周珊珊，蔣永生，鎮(zhèn)小蔓，焦禮詩，徐開達，梁 君，李 哲，周永東

（浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江省海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用技術研究重點實驗室，浙江舟山 316021）

曼氏無針烏賊Sepiella maindroni，屬軟體動物門Mollosca、頭足綱Cephalopoda、十腕總目Decapodiformes、烏賊目Sepioidea、烏賊科Sepiidae，俗稱墨魚，屬于中型烏賊，曾是我國“四大海產(chǎn)”之一，主要分布在中國浙江和福建沿海。由于過度捕撈和生境破壞等，嚴重破壞了近海烏賊的種質資源，導致曼氏無針烏賊產(chǎn)量連續(xù)下降，已無法形成漁汛。為恢復曼氏無針烏賊資源量，浙江、福建等地區(qū)開展了曼氏無針烏賊增殖放流工作，取得了一定的資源修復成效[1-4]。目前，曼氏無針烏賊的增殖放流主要是放流烏賊受精卵，但是附著的烏賊卵易被海水沖散或因環(huán)境因素而不能完全孵化[3,5-6]。放流懷卵親體的方式則可使烏賊卵附著于自然生長基，從而提高烏賊增殖放流效果。

運輸密度是影響黑鯛幼魚Acanthopagrus schlegelii、尖吻鱸Lates calcarifer、黑尾近紅鲌Ancherythroculter nigrocauda等魚類死亡率的因素之一，且對乳酸、糖原、酶活等具有一定影響，乳酸、糖原、酶活等生理生化指標是反應機體能量代謝和應激情況的重要指標[7-9]。且谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）活力、超氧化物歧化酶（SOD）與硫化物、亞硝酸氮對曼氏無針烏賊的脅迫損傷密切相關[10-11]。烏賊親體在放流運輸過程密度過高易噴墨而造成親體大量死亡，運輸密度過低則增加了放流成本。目前，國內(nèi)外學者的研究主要集中在烏賊生態(tài)學[12-13]、人工繁育[14-16]、生長發(fā)育[17-19]、資源分布[20]、分子生物學[21-22]等方面，但仍缺乏烏賊運輸過程中密度對曼氏無針烏賊親體死亡率及生存狀態(tài)影響的相關研究。因此，本研究選用乳酸、糖原含量及谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（GOT）、堿性磷酸酶（ALP）、超氧化物歧化酶（SOD）活性為指標開展了不同運輸密度下烏賊親體死亡及機體情況的研究，查明運輸密度對烏賊噴墨行為及生存狀態(tài)的影響，分析高密度下曼氏無針烏賊親體的死亡原因，量化不同密度下烏賊親體的應激程度，為曼氏無針烏賊親體的增殖放流運輸過程提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及馴化

實驗所用曼氏無針烏賊親體（以下簡稱烏賊）由浙江省海洋水產(chǎn)研究所試驗場培育，每天定時06：00、17：00 投喂冰鮮飼料，飼喂后換水，用氧氣泵不斷向水中充氧，保持水中DO＞5.5 mg·L-1，鹽度為27～28，pH 7.8～7.9，光照周期為12 L：12 D。

1.2 實驗方法

根據(jù)預實驗初步篩選后，本實驗共設置6 個處理組，密度組梯度分別為0.2、0.6、1.2、1.8、2.4、3 ind.·L-1，每個密度組設置3 個平行。實驗前將烏賊從暫養(yǎng)池中放到容積為8 L 的塑料桶中，將塑料桶放在烏賊放流船上并加以固定，實驗跟隨烏賊放流船運送至東極，模擬烏賊親體放流運輸過程（船速為20.742 4 km·h-1，風浪4～5 級），實驗水體5 L，實驗時間5 h。實驗結束后將烏賊置于冰上，快速解剖取肝臟樣品，每個密度組取1 只烏賊樣品，烏賊全部死亡則停止實驗并立即取樣。各組間烏賊的平均胴背長為8.3～8.7 cm，胴背長各組間無顯著性差異（P＞0.05）。實驗平均水溫約為25 ℃，持續(xù)充氣DO＞5.5 mg·L-1，海水鹽度、pH 同暫養(yǎng)池，實驗過程不投餌。

