林 濤，郭 瑾，李夢霞，林 昕，陳 靜，李茂萱，李彥剛，劉宏程*

1. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，云南 昆明 650205；2. 云南工商管理學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650106；3. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，云南 昆明 650205

三唑磷和茚蟲威是茶樹種植過程中普遍使用的農(nóng)藥，主要用于防治茶樹麗綠刺蛾、茶小綠葉蟬和螨蟲等害蟲[1-3]。近年來，隨著茶樹蟲害的日益嚴(yán)重，三唑磷和茚蟲威在茶樹上的用量也不斷增大，導(dǎo)致茶葉中的殘留量較大[4-5]。在飲用茶葉時(shí)，三唑磷和茚蟲威都會在一定程度上隨著茶葉沖泡過程而遷移到茶湯中并進(jìn)入到人體內(nèi)[6-7]，過量的攝入必然會對人體造成一定的傷害?；诖耍覈氖称分修r(nóng)藥最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)（GB 2763—2021）[5]對于茚蟲威在茶葉中制定了最大殘留限量要求；雖然沒有對三唑磷進(jìn)行最大殘留限量規(guī)定，但對于三唑磷的每日允許攝入量（ADI）也規(guī)定了較低的允許值。

為了監(jiān)測綠茶中的三唑磷和茚蟲威殘留量，我國的GB 2763—2021以及相關(guān)的文獻(xiàn)也報(bào)道了關(guān)于三唑磷和茚蟲威的測定方法[8-10]，但是由于綠茶基質(zhì)成分復(fù)雜，在測定過程中常常會出現(xiàn)雜質(zhì)干擾以及較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，嚴(yán)重地影響了兩種農(nóng)藥的準(zhǔn)確定量[11-12]，這對于綠茶中三唑磷和茚蟲威的殘留監(jiān)測帶來了較大的困難。

近年來，基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的出現(xiàn)能夠有效地提高分析過程中的檢測質(zhì)量，確保檢測方法及數(shù)據(jù)的可靠性、準(zhǔn)確性和可溯源性[13]，但是目前在茶葉中農(nóng)藥殘留的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)還比較少，僅有的主要包括了啶蟲脒基體標(biāo)準(zhǔn)樣品[14]、聯(lián)苯菊酯基體標(biāo)準(zhǔn)樣品[15]、嘧霉胺等13種農(nóng)藥多殘留基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品[16]，對于三唑磷和茚蟲威等農(nóng)藥的基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究還處于空白?；诖耍驹囼?yàn)研究針對綠茶種植過程中用量較大、檢出率較高的三唑磷和茚蟲威進(jìn)行基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制，以期為茶葉中農(nóng)藥殘留檢測與質(zhì)量安全監(jiān)管提供標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茶樹（小葉種），云南省普洱市；正己烷、丙酮、乙酸乙酯、乙腈、甲醇（色譜純），德國Merck公司；乙酸鈉、氯化鈉、無水硫酸鎂、檸檬酸二鈉鹽倍半水合物、檸檬酸鈉二水合物（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲酸、乙酸、乙酸銨（色譜純），中國迪馬科技公司；ENVI-Carb SPE固相萃取小柱（6 mL，250 mg），美國 Supelco公司；陶瓷均 質(zhì) 子、ProElut C18、PSA、GCB 填 料（50μm），中國迪科馬科技公司；三唑磷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（100 μg/mL，GBW(E)082281），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；茚蟲威標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（10 μg/mL，L14325500CY），Dr. Ehrenstorfer GmbH公司；三唑磷原藥（PD20050119，有效成分含量85%），安道麥股份有限公司；茚蟲威原藥（PD20170278，有效成分含量97%），江蘇建農(nóng)植物保護(hù)有限公司。

API4000三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國AB Sciex公司；1290超高效液相色譜儀，美國Agilent公司；ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱（1.7 μm, 1 mm × 50 mm），美國 Waters公司；7890B氣相色譜儀（配ECD檢測器），美國安捷倫公司；XSR225DU/AC電子天平，梅特勒托利多科技（中國）有限公司；TGL-15B型高速臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；渦旋振蕩器，美國Thermo Scientific公司；HY-5型回旋式振蕩儀，江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 綠茶中三唑磷、茚蟲威陽性基質(zhì)樣品的制備

在云南省普洱地區(qū)的茶園，選取長勢健康、無明顯病蟲害的適齡茶樹25棵，將三唑磷和茚蟲威原藥用水稀釋為1 mg/L的濃度，混勻后噴施2次，噴施時(shí)間分別為采收前20 d和前10 d，其他栽種條件不變。待茶葉到采摘期時(shí)分別從每棵茶樹上采摘適量鮮葉，混勻后取5 kg，參照GB/T 14456.1—2017[17]中的加工工藝進(jìn)行綠茶的制作，制作好的綠茶樣品粉碎過80目分子篩后混勻待分裝。

