深圳市男男性行為人群艾滋病病毒主要流行亞型的分子網(wǎng)絡特征分析

黃元妹 袁苑 鄭陳麗 李浩 朱悅 李思美 張燕 譚唯 趙錦，

1山西醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院（太原 030001）；2深圳市疾病預防控制中心（廣東 深圳 518000）；3汕頭大學醫(yī)學院（廣東 汕頭 515014）；4中山大學公共衛(wèi)生學院（廣州 510080）

盡管如今艾滋病的防治措施很多，聯(lián)合防治也越來越普遍，但是每年的新報告病例和經(jīng)性傳播感染的HIV/AIDS例數(shù)并沒有明顯降低［1］。相關研究表明，男男性行為人群（men who have sex with men，MSM）是全球HIV新發(fā)感染的主要原因［2］。我國2006-2020年新增HIV感染者中MSM的比例從2.5%上升至33.4%［3］，深圳市新報告HIV感染者中MSM的占比由2005年的3.9%增長到2012年的42.8%，2011-2018年該比例累計達到51.72%［4-5］。傳統(tǒng)的艾滋病流行病學方法主要分析個體的HIV感染風險，較少考慮個體之間的HIV傳播關系［6］。近年來，隨著基因技術和分子流行病學的快速發(fā)展，宮頸癌和新型冠狀病毒等多個研究領域能夠實現(xiàn)分子層面的研究［7-8］，基于分子流行病學研究方法的HIV分子網(wǎng)絡分析可用來揭示HIV感染者的潛在傳播關系以及傳播規(guī)律，用于指導HIV的精準干預，對控制HIV傳播和降低新發(fā)感染率具有良好應用前景［9-12］。本研究通過對深圳市2017至2019年新報告MSM HIV感染者的三種主要亞型的分布特征和分子網(wǎng)絡特征進行分析，為控制該人群HIV的傳播提供線索。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集深圳市2017至2019年首次報告為HIV陽性的MSM人群的基本人口學信息并采集研究對象的血液樣本。本研究由深圳市疾病預防控制中心倫理委員會審查批準（審批編號：QS2021100037）。

1.2 方法

1.2.1 序列的獲得 將收集到的2017-2019年新報告HIV陽性MSM的血漿樣本進行RNA的提取和純化、逆轉錄PCR和巢式PCR進行兩輪擴增，擴增后的產(chǎn)物交由測序公司進行測序。獲得的序列使用Sequencer 5.0進行剪切、拼接。使用Mega 6.0對拼接好的序列進行比對、剪齊并保存，剔除序列長度小于1 010堿基對（簡稱bp）的pol區(qū)基因序列，用于下一步亞型分型和分子網(wǎng)絡分析。

1.2.2 亞型的判定 將序列長度為1 010 bp的序列使用在線亞型判別工具Genetyping（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi）、Stanford耐藥數(shù)據(jù)庫（https：//hivdb.stanford.edu/hivdb/bymutations/）、Los Alamos實驗室數(shù)據(jù)庫（https：//www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/HIVTools.html）和基于Kimura 2參數(shù)模型，在MEGA 6.0軟件中設置bootstrap值為1 000，選用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，以綜合判定序列的亞型。

1.3 分子網(wǎng)絡的構建 使用軟件HyPhy 2.2.4分別計算三種主要亞型的成對基因距離，將基因距離閾值為0.5%［13］的三大亞型的序列導入軟件Cytoscape 3.7.2［14］中實現(xiàn)分子網(wǎng)絡可視化。使用以下指標［15-16］來描述分子網(wǎng)絡的特征：（1）入網(wǎng)率：進入網(wǎng)絡的人數(shù)在總人數(shù)中所占的百分比；相對于未進入網(wǎng)絡的個體，網(wǎng)絡內的個體相互之間存在推斷的傳播關系；因此某人群的入網(wǎng)率越高，其傳播風險越高；（2）節(jié)點：一個HIV感染者或一條病毒序列；（3）度值：網(wǎng)絡中節(jié)點之間連接的邊的數(shù)量，表示潛在的傳播伙伴人數(shù)，度值越高傳播風險越大；（4）簇：兩個或以上的節(jié)點相連形成一個簇；（5）高危傳播者：網(wǎng)絡中度值較高的個體。本研究將度值≥3的MSM HIV感染者（以下簡稱MSM感染者）作為高危傳播者［17］。

1.4 統(tǒng)計學方法 利用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計描述與分析，計數(shù)資料使用例（%）描述，三種主要亞型的特征分析使用χ2檢驗，采用雙側檢驗，檢驗水準α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MSM感染者亞型構成 2017至2019年新報告3 944例MSM感染者，經(jīng)耐藥擴增實驗共獲得2 848名MSM感染者的HIV pol區(qū)基因序列并成功分型，擴增成功率為72.21%。亞型分為CRF07_BC（47.79%）、CRF01_AE（28.51%）、CRF55_01B（14.92%）、B亞型（2.88%）、CRF59_01B（0.91%）、獨特重組亞型（1.86%）和其他亞型（3.13%，其中包括CRF08_BC、C亞型、CRF15_01B、CRF48_01B、CRF57_BC、CRF65_cpx、CRF67_01B、CRF68_01B）。深圳市MSM HIV感染者的三種主要亞型為CRF07_BC，CRF01_AE和CRF55_01B，這三種亞型感染者占91.22%。

