劉 佳 ，吳道順 潘云風(fēng) 王艷慧 ，羅 云 ，孫曉波 （.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京009；.貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴陽 55005；.廣州市香雪制藥股份有限公司，廣州 5066）

小兒厭食癥又稱消化功能紊亂，是3～6歲小兒的常見病、多發(fā)病，且有逐年上升的趨勢，臨床表現(xiàn)為拒絕吃足量的食物并對食物和進食缺乏興趣，會導(dǎo)致嚴重的生長缺陷，長此以往會嚴重損害兒童的身心健康[1―2]。據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，有12%～34%的小兒患有不同程度的厭食癥[3]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)探究厭食癥機理主要從消化液、胃黏膜結(jié)構(gòu)、胃腸道動力、微量元素、腸道菌群、體內(nèi)激素等方面著手，通常以使用助胃動力藥、助消化劑、補鋅劑、調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)制劑為主，效果不盡如人意，且易復(fù)發(fā)，不能滿足臨床需求。中醫(yī)多采用辨證論治，認為厭食癥主要與脾、胃、肝三臟功能失常有關(guān)，疾病多從虛實轉(zhuǎn)化[4]，治療多采用調(diào)和肝脾、運以脾胃、恢復(fù)脾胃功能，從根本上治療小兒厭食癥。中醫(yī)治療小兒厭食癥年代長久，治療藥物安全有效，家長和患兒易于接受。

化橘紅為蕓香科植物化州柚Citrus grandis‘Tomen‐tosa’或柚Citrus grandis（L.）Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外層果皮[5]。近年來，關(guān)于化橘紅的研究包括化橘紅醇提物的止咳化痰能力優(yōu)于水提物[6]，化橘紅中黃酮類成分的抗炎、抗氧化作用[7]，柚皮苷的抗氧化應(yīng)激作用[8]等，未見報道其消食作用的研究。但化橘紅的健胃消食作用在古籍中多次被記載：宋代《圣濟經(jīng)》記載“陳橘之性溫辛，用其皮可以消痰去涎也。兼其瓤，適以生痰腲脾也”，認為不去白的化橘紅用于和中補胃[9]；《太平惠民和劑局方》記載“枳殼、橘紅輩，自能寬中快膈，不致傷脾”[10]；《本草綱目》也有記載“留白則補脾胃，去白則理肺氣”[11]；清朝《本草綱目拾遺》記載“橘紅治痰癥，消油膩、消食、醒酒、寬中、解蟹毒”[12]。因此，本研究采用厭食癥模型幼齡大鼠為研究對象，探討化橘紅提取物對其治療的藥效學(xué)作用，以期為化橘紅新產(chǎn)品研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有MX5型百萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司），Synergy H.M型酶標儀（美國BioTek公司），數(shù)字玻片圖像掃描及分析系統(tǒng)、EG1150型石蠟包埋機、RM2245型石蠟切片機（德國Leica公司），Heraeus Multifuge X1R型臺式高速冷凍離心機（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 主要藥品與試劑

化橘紅提取物（批號20200101A，100 g提取物/瓶，每1 g提取物含化橘紅0.946 g）由廣州市香雪制藥股份有限公司提供；江中健胃消食片（陽性對照藥，批號21101012）購自江中藥業(yè)股份有限公司；胃蛋白酶活性檢測試劑盒（批號BC2325）、胃泌素（gastrin，GAS）試劑盒（批號SEKR-0104）、胃動素（motilin，MTL）試劑盒（批號SEKR-0105）、抑胃肽（gastric inhibitory peptide，GIP）試劑盒（批號SEKR-0102）均購自北京索萊寶科技有限公司；羧甲基纖維素鈉（批號DCBC0696V）購自日本Sigma-Aldrich公司；PBS（批號ZLI-9062）、蘇木素染色液（批號19041201）、伊紅染色液（批號19040921）均購自無錫傲銳東源生物科技有限公司；NaOH（批號1806021）購自西隴科學(xué)股份有限公司；酚酞指示劑（批號L2109165）、二甲基黃指示劑（批號L1918056）均購自阿拉丁試劑（上海）有限公司；特制飼料[合格證號SCXK（京）2019-0010）]購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司；其余試劑均為實驗室常用規(guī)格，水為雙蒸水。

