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      分散固相萃取-氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定沙拉醬中3種防腐劑

      2022-12-11 08:13:04劉志鵬黃敏興林繼欽楊李勝王小鵬高裕鋒陳其釗
      中國釀造 2022年11期
      關(guān)鍵詞:沙拉醬山梨酸渦旋

      劉志鵬,黃敏興,林繼欽,楊李勝,王小鵬,高裕鋒,陳其釗*

      (1.廣東省科學(xué)院生物與醫(yī)學(xué)工程研究所,廣東 廣州 510316;2.中國輕工業(yè)甘蔗制糖工程技術(shù)研究中心,廣東 廣州 510316)

      沙拉醬是一種西式調(diào)味沙司,在西方人的飲食生活中必不可少,主要應(yīng)用于沙拉、三明治等菜品中,在我國的消費(fèi)主要集中在大、中城市,消費(fèi)群體主要為年輕人,目前還有很大的市場空間[1-2]。傳統(tǒng)沙拉醬的主要原料是植物油、雞蛋、食醋,再加上調(diào)味料和香辛料等[3]。由于沙拉醬營養(yǎng)豐富、保質(zhì)期短,生產(chǎn)廠家為保證其能有較長保質(zhì)期,會加入防腐劑來抑制其中的微生物生長。其中,苯甲酸、山梨酸和脫氫乙酸是在沙拉醬中使用最廣泛的防腐劑,但過量的食用會影響人體對維生素和鈣的吸收,加重人體肝臟負(fù)擔(dān),并引起毒癥反應(yīng)或貧血和免疫功能下降[4-7]。GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定了上述3種防腐在沙拉醬中的最大使用量分別為1.0 g/kg、1.0 g/kg、0.5 g/kg[8]。

      現(xiàn)階段針對這3種防腐劑的檢測方法有高效液相色譜法(high-performance liquid chromatography,HPLC)[9-13]、氣相色譜法(gas chromatography,GC)[14-17]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)法[18-19]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)法[20-24]。目前,檢測食品中這3種防腐劑的的國標(biāo)方法為液相色譜法和氣相色譜法[25-26]。液相色譜法和氣相色譜法雖然前處理簡單,儀器維護(hù)成本低,但其靈敏度相對較低,定性能力一般,容易出現(xiàn)假陽性情況。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,這3種防腐劑若要實(shí)現(xiàn)同時(shí)測定,需要用不同的前處理方法和不同儀器設(shè)備,實(shí)驗(yàn)操作起來費(fèi)時(shí)費(fèi)力。氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(gas chromatogratriple quadrupole tandem mass spectrometry,GC-MS/MS)具有高準(zhǔn)確性、高效性、基質(zhì)干擾小的特點(diǎn),以及多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測的高靈敏度、高選擇性和對色譜峰形改善等優(yōu)點(diǎn),目前多用于高通量農(nóng)藥殘留的檢測[27]。國內(nèi)外對于使用氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測定食品中多種防腐劑的研究鮮有報(bào)道。

      本研究采用分散固相萃取(dispersive solid phase extraction,DSPE)結(jié)合氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)法同時(shí)測定沙拉醬中的3種防腐劑(山梨酸、脫氫乙酸、苯甲酸),對其前處理?xiàng)l件的提取方式、渦旋時(shí)間、萃取溶劑進(jìn)行優(yōu)化,以期建立一種前處理簡單,靈敏度高,抗干擾能力強(qiáng),能夠快速、準(zhǔn)確地同時(shí)檢測沙拉醬中山梨酸、脫氫乙酸、苯甲酸的方法。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      沙拉醬:市售;山梨酸、苯甲酸、脫氫乙酸(純度均>99%):廣東省計(jì)量科學(xué)研究院;乙酸乙酯、正己烷、乙醚、二氯甲烷)、石油醚(均為色譜純):上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?;七水合硫酸鋅(分析純):西隴科學(xué)股份有限公司;無水硫酸鎂(分析純):廣州化學(xué)試劑廠;C18(分析純):博納艾杰爾科技有限公司。