2.2 三種主要亞型的分布情況 經(jīng)卡方分析，三種亞型（CRF01_AE和CRF55_01B各1例因CD4+T細胞數(shù)值不詳未納入統(tǒng)計分析）在年齡、職業(yè)、婚姻狀況、學歷水平、CD4+T細胞數(shù)量的差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在MSM HIV感染者中，低年齡段感染CRF01_AE和CRF07_BC的比例較高，高年齡段感染CRF55_01B的比例較高；商業(yè)服務和家政及待業(yè)人員感染CRF01_AE和CRF07_BC的比例較高，工人及農(nóng)民感染CRF55_01B的比例較高；未婚感染CRF01_AE和CRF07_BC的比例較高，已婚和離異或喪偶感染CRF55_01B的比例較高；CRF55_01B感染者初中及以下學歷水平的占比較高，而CRF01_AE和CRF07_BC感染者大專及以上學歷水平的占比較高；CD4+T細胞數(shù)低于200個/μL的感染者感染CRF01_AE和CRF55_01B的比例較高，CD4+T細胞數(shù)高于501個/μL以上的感染者感染CRF07_BC和CRF55_01B的比例較高。見表1。

表1 深圳市2017至2019年MSM感染者三種主要亞型特征分布情況Tab.1 Characteristic distribution of three main subtypes of MSM infected people in Shenzhen from 2017 to 2019 例（%）

2.3 三種主要流行亞型的分子網(wǎng)絡特征 當基因距離閾值為0.5%時，三種亞型總入網(wǎng)節(jié)點數(shù)為839個，形成194個簇和1 291條邊，總入網(wǎng)率為32.32%（839/2 596），高危傳播者占25.51%。進入分子網(wǎng)絡的三種亞型感染者主要集中在35歲以下、漢族、未婚、外省或外籍、商業(yè)服務、無性病史、201～500個/μL CD4+T細胞，CRF01_AE感染者主要集中在高中或中專、CRF07_BC感染者主要集中在大專及以上、CRF55_01B感染者主要集中在初中及以下。經(jīng)卡方分析，三種亞型入網(wǎng)率差異有統(tǒng)計學意義，CRF55_01B的入網(wǎng)率最高，CRF01_AE的入網(wǎng)率最低（表1）；亞型為CRF01_AE感染者不同CD4+T細胞數(shù)的入網(wǎng)率差異有統(tǒng)計學意義，亞型為CRF55_01B感染者不同學歷水平的入網(wǎng)率差異具有統(tǒng)計學意義。其中CRF01_AE感染者CD4+T細胞數(shù)為201～ 500個/μL，入網(wǎng)率（126/213）最高，CD4+T細胞數(shù)高于501個/μL時，入網(wǎng)率（18/213）最低；CRF55_01B感染者學歷水平為初中及小學的入網(wǎng)率（61/157）最高，高中或中專入網(wǎng)率（43/157）最低。亞型為CRF07_BC的MSM感染者入網(wǎng)率在年齡、民族、戶籍地、職業(yè)、婚姻狀況、學歷水平、性病史和CD4+T細胞數(shù)量方面的差異均無統(tǒng)計學意義。見表2。

表2 深圳市2017至2019年MSM感染者中三種主要亞型入網(wǎng)特征分析Tab.2 Analysis of network entry characteristics of three main subtypes of MSM infected people in Shenzhen from 2017 to 2019 例

見圖1，CRF01_AE的入網(wǎng)率為26.26%，其分子網(wǎng)絡由213個節(jié)點形成64個簇（由2個節(jié)點形成的簇為39個，3～9個節(jié)點形成的簇為23個，10個及以上節(jié)點形成的簇為2個）和180條邊，簇的大小為2～26個節(jié)點，度值≥3個的高危傳播者占14.08%（30例）；CRF07_BC的入網(wǎng)率為31.46%，其分子網(wǎng)絡由469個節(jié)點形成83個簇（由2個節(jié)點形成的簇為59個，3～8個節(jié)點形成的簇為23個，10個及以上節(jié)點形成的簇為1個）和931條邊，簇的大小為2～263個節(jié)點，高危傳播者占29.21%（137例）；CRF55_01B的入網(wǎng)率為37.03%，其分子網(wǎng)絡由157個節(jié)點形成47個簇（由2個節(jié)點形成的簇為25個，3～9個節(jié)點形成的簇為21個，10個及以上節(jié)點形成的簇為1個）和180條邊，簇的大小為2～11個節(jié)點，高危傳播者占29.94%（47例）。三種主要亞型分子網(wǎng)絡中高危傳播者的人口特征分布差異無統(tǒng)計學意義。

圖1 深圳市2017至2019年MSM感染者的三種主要亞型分子網(wǎng)絡圖Fig.1 Molecular network diagram of the three main subtypes of MSM infected people in Shenzhen from 2017 to 2019