實驗過程中觀察到烏賊浮于表面，鰭擺動停止，多次觸碰無反應判定為死亡，記錄對應時間并撈出。烏賊在虛弱時可能會噴墨，為減少墨汁產(chǎn)生的干擾，在烏賊噴墨后輕柔換水。烏賊經(jīng)丁香酚快速麻醉后，測量體長和體質量（精確到0.1 cm）。隨后置于冰上取樣，取肝臟液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱。南京建成生物工程研究所試劑盒測定肝臟組織的乳酸、糖原含量及谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、超氧化物歧化酶（SOD）活性。

1.3 數(shù)據(jù)分析處理

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計和分析采用SPSS 17.0 進行，并以平均數(shù)±標準誤（mean±SE）表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）對烏賊胴背長、死亡率、糖原、乳酸、酶活等數(shù)據(jù)差異進行分析，以P＜0.05 作為差異顯著標準。

2 結果

2.1 不同運輸密度下烏賊的行為及死亡率

低密度運輸時烏賊一般在水底靜止或是緩慢游動（圖1a），高密度運輸情況下烏賊產(chǎn)生了一定的適應性行為（圖1b），在運輸密度達到1.2 ind.·L-1后烏賊就開始在水面附近活動，當運輸密度繼續(xù)增至2.4 ind.·L-1后烏賊大多在水面活動且出現(xiàn)個別烏賊跳出塑料桶的現(xiàn)象。烏賊在受到環(huán)境脅迫時可能會噴出墨汁，在1次或多次噴墨后死亡，最終浮于水面。

圖1 不同密度下烏賊狀態(tài)Fig.1 Behavior of S.maindroni in different densties

如圖2 所示，隨著烏賊運輸時間增加，累計死亡率增加。烏賊在0.2、0.6 ind.·L-1密度下運輸死亡較少，可以較長時間運輸。在1.2、1.8 ind.·L-1密度下運輸烏賊的死亡時間主要出現(xiàn)在運輸2.5 h 后，2.4、3 ind.·L-1密度下運輸2.5 h 后累計死亡率趨近于50%。密度越低出現(xiàn)死亡的時間越晚，2.4、3 ind.·L-1密度下最早在0.5 h 內(nèi)出現(xiàn)死亡。運輸時間達到1.5 h 后2.4、3 ind.·L-1死亡率顯著高于其他處理組（P＜0.05），2.5 h 后1.2、1.8 ind·L-1死亡率顯著高于0.2 ind.·L-1處理組（P＜0.05），4.5 h 后1.8、2.4、3 ind.·L-1死亡率顯著高于0.2 ind·L-1處理組（P＜0.05）。烏賊不宜進行高密度運輸，2.4、3 ind.·L-1的密度運輸不宜超過2.5 h。

圖2 烏賊在運輸期間的死亡情況Fig.2 Deaths of S.maindroni at each transport time period

運輸密度對烏賊死亡率的影響如圖3 所示。烏賊的死亡數(shù)量隨著運輸密度的增加而上升，2.4、3 ind.·L-1處理組死亡率較高，顯著高于其他處理組（P＜0.05）。1.8、1.2 ind.·L-1處理組死亡率顯著高于0.6 和0.2 ind.·L-1處理組（P＜0.05）。

圖3 不同運輸密度下烏賊死亡率Fig.3 Death rates of S.maindroni in different densities

2.2 不同運輸密度下烏賊糖原和乳酸含量變化

如圖4 所示，不同運輸密度影響烏賊肝臟乳酸含量，隨著運輸密度增加肝臟乳酸含量下降，其中0.6 ind.·L-1處理組乳酸含量最高為586.64 μmol·gprot-1，顯著高于其他處理組（P＜0.05）；0.2 和3 ind.·L-1處理組顯著高于1.2、1.8、2.4 ind.·L-1處理組（P＜0.05）。

圖4 不同密度下烏賊（肝臟）乳酸含量Fig.4 Lactic acid content of S.maindroni in different densities