      1.2 儀器與設(shè)備

      TSQ9000三重四極桿氣質(zhì)聯(lián)用儀、Sorvall ST4 Plus高性能通用臺式離心機(jī):美國賽默飛世爾科技有限公司;ME204E電子天平:德國梅特勒-托利多集團(tuán);KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器:昆山市超聲儀器有限公司;UPC-I-60L型超純水機(jī):成都超純科技有限公司;MultiReax多位試管渦旋振蕩器:德國Heidolph公司;WS-150D型往復(fù)式搖床:德國Wiggens公司;HP-FFAP色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm):美國Agilent Technologies公司。

      1.3 方法

      1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

      混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備:分別準(zhǔn)確稱取0.025 0 g山梨酸、脫氫乙酸和苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),用乙酸乙酯溶解并定容至25 mL的容量瓶中,得到質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液,置于4 ℃條件下儲存。

      混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備:精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液100 μL,用乙酸乙酯定容至100 mL容量瓶中,得到質(zhì)量濃度為1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。然后用乙酸乙酯進(jìn)行逐級稀釋,制得質(zhì)量濃度分別為0.001 mg/L、0.005 mg/L、0.010 mg/L、0.050 mg/L、0.100 mg/L、0.500 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

      1.3.2 樣品的前處理

      準(zhǔn)確稱取樣品1 g(精確至0.000 1 g)置于50 mL離心管中,加入10 mL水、2.5 mL七水合硫酸鋅溶液和4 mL氫氧化鈉溶液,以轉(zhuǎn)速2 000 r/min渦旋10 min后加水定容至20 mL,于4 000 r/min離心5 min,準(zhǔn)確吸取10 mL上清液于50 mL離心管中,加入0.5 mL鹽酸溶液(1∶1)酸化后,加入5 mL乙酸乙酯渦旋2 min后,于4 000 r/min離心5 min,移取2 mL上清液于裝有分散固相萃取劑(C18和無水硫酸鎂各200 mg)的試管中渦旋1 min,取上清液過0.22 μm微孔濾膜,待測。

      1.3.3 氣相色譜-質(zhì)譜條件

      氣相色譜條件:HP-FFAP色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0 ℃,保持1 min,以20 ℃/min上升到230 ℃,保持5 min;載氣為高純氦氣(He)(純度≥99.999%);碰撞氣為氬氣(Ar)(純度≥99.999%);進(jìn)樣口溫度為250 ℃;色譜柱流量為1.2 mL/min;分流比為10∶1;進(jìn)樣量為1 μL。

      質(zhì)譜條件:離子源為電子電離源(electron ionization,EI);離子源溫度為300 ℃;傳輸線溫度為280 ℃;掃描方式為選擇反應(yīng)監(jiān)測(selected reaction monitoring,SRM)模式。3種防腐劑的保留時(shí)間、定性及定量監(jiān)測離子對和碰撞能量參數(shù)見表1。

      表1 3種防腐劑的保留時(shí)間、定性及定量離子對和碰撞能量Table 1 Retention time,qualitative and quantitative ion pair and collision energy of the 3 preservatives

      定性定量分析:采用保留時(shí)間結(jié)合離子對豐度比進(jìn)行定性分析。以目標(biāo)物(3種防腐劑)的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo),峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制防腐劑標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到其線性回歸方程進(jìn)行定量分析?;厥章视?jì)算公式如下:

      1.3.4 數(shù)據(jù)處理

      采用Excel 2019對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析,采用Origin 9.0制圖。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

      2.1.1 提取方式的選擇

      常規(guī)的提取方式有超聲、渦旋和振搖。用不含防腐劑的沙拉醬作為樣品,進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),3種提取方式均分別處理10 min,其中超聲處理的功率為1 500 W,渦旋振蕩器轉(zhuǎn)速設(shè)為2 000 r/min,往復(fù)式搖床振搖頻率為300 r/min,其余條件按照1.3.2前處理,考察3種提取方式(超聲、渦旋和振搖)對回收率的影響。提取方式對回收率的影響見圖1。由圖1可知,整體來看,采用渦旋提取方式,山梨酸、脫氫乙酸及苯甲酸的平均回收率較高,這3種防腐劑的平均回收率分別為89.6%、95.4%、104.2%。超聲與振搖的提取方式對提取效果的影響差別不大。因此,選擇渦旋提取方式。