1.3 實驗動物

60只SD幼齡大鼠（3周齡），雌雄各半，體質(zhì)量（50±10） g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2021-0011。所有幼齡大鼠飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所SPF級動物房，動物使用許可證號為SYXK（京）2017-0020。動物實驗屏障主要環(huán)境指標：室溫（23±1） ℃，日溫差≤4 ℃，相對濕度50%～60%。飼養(yǎng)人員經(jīng)過培訓(xùn)合格后對動物進行飼養(yǎng)管理，在整個飼養(yǎng)過程和相關(guān)處置過程中符合實驗動物福利要求并經(jīng)過動物福利委員會（IACUC）的審查批準，批件號為SLXD-20211027013。

2 方法

2.1 動物造模

采用病因模擬法建立幼齡大鼠厭食癥模型[13]。隨機選取10只幼齡大鼠作為對照組給予常規(guī)飼料，其余幼齡大鼠給予特制飼料（魚肉松、奶粉、玉米粉、黃豆粉、白糖、鮮雞蛋、鮮肥肉按1∶1∶1∶2∶1∶1.8∶2的比例混合均勻，制成餅狀，烘干，4 ℃冷藏）。根據(jù)文獻[14]，當(dāng)造模幼齡大鼠的攝食量平均下降20%～30%、體質(zhì)量低于對照組的10%～15%時表明造模成功。

2.2 動物分組及給藥

將造模成功的幼齡大鼠隨機分成5組，每組10只，分別為模型組、健胃消食片組（0.65 g/kg）和化橘紅提取物低劑量（0.5 g/kg）、中劑量（1.0 g/kg）、高劑量（2.0 g/kg）組，另外給予常規(guī)飼料的10只大鼠作為對照組。根據(jù)2020年版《中國藥典》（一部）規(guī)定，以及《藥理實驗方法學(xué)》中人和動物間體表面積折算公式得到相應(yīng)的等效劑量，成人（60 kg）化橘紅用量為3～6 g，換算成大鼠給藥劑量為0.3～0.6 g/kg，取中間劑量0.5 g/kg為低劑量，1.0 g/kg為中劑量，2.0 g/kg為高劑量；健胃消食片每天用量為6 g，換算成大鼠給藥劑量為0.65 g/kg。藥物溶劑為0.5%羧甲基纖維素鈉，給藥組灌胃相應(yīng)藥液；對照組和模型組灌胃0.5%羧甲基纖維素。每天1次，連續(xù)灌胃14 d。

2.3 幼齡大鼠體質(zhì)量及攝食量檢測

造模結(jié)束后，計算幼齡大鼠第7、14天的攝食量，每周稱取大鼠體質(zhì)量，記錄數(shù)據(jù)。大鼠平均攝食量＝（總的投食量－次日飼料剩余量）/動物總數(shù)。

2.4 幼齡大鼠胃酸濃度檢測

末次給藥后1 h，異氟烷麻醉大鼠，備皮，常規(guī)消毒皮膚，于劍突下沿腹白線開2.5 cm切口，提起胃，在幽門與十二指腸結(jié)合部用縫線結(jié)扎，縫合創(chuàng)口后放回籠中，術(shù)后禁食禁水。4 h后麻醉大鼠并進行腹主動脈取血。處死后取出胃組織，收集胃液于刻度離心管中，以3 000 r/min離心15 min。吸取2 mL上清液加入二甲基黃和酚酞指示劑各3滴，用0.02 mol/L NaOH溶液微量滴定，逐滴加入，邊滴邊搖勻，顏色由櫻紅色變?yōu)槌赛S色再變?yōu)槲⒓t色時為滴定終點。胃酸濃度（mmol/L）＝NaOH溶液終點量×10。

