，說(shuō)明本方法可準(zhǔn)確測(cè)定桂皮中香豆素含量。

表6 桂皮樣品中香豆素含量的測(cè)定結(jié)果Table 6 Determination result of cinnamon content in cinnamon samples

3 結(jié)論

本研究采用甲醇對(duì)桂皮中的香豆素進(jìn)行超聲提取，通過(guò)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)得到桂皮中香豆素的最優(yōu)提取條件為甲醇用量25 mL、提取時(shí)間20 min、提取溫度50 ℃，重復(fù)提取兩次，合并提取液；采用穩(wěn)定同位素稀釋結(jié)合UPLC-Q-TOF/MS測(cè)定香豆素，使用香豆素-d4為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)的校正，香豆素質(zhì)量濃度在0.01～2.0 mg/L范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 3，平均回收率為89.9%～99.9%，精密度試驗(yàn)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.58%～3.22%，方法檢出限（LOD）為0.3 mg/kg，定量限（LOQ）為1.0 mg/kg，說(shuō)明該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高，回收率及精密度較好，可應(yīng)用于桂皮中香豆素含量的測(cè)定。