      圖1 提取方式對回收率的影響Fig.1 Effect of extraction method on recovery rates

      2.1.2 渦旋時(shí)間的選擇

      采用渦旋提取方式進(jìn)行提取,考察渦旋時(shí)間分別為2 min、5 min、10 min、15 min、20 min、30 min對樣品回收率的影響。渦旋時(shí)間對回收率的影響見圖2。由圖2可知,隨著渦旋時(shí)間在2~10 min內(nèi)的延長,3種防腐劑的平均回收率呈明顯增加趨勢;當(dāng)渦旋時(shí)間>10 min后,平均回收率增加趨勢較為平緩。當(dāng)渦旋時(shí)間為10 min時(shí),山梨酸、脫氫乙酸及苯甲酸的提取率分別為91.2%、98.3%、101.0%。因此,選擇渦旋時(shí)間10 min。

      圖2 渦旋時(shí)間對回收率的影響Fig.2 Effect of vortex time on recovery rate

      2.1.3 萃取溶劑的選擇

      選擇正己烷、乙酸乙酯、石油醚、乙醚、二氯甲烷5種溶劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn),在其他條件不變的前提下,考察用不同萃取溶劑對回收率的影響。萃取溶劑對平均回收率的影響見圖3。由圖3可知,當(dāng)選擇乙酸乙酯作為萃取溶劑時(shí),3種防腐劑的平均回收率較高,提取效果最佳,山梨酸、脫氫乙酸、苯甲酸3種防腐劑的平均回收率分別為89.0%、96.2%、104.5%。因此,選擇乙酸乙酯作為萃取溶劑。

      圖3 萃取溶劑對回收率的影響Fig.3 Effect of extraction agents on recovery rate

      2.2 分散固相萃取劑的凈化效果

      沙拉醬是一種高脂肪食物,每100 g傳統(tǒng)沙拉醬脂肪含量在50 g以上[2]。因此,在凈化步驟中著重針對脂肪進(jìn)行除雜,選擇C18與無水硫酸鎂各200 mg組合成分散固相萃取劑,對萃取溶液進(jìn)行凈化,考察其凈化效果。加入分散固相萃取劑前后的樣品總離子流色譜圖見圖4。由圖4可知,加入分散固相萃取劑后,樣品總離子流色譜圖的背景干擾明顯要小于未經(jīng)凈化的樣品,整體基線也更加平穩(wěn)。實(shí)驗(yàn)過程中也未發(fā)現(xiàn)分散固相萃取劑對3種防腐劑的回收率有影響(3種防腐劑回收率均在85%~105%范圍內(nèi))。為了保護(hù)氣相系統(tǒng)的潔凈度和降低樣品背景的干擾,故選擇加入分散固相萃取劑作為凈化步驟。

      圖4 加入分散固相萃取劑前(A)、后(B)的樣品總離子流色譜圖Fig.4 Total ion chromatogram of the samples of before (A) and after (B) adding dispersant

      2.3 方法學(xué)考察

      2.3.1 方法的線性回歸方程、檢出限與定量限

      3種防腐劑的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表2。由表2可知,3種防腐劑在質(zhì)量濃度0.001~0.100mg/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R2≥0.999。在稱樣量為1.00 g時(shí)進(jìn)行低濃度加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),以目標(biāo)峰高等于3倍基線噪音為檢出限,目標(biāo)峰等于10倍基線噪音為定量限進(jìn)行計(jì)算,方法的檢出限為0.002~0.010 mg/kg;方法的定量限為0.006~0.030 mg/kg。3種防腐劑的檢出限與定量限均遠(yuǎn)低于國標(biāo)方法,說明本方法具有一定優(yōu)越性。