如圖5 所示，運輸密度增加烏賊肝臟糖原含量升高，0.2 ind.·L-1處理組糖原含量最低為38.66 mg·gprot-1，顯著低于其它處理組（P＜0.05）；3 ind.·L-1處理組糖原含量最高為73.42 mg·gprot-1，顯著高于其他處理組（P＜0.05）；0.6 ind.·L-1處理組肝臟糖原略高于1.2、1.8、2.4 ind.·L-1處理組，但無顯著差異。

圖5 不同密度下烏賊（肝臟）糖原含量Fig.5 Glycogen content of S.maindroni in different densities

2.3 不同運輸密度下烏賊肝臟酶活的變化情況

如圖6 所示，隨著運輸密度的增加堿性磷酸酶（ALP）、超氧化物歧化酶（SOD）的酶活呈M 型分布。0.2、3 ind.·L-1處理組ALP 酶活最低，分別為47.15、47.43 IU·gprot-1，顯著低于其他處理組（P＜0.05）；1.2 ind.·L-1處理組ALP 酶活為51.82 IU·gprot-1，顯著低于0.6、1.8、2.4 ind.·L-1處理組（P＜0.05）。0.2 ind.·L-1處理組SOD 酶活最低，為10.44 IU·mgprot-1，顯著低于0.6、2.4、3 ind.·L-1處理組（P＜0.05）；0.6 和2.4 ind.·L-1處理組SOD 酶活最高，分別為12.26 和11.41 IU·mgprot-1，顯著高于其他處理組（P＜0.05）。

圖6 不同運輸密度下烏賊（肝臟）SOD、ALP 含量Fig.6 Enzymatic activity of S.maindroni in different densities

如圖7 所示，隨著烏賊的運輸密度的增加谷草轉氨酶（AST）的酶活呈先上升后下降再上升的趨勢。其中，0.2、2.4 ind.·L-1處理組AST 酶活分別為13.39、14.18 IU·gprot-1，顯著低于其他處理組（P＜0.05）；0.6 和3 ind.·L-1處理組AST 酶活最高，分別為18.52 和18.26 IU·gprot-1，顯著高于其它處理組（P＜0.05）。谷丙轉氨酶（ALT）酶活隨運輸密度的增加而上升。其中，0.2、0.6、1.2 ind.·L-1處理組ALT 酶活最低（3.30、3.18、3.21 IU·gprot-1），顯著低于2.4、3 ind.·L-1處理組（P＜0.05）；3 ind.·L-1處理組酶活最高（3.99 IU·gprot-1），顯著高于0.2、0.6、1.2、1.8 ind.·L-1處理組（P＜0.05）。

圖7 不同運輸密度下烏賊肝臟ALT、AST 含量Fig.7 Enzymatic activity of S.maindroni in different densities

3 討論

3.1 運輸密度對烏賊行為及死亡率的影響

運輸密度對水生生物在運輸過程中的生存狀態(tài)有重要影響，密度過高可能引起水質惡化導致魚體受損[23]。實驗發(fā)現(xiàn)曼氏無針烏賊在低密度運輸過程中會在水底緩慢游動，高密度時則會減少游動并漂浮在水面上，且高密度下烏賊很快會噴墨。烏賊噴墨后逐漸虛弱最終死亡，這與虎斑烏賊Sepia pharaonis噴墨后生存狀態(tài)變差類似[24]。運輸密度對烏賊死亡率有顯著影響，當運輸密度達到1.2 ind.·L-1時死亡率顯著上升，在2.4 ind.·L-1運輸密度下死亡率達到75%。對卵形鯧鲹Trachinotus ovatus[25]和真鯛Pagrus major[26]運輸脅迫的研究發(fā)現(xiàn)密度增加造成的水質惡化對魚類的存活有一定影響[25-26]。烏賊死亡率上升可能與水質惡化及水體生存空間擁擠導致的應激反應有關。

密度越低出現(xiàn)死亡的時間越晚，在0.2 ind.·L-1密度下烏賊5 h 內(nèi)未出現(xiàn)死亡，高密度（2.4、3 ind.·L-1）運輸下30 min 已出現(xiàn)少量烏賊死亡。因此，曼氏無針烏賊運輸時密度應不宜超過1.8 ind.·L-1且運輸時間不宜超過2 h，長時間的烏賊運輸應適當降低運輸密度。

