李 港 劉博文 王子晗 王彥彥 高崇玉

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453000）

植物內(nèi)生菌是指整個生命活動都在宿主各細(xì)胞間隙、組織和器官內(nèi)，而不會對宿主產(chǎn)生嚴(yán)重危害和引起宿主產(chǎn)生排斥反應(yīng)的微生物[1-2]。內(nèi)生菌種類多樣、分布廣泛，主要概括為內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生放線菌三個大的種類，其與宿主之間存在著和諧聯(lián)合的關(guān)系[3]。由于內(nèi)生菌寄生于宿主中，隨著生物的進化發(fā)展，內(nèi)生菌不僅獲得了與宿主產(chǎn)生相同或相似產(chǎn)物的能力，還具有產(chǎn)生宿主所不能產(chǎn)生的物質(zhì)的能力。植物內(nèi)生菌因與宿主間存在共生關(guān)系，其次級代謝產(chǎn)物可影響宿主植物的物質(zhì)代謝、能量代謝，提高宿主植物對生物（寄生蟲、害蟲和動物等）或非生物（溫度、pH值、鹽、堿、重金屬、紫外線、水分和海拔等）脅迫的耐受性[4-5]，有效保障宿主植物良好的生長發(fā)育。由于內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物非常豐富，具有很高的臨床研究價值，已成為醫(yī)學(xué)界科研人員探索的寶庫之一。

1 內(nèi)生菌的分離與純化

1.1 傳統(tǒng)的分離與純化

1.1.1 內(nèi)生真菌的分離與純化。內(nèi)生真菌分離與純化基本上是先用乙醇與次氯酸對植物表面消毒，然后剪成小份放入PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)分離。例如，趙作威等[6]提取白花蛇舌草內(nèi)生真菌時，依次用75%乙醇浸泡30 s、3% NaClO溶液浸泡60 s、75%乙醇浸泡30 s對白花蛇舌草進行表面消毒，然后將白花蛇舌草各部分剪成小塊放入PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，當(dāng)觀察到培養(yǎng)基上有真菌長出時，及時接種到新的PDA培養(yǎng)基上進行純化培養(yǎng)。也有部分研究者用0.1%升汞代替其他化學(xué)消毒劑來進行植物表面消毒[7]。楊帆等[8]提取藥用植物內(nèi)生真菌時，先用70%乙醇浸泡各組織5 s后，根、莖、果經(jīng)0.1%升汞浸泡1.5～2.0 min，葉、花經(jīng)0.1%升汞浸泡30～45 s，進行表面消毒，然后接種在含有鏈霉素（400 μg/mL）的PDA平皿上進行分離純化。

1.1.2 內(nèi)生細(xì)菌的分離與純化。耿 直等[9]用堇葉碎米薺提取內(nèi)生細(xì)菌時，先將組織依次浸泡于75%乙醇（根和莖浸泡2 min，葉浸泡1 min）和2%次氯酸鈉（根和莖浸泡5 min，葉浸泡3 min）中消毒清洗，然后用75%乙醇清洗；最后研磨，將研磨液稀釋涂布于NA培養(yǎng)基上，通過分離劃線進行分離純化。高 磊等[10]用新疆牛至提取內(nèi)生細(xì)菌，首先用75%乙醇消毒3 min、5%次氯酸鈉消毒5 min，再用普通培養(yǎng)基進行消毒測驗；然后研磨，將研磨液加入TSB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，最后用分區(qū)劃線法進行內(nèi)生細(xì)菌純化。代亞鋒等[11]對表面消毒方法進行了改進，茶樹葉表面消毒采用3.0%過氧化氫浸泡3 min，研磨后稀釋成不同濃度梯度，各取100 μL涂布于NA培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)，分離純化采用平板劃線法。

1.1.3 內(nèi)生放線菌的分離與純化。內(nèi)生放線菌的分離與純化表面消毒與內(nèi)生真菌和內(nèi)生細(xì)菌大致相同，但針對不同樣品時，有些會添加其他物質(zhì)來增強表面消毒的程度和采用不同的培養(yǎng)基選取目的菌株。例如陳 雷等[12]在利用大葉藻進行內(nèi)生放線菌的分離純化時，用無菌海水進行了沖洗，涂布于7種固體分離培養(yǎng)基（2216E、HV、ISP2、M2、SCA、R2A、RO）上進行培養(yǎng)、分離與純化。李 蜜等[13]利用海南西海岸紅樹林伴生植物提取內(nèi)生放線菌時，利用了9種分 離 培 養(yǎng) 基 （AGG、M4、M5、M7、M9、M10、ISP7、ISP3和M11）進行分離培養(yǎng)。雷艷娟等[14]對新疆13種荒漠植物根內(nèi)生放線菌進行分離純化時，采用的是SCA培養(yǎng)基和高氏一號培養(yǎng)基。