      表2 3種防腐劑的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear regression equation,correlation coefficient,detection limit and quantification limit of 3 preservatives

      2.3.2 加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)

      以不含防腐劑的沙拉醬作為空白樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn),分別準(zhǔn)確加入0.05 mg/kg、0.10 mg/kg、0.50 mg/kg 3個水平濃度的3種防腐劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照方法1.3.2進(jìn)行前處理,每個添加水平做6次重復(fù)試驗(yàn),計(jì)算其加標(biāo)回收率、精密度試驗(yàn)結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard de viation,RSD),結(jié)果見表3。由表3可知,空白沙拉醬中3種防腐劑不同加標(biāo)水平下的平均回收率和RSD范圍分別為88.6%~104.8%、2.0%~5.3%,符合GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》要求。結(jié)果表明,本方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度,能滿足日常檢測的要求。

      表3 3種防腐劑的加標(biāo)回收率及精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of spiked recovery and precision tests of 3 preservatives

      2.4 實(shí)際樣品檢測中該方法與國標(biāo)方法的比較

      將該方法運(yùn)用到從市場隨機(jī)購買回來的38份樣品中進(jìn)行檢測。結(jié)合GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》判定,樣品的實(shí)際檢出情況為:山梨酸檢出率為63.1%;脫氫乙酸的檢出率為8.8%;苯甲酸檢出率為21.1%,沒有不合格樣品。選取3種防腐劑均為陽性的一份樣品,采用本方法與國標(biāo)方法進(jìn)行比較,試驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4可知,采用本方法檢測的山梨酸、脫氫乙酸、苯甲酸的實(shí)測值分別為0.135 g/kg、0.127 g/kg、0.158 g/kg,采用國標(biāo)方法檢測的這3種防腐劑的實(shí)測值分別為0.129 g/kg、0.122 g/kg、0.147 g/kg,說明本方法與國標(biāo)方法的試驗(yàn)結(jié)果無明顯差異,采用本方法檢測的這3種防腐劑的RSD分別為3.4%、2.9%、3.7%,國標(biāo)方法檢測的這3種防腐劑的RSD分別為4.1%、2.8%、4.5%,該方法的RSD在一定程度上優(yōu)于國標(biāo)方法。該方法的檢測效率具有一定優(yōu)勢,僅需要一次簡單的前處理,一臺儀器,便能同時(shí)準(zhǔn)確地對3種防腐劑進(jìn)行定量。

      表4 本方法與國標(biāo)方法檢測結(jié)果的比較(n=6)Table 4 Comparison of determination results of the method with national standard method (n=6)

      3 結(jié)論

      本研究采用分散固相萃取結(jié)合氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法對沙拉醬中的山梨酸、脫氫乙酸和苯甲酸進(jìn)行測定。針對沙拉醬是一種高脂肪食物,最佳前處理?xiàng)l件為加入10 mL水、2.5 mL硫酸鋅溶液和4 mL氫氧化鈉溶液渦旋處理10 min后加水定容至20 mL,于4 000 r/min離心5 min,準(zhǔn)確吸取10 mL上清液于50 mL離心管中,加入0.5 mL鹽酸溶液(1∶1)酸化,加入乙酸乙酯渦旋2 min后4 000 r/min離心5 min,移取2 mL上清液于裝有分散固相萃取劑(C18和無水硫酸鎂各200 mg)的試管中渦旋1 min,取上清液過0.22 μm微孔濾膜,待測。在此優(yōu)化前處理?xiàng)l件下,3種防腐劑在質(zhì)量濃度0.001~0.100 mg/L線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)R2均>0.999,平均加標(biāo)回收率為88.6%~104.8%,精密度試驗(yàn)結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.0%~5.3%,方法檢出限為0.002~0.010 mg/kg,定量限為0.006~0.030 mg/kg。該方法對比國標(biāo)方法,靈敏度更高、定性準(zhǔn)確、所需儀器更單一、抗干擾能力更強(qiáng),可以滿足沙拉醬中多種防腐劑的檢測需求。

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