3 討論

本研究中MSM感染者的HIV pol區(qū)基因分為11種亞型（不包括獨特重組亞型），比2016年深圳報道的MSM感染者的HIV pol區(qū)基因亞型多3種，表明深圳市MSM感染者的HIV pol區(qū)基因型越來越復雜。但是主要的三種亞型種類并未發(fā)生改變，與之前研究相比，本研究中三種主要亞型總體所占比例有所上升，CRF07_BC和CRF55_01B比例有所上升，CRF01_AE所占比例有所下降，CRF55_01B、CRF07_BC感染者中高危傳播者比例較CRF01_AE高，很大程度上可認為，與CRF01_AE相比，CRF55_01B、CRF07_BC的傳播網(wǎng)絡正在快速擴張中［4-5，18］。

深圳市MSM感染者的HIV pol區(qū)三種主要基因型與廣東?。?9］一致，也與廣西壯族自治區(qū)［20-21］一致，深圳與廣西跨省傳播風險較高［10］，同時二者所處地界是鄰省關系，更易發(fā)生跨省傳播，故可認為二者的主要基因型一致可能與跨省傳播有關。云南昆明MSM感染者的HIV pol區(qū)的主要亞型為CRF01_AE，CRF07_BC 和CRF08_BC［22］，山東臨沂的主要亞型為CRF01_AE，CRF07_BC和CRF55_01B［23］，這些城市的MSM感染者的HIV pol區(qū)主要基因亞型和優(yōu)勢重組亞型與深圳市不完全一致，這表明不同地區(qū)的MSM感染者的HIV pol區(qū)的主要亞型種類不盡相同。

深圳市2017至2019年MSM感染者CRF01_AE的入網(wǎng)率（26.26%）和CRF07_BC的入網(wǎng)率（31.46%）與北京市［15］2013年MSM感染者中CRF01_AE的入網(wǎng)率（52.17%）和CRF07_BC的入網(wǎng)率（82.76%）相比低很多，可能是選取的基因距離閾值不同導致的。本研究中CRF01_AE和CRF07_BC的入網(wǎng)率與昆明市［24］2016至2018年MSM感染者中CRF01_AE的入網(wǎng)率（32.43%）和CRF07_BC的入網(wǎng)率（35.84%）相比要低一些，可能與構建分子網(wǎng)絡的方法不同有關。

當基因距離閾值為0.5%時，深圳市三種亞型入網(wǎng)的MSM感染者主要集中在35歲以下、漢族、未婚、外省或外籍、商業(yè)服務、無性病史、201～500個/μL CD4+T細胞，CRF01_AE感染者主要集中在高中或中專、CRF07_BC感染者主要集中在大專及以上、CRF55_01B主要集中在初中及以下。就入網(wǎng)率而言，感染CRF55_01B感染者入網(wǎng)率最高，CRF01_AE感染者入網(wǎng)率最低，因此CRF55_01B和CRF07_BC感染者傳播風險較高，CRF01_AE感染者傳播風險較低；就最大傳播簇的大小而言，CRF07_BC感染者形成的傳播簇最大，最易發(fā)生大簇的聚集，CRF55_01B形成的傳播簇最小，故CRF07_BC大簇中的感染者傳播風險較高。CRF01_AE感染者中，CD4+T細胞數(shù)為201～500個/μL入網(wǎng)率最高，501個/μL以上的入網(wǎng)率最低，故CRF01_AE感染者中，CD4+T細胞數(shù)為201～500個/μL傳播風險最高；CRF55_01B感染者中，初中及小學的入網(wǎng)率最高，在高中或中專的傳播風險最低，故CRF55_01B感染者中，初中及小學的傳播風險最高。

本研究尚存在一些不足之處：納入的研究對象是新確證的MSM HIV感染者，不確定其是否為新發(fā)HIV感染者［15］；并未分析MSM HIV感染者的性行為特征與入網(wǎng)率的關系。后續(xù)將進一步把感染者的親和力實驗數(shù)據(jù)、病毒載量實驗數(shù)據(jù)與社會網(wǎng)絡特征納入本研究，確定分子網(wǎng)絡內相互連接的感染者之間的傳播關系和傳播方向。

綜上所述，2017-2019年深圳市MSM感染者HIV pol區(qū)基因亞型分為11種，三種主要亞型感染者占91.22%?；蚓嚯x閾值為0.5%時，入網(wǎng)的三種主要亞型MSM HIV感染者主要集中在35歲以下、漢族、未婚、外省或外籍、商業(yè)服務、無性病史、201～500個/μL CD4+T細胞數(shù)，CRF01_AE感染者主要集中在高中或中專、CRF07_BC感染者主要集中在大專及以上、CRF55_01B感染者主要集中在初中及以下。CRF01_AE感染者中，CD4+T細胞數(shù)為201～500個/μL傳播風險最高，CRF07_BC大簇中的感染者傳播風險較高，CRF55_01B感染者中，初中及小學的傳播風險最高。提示應針對三種亞型中傳播風險較高的感染者開展宣傳教育、推廣安全套使用、互聯(lián)網(wǎng)/新媒體干預、抗病毒治療等干預措施以控制二代傳播。