1.2 輔以高通量測序技術(shù)的分離與純化

高通量測序技術(shù)可以先對定殖于植物里的內(nèi)生菌的結(jié)構(gòu)和多樣性進行整體了解，找到在宿主中生活良好的菌株，分析其全基因組；然后從基因?qū)用媪私鈨?yōu)勢菌株的生物特性并設(shè)計針對該優(yōu)勢菌株的分離方法，有針對性地選擇培養(yǎng)基；最后對分離菌株進行生物活性研究。內(nèi)生菌分離與純化時，傳統(tǒng)方法輔以高通量測序技術(shù)可以大大減少研究者漏篩有價值功能菌株的情況，擴大內(nèi)生菌的研究范圍，有利于內(nèi)生菌的深入挖掘和利用[15]。李 越等[16]對紫萍內(nèi)生菌進行研究時，選用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)測定紫萍內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA序列，使用FLASH、UCHIME和UPARSE等軟件整理和統(tǒng)計數(shù)據(jù)結(jié)果。

2 內(nèi)生菌次級代謝產(chǎn)物的生物學(xué)活性

內(nèi)生菌依附于宿主植物并從中獲得營養(yǎng)，通過物質(zhì)和能量代謝產(chǎn)生的物質(zhì)稱為次級代謝產(chǎn)物[17-18]。隨著生物的進化發(fā)展，內(nèi)生菌具備了產(chǎn)生宿主不能產(chǎn)生的有研究價值的生物活性物質(zhì)的能力[19]。例如：李春鶴[20]從雷公藤內(nèi)生真菌Talaromyces amestolkiae CS-O-1次級代謝產(chǎn)物中分離得到14個化合物，并通過質(zhì)譜及核磁共振等手段鑒定了7個化合物，包含 1個新化合物 chrodrimanin T（1）和6個已知化合物，分別為煙酰胺（2）、penipyridoneD（3）、penipyridone A（4）、3-benzylidene-8，8a-dihydroxy-2-methyl-hexahydro-pyrrolo[1，2-a]pyrazine-1，4-dione（5）及 aspergillumarin A（6）、鄰苯二甲酸丁基異丁酯（7）；李 婧等[21]從朝鮮淫羊藿中鑒定出6株內(nèi)生真菌，且6株內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物均含有黃酮類成分，含量范圍為0.09～0.22 mg/mL。

2.1 抑菌作用

蔣詩林等[22]對美洲大蠊腸道內(nèi)生放線菌的抗菌活性進行了研究，體外抑菌試驗顯示，49株內(nèi)生放線菌次級代謝產(chǎn)物均對金黃色葡萄球菌或耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）有不同程度拮抗作用，且11株內(nèi)生放線菌對2種指示菌株都有拮抗作用，表明內(nèi)生放線菌對腸道菌有先天抑菌優(yōu)勢，其中鏈霉菌屬占大部分，發(fā)揮了主要抗菌作用。李玲玲[5]從青蒿中分離出19株內(nèi)生細(xì)菌，18株有抑菌活性；34株內(nèi)生放線菌，14株有抑菌活性，抗菌譜較窄，對釀酒酵母的抑菌效果好；23株內(nèi)生真菌，8株有抑菌效果。雷丹丹等[23]研究內(nèi)生菌Aspergillus terreus PC-038的次級代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，1，2-二氫煙曲酶酸和煙曲霉酸對標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用，最低抑菌濃度（MIC）分別為 8 μg/mL 和 4 μg/mL。 吾爾恩·阿合別爾迪等[24]從天山雪蓮中分離出8株內(nèi)生真菌，其中菌株N4和N7的代謝產(chǎn)物具有抑菌活性。N4菌株代謝產(chǎn)物對目標(biāo)菌株均有拮抗作用，從小到大依次為人體腸道內(nèi)具有傳染性、在一定條件下可引起胃腸道疾病的大腸埃希菌和常見的食源性致病菌金黃色葡萄球菌、條件致病的腐生寄生真菌白假絲酵母菌、可以分解色氨酸的需氧菌枯草芽孢桿菌。馬逢時等[25]從白花前胡中篩選到25株菌株，其中：MG-1對金黃色葡萄球菌以及耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度達(dá)到0.059 mg/mL；利用LC-MS鑒定MG-1和白花前胡的共有代謝產(chǎn)物，分別為紫花前胡素、珊瑚菜內(nèi)酯、白花前胡丁素。