3.2 運輸密度對烏賊糖原、乳酸含量的影響

糖原是動物體內(nèi)主要的供能物質，一般存在于肌肉和肝臟中。在應激脅迫中肝糖原相較于肌糖原的供能優(yōu)先級更高[27]。應激脅迫下魚類通過升高血糖含量來保障魚體能量供給[28]。在本研究中烏賊肝糖原含量上升可能是因為受到了運輸和密度的脅迫，機體通過減少活動等適應性反應來保持肝糖原穩(wěn)定，而3 ind.·L-1密度下烏賊糖原含量顯著高于其他組可能是由于烏賊肝臟組織受損，導致無法正常代謝糖原。

魚體缺氧情況下會通過糖酵解分解糖原產(chǎn)生能量并產(chǎn)生乳酸。水體溶氧含量低、魚體劇烈運動等都可能是魚體乳酸含量升高的因素[29]。在本研究中烏賊處于充氧狀態(tài)下，1.2、1.8、2.4 ind·L-1處理組的乳酸含量低于0.2、0.6 ind.L-1處理組可能是因為高密度條件下烏賊活動空間減少，烏賊活動能力減弱從而減少了乳酸堆積。3 ind.·L-1密度下乳酸處于較高水平，可能與此密度下烏賊受密度脅迫造成了缺氧或生存空間擠壓，部分個體浮于水面，水面較強的水流晃動增加了機體平衡所需的能量，從而導致了乳酸堆積。此外，當密度過高時，烏賊機體噴墨及高密度造成的水體污染可能造成了一定的機體損傷，從而引起肝臟組織的乳酸代謝紊亂。

3.3 運輸密度對烏賊酶活性的影響

谷丙轉氨酶（ALT）與谷草轉氨酶（AST）主要分布在肝細胞內(nèi)，肝細胞發(fā)生病變或壞死時ALT 和AST 酶活會升高，且升高的程度與肝細胞受損程度相一致，但當脅迫的程度繼續(xù)增強可能造成機體肝細胞死亡導致酶活下降[11]。本研究中，隨著烏賊運輸密度的增加，ALT、酶活逐漸上升，AST 酶活在1.2、1.8、2.4 ind.·L-1密度下有所下降，與肝臟乳酸變化有一定相關性，表明一定密度條件下烏賊減少活動，降低代謝等減小肝臟受脅迫的程度。軟體動物不具備特異性免疫，吞噬作用是其重要的防御機制中，堿性磷酸酶（ALP）是軟體動物溶酶體酶的重要組成部分，異物被吞噬之后與溶酶體結合后被水解酶消化分解從而完成防御反應[30-31]。ALP酶隨著烏賊運輸密度的增加而升高，但在1.2、1.8 ind.·L-1組出現(xiàn)降低的情況，可能與此密度情況下減少機體代謝和活動水平，防御能力也隨之降低有關。這與低濃度條件下亞硝酸氮對曼氏無針烏賊[10]脅迫、氨氮對櫛孔扇貝Chlamys farreri[32]脅迫下ALP 的變化趨勢一致。超氧化物歧化酶（SOD）可以防止機體受到自由基的損害，受到輕度逆境脅迫時，SOD 活性往往升高，而受到重度逆境脅迫時，SOD 活性降低，機體受到損傷[10]。在本研究中SOD 的活性呈“M”形變化，當密度達到0.6 ind.·L-1時SOD 顯著上升后又顯著下降，在達到2.4 ind.·L-1后又顯著上升。這表明密度脅迫會對烏賊機體抗氧化活性產(chǎn)生影響，受輕度逆境脅迫導致SOD 活性上升，密度脅迫增加后肝臟功能受損導致SOD 活性下降。

4 結論

運輸密度顯著影響曼氏無針烏賊成活率，烏賊通過降低代謝、減少活動等來適應較高密度條件下的運輸損傷。運輸過程中密度過高引起的缺氧和水體惡化造成的肝臟損傷可能是烏賊死亡的主要原因，建議運輸密度不宜超過1.8 ind.·L-1且運輸時間不宜超過2 h，長時間運輸應適當降低運輸密度。