2.5 幼齡大鼠胃蛋白酶活性檢測

采用相應(yīng)試劑盒，取0.1 mL胃液加入0.9 mL試劑盒中的提取液，于4 ℃下以10 000 r/min離心10 min，取上清液稀釋2倍，按照說明書中的方法加樣于96孔板中，用酶標儀在275 nm波長處測得吸光度，再計算胃蛋白酶活性。胃蛋白酶活性（U/mL）＝13.1×（測定孔吸光度－對照孔吸光度）。

2.6 幼齡大鼠血清GAS、MTL、GIP水平檢測

取“2.4”項下幼齡大鼠血液于常溫下靜置2 h凝固，于4 ℃下以3 000 r/min離心10 min，吸取上清液，于－80 ℃超低溫冰箱中備用。檢測血清中GAS、MTL、GIP水平，按試劑盒說明書進行操作。

2.7 幼齡大鼠胃組織病理學(xué)觀察

取“2.4”項下獲取胃組織適量，多聚甲醛固定，制得石蠟切片，HE染色，將切片放入數(shù)字玻片圖像掃描及分析系統(tǒng)進行圖像采集并分析。

2.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用GraphPad Prism 8.4軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey法進行分析。檢驗水準α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 化橘紅提取物對幼齡大鼠體質(zhì)量和攝食量的影響

開始給藥（第0天）前，與對照組相比，模型組幼齡大鼠的攝食量降低約50%（P＜0.05）、體質(zhì)量降低19%（P＜0.05），表明厭食癥造模成功。與模型組相比，給藥第7天時，化橘紅提取物中劑量組幼齡大鼠體質(zhì)量顯著增加（P＜0.05）；給藥第14天時，化橘紅提取物中劑量組、健胃消食片組幼齡大鼠體質(zhì)量均顯著增加（P＜0.05）。與模型組相比，給藥第7、14天時，化橘紅提取物高劑量組、健胃消食片組攝食量均顯著增加（P＜0.05）。結(jié)果見圖1。

3.2 化橘紅提取物對幼齡大鼠胃酸濃度和胃蛋白酶活性的影響

與對照組比較，模型組幼齡大鼠胃酸濃度顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，化橘紅提取物中、高劑量組幼齡大鼠胃酸濃度均顯著升高（P＜0.05），健胃消食片組幼齡大鼠胃酸濃度升高但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與對照組比較，模型組幼齡大鼠胃蛋白酶活性顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，化橘紅提取物中、高劑量組和健胃消食片組幼齡大鼠胃蛋白酶活性均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖2。

3.3 化橘紅提取物對幼齡大鼠血清GAS、MTL和GIP水平的影響

與對照組比較，模型組幼齡大鼠血清GAS、MTL水平均顯著降低（P＜0.05），GIP水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，化橘紅提取物中、高劑量組幼齡大鼠血清GAS水平均顯著升高（P＜0.05），健胃消食片組幼齡大鼠血清GAS水平升高但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；化橘紅提取物高劑量組和健胃消食片組幼齡大鼠血清MTL水平均顯著升高（P＜0.05）；化橘紅提取物低、中、高劑量組和健胃消食片組幼齡大鼠血清GIP水平均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖3。

圖3 化橘紅提取物對幼齡大鼠血清GAS、MTL和GIP水平的影響

3.4 化橘紅提取物對幼齡大鼠胃組織病理學(xué)改變的影響

與對照組比較，模型組幼齡大鼠出現(xiàn)明顯胃黏膜充血，上皮細胞松解脫落現(xiàn)象；與模型組比較，化橘紅提取物中、高劑量組和健胃消食片組幼齡大鼠胃表層上皮細胞未見明顯病理改變，偶見胃黏膜輕微充血。結(jié)果見圖4。

圖4 化橘紅提取物對幼齡大鼠胃組織病理學(xué)改變的影響

4 討論

小兒厭食癥是兒科臨床常見疾病，常見原因有以下幾點：（1）微量元素缺乏；（2）喂養(yǎng)不當(dāng)；（3）腸道菌群失調(diào)；（4）激素水平失調(diào)；（5）藥物因素。小兒胃腸功能不全且脆弱，如果治療不及時很容易影響其身體智力發(fā)育。西醫(yī)主張補充微量元素、調(diào)節(jié)胃腸道動力等，大多選用胃蛋白酶類藥物，但只是起到了緩解癥狀的作用[15]。