2.2 抗腫瘤作用

張建芬等[26]從華澤蘭中提取到8株內(nèi)生菌，其醋酸乙酯提取物對人乳腺癌細(xì)胞都表現(xiàn)出不同程度的抗腫瘤能力，其中效果最明顯的是菌株EC102、EC108。李俊峰等[27]從野生鐵皮石斛中分離純化內(nèi)生菌，并提取內(nèi)生菌次級代謝產(chǎn)物，用MTT法檢測內(nèi)生菌TG2代謝產(chǎn)物是否具有抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)菌株TG2的代謝產(chǎn)物具有較好的抗腫瘤活性，且抗腫瘤活性與劑量成正比。代金霞等[28]對寧夏枸杞內(nèi)生菌的研究發(fā)現(xiàn)，有4株菌株對腫瘤細(xì)胞Hela和A549的生長具有抑制作用，其中菌株FL1對Hela和A549的抑制率分別達(dá)78.8%、89.2%，F(xiàn)L6對Hela和A549的抑制率分別達(dá)到65.7%、55.7%。

2.3 抗氧化作用

趙倩倩等[29]從堿蓬中分離純化得到了6株內(nèi)生真菌，其中產(chǎn)黃青霉屬無性型真菌具有較高的清除DPPH自由基的作用，利用核磁共振波譜的方法鑒定其次級代謝產(chǎn)物為2個甾體類化合物。王俊麗等[30]從太子參塊根中分離內(nèi)生真菌，試驗數(shù)據(jù)顯示：內(nèi)生菌不同提取物清除DPPH自由基的IC50值存在較大差別，有的提取物IC50值高達(dá)近300 mg/mL，而有的卻不到1 mg/mL；清除·OH自由基的IC50值與清除DPPH自由基的IC50值變化規(guī)律相同，清除能力好的IC50值高達(dá)946.221 mg/mL，清除能力差的IC50值低至1.053 mg/mL。表明內(nèi)生真菌次級代謝產(chǎn)物的活性存在差距，獲得優(yōu)勢菌株對試驗研究與臨床藥物研究具有重要價值。韋琮智等[31]在研究銀杏內(nèi)生菌的胞外多糖時，經(jīng)過脫蛋白、透析、層析得到2種多糖組分（EPS1-1和EPS2-1），一個為酸性多糖，一個為中性多糖，多糖的相對分子質(zhì)量、體積和黏度等都會影響其抗氧化活性。采用控制單一變量原則進行研究，結(jié)果表明，這2種胞外多糖均有一定的還原力和清除DPPH自由基、超氧陰離子自由基、對羥自由基的能力，其中對DPPH自由基的清除能力較強，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.1 mg/mL時，EPS1-1和EPS2-1對DPPH的清除率分別達(dá)到34%和48%。

2.4 其他生物活性

有科研人員對2 700多種內(nèi)生真菌提取物進行了抗利什曼原蟲活性篩選，發(fā)現(xiàn)有高達(dá)17%的菌株具有抗寄生蟲活性，其中活性較強的菌株屬于蜜環(huán)菌科、毛球菌科和羊駝科。也有學(xué)者研究太子參內(nèi)生芽孢桿菌RPB-32代謝產(chǎn)物（BM）對小鼠腸道微生物組成的影響，認(rèn)為內(nèi)生芽孢桿菌代謝產(chǎn)物可能對機體降糖降脂、抗感染和抗炎等方面有增強作用[32]。研究者從雷公藤中分離出內(nèi)生真菌，其中踝節(jié)菌屬（Talaromyces）對乙酰膽堿酯酶具有中等程度的拮抗作用[33]。

3 總結(jié)與展望

現(xiàn)有研究表明，內(nèi)生菌含有豐富的黃酮類、甾體類、萜類等活性物質(zhì)，能成為新藥物研發(fā)的重要來源。但目前內(nèi)生菌分離大多采用傳統(tǒng)的方法，有學(xué)者表明，此種方法并不利于內(nèi)生菌的充分利用。另外，研究內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物要求試驗人員和實驗室具備較好的試驗?zāi)芰图夹g(shù)條件，這也是限制內(nèi)生菌深入研究的壁壘之一。因此，本文綜述了植物內(nèi)生菌的研究進展，以期為研究者深度挖掘內(nèi)生菌的價值提供參考。