中醫(yī)認為小兒厭食癥屬于“食滯”范疇，由脾胃功能失調(diào)、先天不足、后天失養(yǎng)導(dǎo)致。而蜜炙橘紅歸肺脾二經(jīng)，具有寬中理脾之功效；土炒橘紅又可增強其補脾胃的功效[9]。本實驗通過監(jiān)測幼齡大鼠體質(zhì)量及攝食量發(fā)現(xiàn)，給藥7 d后，與模型組比較，化橘紅提取物組大鼠體質(zhì)量、攝食量明顯增加，表明化橘紅提取物有增強食欲的作用。胃酸能殺死包括幽門螺桿菌在內(nèi)的微生物，并使胃和小腸相對無菌。它還有助于蛋白質(zhì)消化，促進非血紅素鐵、鈣和維生素B12的吸收。胃蛋白酶元必須由胃酸活化成胃蛋白酶，再將蛋白質(zhì)消化分解。另外，腸道胰液消化蛋白質(zhì)系統(tǒng)中的羧肽酶原要轉(zhuǎn)化成能消化蛋白質(zhì)的羧肽酶，亦需要胃蛋白酶來激活，否則也會影響腸道中蛋白質(zhì)的消化及氨基酸的利用。本研究通過檢測幼齡大鼠胃酸濃度及胃蛋白酶活性發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，給藥組可提高幼齡大鼠胃酸濃度及胃蛋白酶活性，表明化橘紅提取物具有提高胃酸濃度、增加胃蛋白酶活性、改善胃腸動力的作用，進而促進消化，提高營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，其中高劑量組表現(xiàn)出最佳效果。

GAS存在于胃竇（幽門黏膜）的G細胞中，是食物攝取過程中胃酸分泌的主要激素刺激劑，也是一種營養(yǎng)激素，主要作用是維持胃黏膜的完整性[16]。本研究通過胃組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，給藥后的幼齡大鼠胃黏膜未見明顯病理改變。本實驗也檢測了幼齡大鼠血清中GAS水平，與模型組比較，給藥組的血清GAS水平顯著提升，表明化橘紅提取物具有保護和維持胃黏膜完整性的作用。有研究表明，MTL對胃和膽囊排空有刺激作用，早在2016年MTL就被確定為胃腸道的關(guān)鍵饑餓信號[17]。MTL激動刺激饑餓是通過膽堿能途徑進行的[18]，新斯的明（膽堿酶抑制劑）并不能引起禁食狀態(tài)下的饑餓感，提示只有MTL本身或其引起的胃收縮增加了饑餓感[19]，從而提高自愿膳食需求。本實驗檢測幼齡大鼠血清MTL水平結(jié)果顯示，與模型組比較，給藥組血清MTL水平明顯增加，表明化橘紅提取物可增強胃腸道動力，增加攝食需求。有研究報道，GIP在動物模型中顯示出抑制胃酸分泌及刺激胃生長抑素分泌的作用[20]。本實驗通過檢測厭食癥模型幼齡大鼠血清GIP水平發(fā)現(xiàn)，模型組GIP水平明顯升高，結(jié)合胃酸濃度顯著降低的表現(xiàn)，也證實GIP可抑制胃酸分泌；與模型組比較，化橘紅提取物可顯著降低GIP的水平，減弱其抑制胃酸分泌的作用，增加食欲和食量。

綜上所述，化橘紅提取物可增加胃酸濃度、胃蛋白酶活性、GAS、MTL的表達，降低GIP的表達，同時具有保護胃黏膜的能力。化橘紅提取物有增強胃動力、改善食欲的潛能，并可能對治療小兒厭食癥有一定的優(yōu)勢。該研究為進一步探究化橘紅提取物治療小兒厭食癥的功效提供了思路，但對于小兒厭食癥的分子機制及化橘紅功能因子的確定尚不明確，還需進一步研究。