1.2.2 綠茶中三唑磷、茚蟲威基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的分裝

將以上粉碎混勻后的綠茶樣品裝入50 mL的HDPE塑料小瓶，每瓶分裝重量為10 g，共分裝150瓶，密封后于室溫下避光保存。

1.2.3 綠茶中三唑磷、茚蟲威基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性檢驗(yàn)

隨機(jī)抽取分裝好的基體標(biāo)樣10瓶，每瓶平行稱取 3 份，每份 2 g，采用 GB 23200.121—2021[18]中規(guī)定的對茶葉的測定方法分別對三唑磷和茚蟲威2種農(nóng)藥進(jìn)行測定。測定結(jié)果參照GB/T 15000.3—2008（標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則（3）標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計(jì)方法）[19]，以F檢驗(yàn)，確定綠茶樣品的均勻性數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布。

1.2.4 綠茶中三唑磷、茚蟲威基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性檢驗(yàn)

短期穩(wěn)定性考察。模擬運(yùn)輸條件包括常規(guī)和極端的運(yùn)輸條件，分別考察4℃、20℃和40℃下的穩(wěn)定性，分別在第 0 d、3 d、5 d、7 d、14 d進(jìn)行穩(wěn)定性考察，每個(gè)考察樣品測定5次，取5次結(jié)果的平均值，根據(jù)GB/T 15000.3—2008[19]采用t-檢驗(yàn)對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，相關(guān)計(jì)算公式如下：

在自由度n-2、置信水平p=0.95（95%顯著水平）下，t- 檢驗(yàn)的臨界值為：t(0.95,n-2)=t(0.95,3)=3.182；如果 ＜ t(0.95,n-2)s(b1)，則斜率并不顯著，表明檢測樣品在相應(yīng)的考察周期內(nèi)穩(wěn)定性較好，反之則說明穩(wěn)定性較差。

短期穩(wěn)定性的不確定度的貢獻(xiàn)

長期穩(wěn)定性考察。分別于第0個(gè)月、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月取樣檢測。每次取2瓶樣品，每個(gè)樣品稱取3份平行樣品，每份試樣以測定5次的平均值為其定值結(jié)果。根據(jù)GB/T 15000.3—2008[19]，采用t-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，相關(guān)的斜率計(jì)算公式、截距計(jì)算公式、直線上每點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算公式、與斜率相關(guān)的不確定度計(jì)算公式以及長期穩(wěn)定性的判斷與短期穩(wěn)定性的計(jì)算公式相同。長期穩(wěn)定性的不確定度的貢獻(xiàn)ults=12s(b1)。

1.2.5 綠茶中三唑磷、茚蟲威基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值

兩種不同原理測定方法的比較。三唑磷的兩種不同原理測定方法分別采用GB 23200.113—2018[20]和 GB 23200.121—2021[18]并對測定結(jié)果進(jìn)行比較。茚蟲威的兩種不同原理測定方法分別采用SN/T 1971—2007（第一法，氣相色譜法）[21]和GB 23200.121—2021[18]并對測定結(jié)果進(jìn)行比較。

多家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值。分別選取質(zhì)檢行業(yè)、農(nóng)業(yè)檢測行業(yè)、科研機(jī)構(gòu)等不同行業(yè)的代表性相關(guān)檢測機(jī)構(gòu)8家，隨機(jī)從分裝好的基體標(biāo)樣中抽取樣品24瓶，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室分發(fā)3瓶，每瓶稱取1份樣品，按照GB 23200.121—2021[18]方法進(jìn)行測定，平行測定2次。參照GB/T 15000.3—2008[19]，相關(guān)計(jì)算公式如下所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 均勻性

均勻性檢驗(yàn)結(jié)果分別見表1 ～ 表4。從表2和表4可知，三唑磷和茚蟲威的MS間/MS內(nèi)都小于F0.05（9, 20），說明此次制備的綠茶中三唑磷和茚蟲威基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性較好。

表1 綠茶中三唑磷均勻性檢驗(yàn)的測量數(shù)據(jù)Table 1 Measurement data of triazophos homogeneity test in green tea

表2 綠茶中三唑磷均勻性研究的方差分析表Table 2 Analysis of variance table for the study on the homogeneity of triazophos in green tea

表4 綠茶中茚蟲威均勻性研究的方差分析表Table 4 Analysis of variance table for the study on the homogeneity of indoxacarb in green tea

從上表可見，以υ1（即組間）=9及υ2（即組內(nèi)）=20查 F 界值表，得 F0.05(9, 20)=2.39，由于 F=MS間/MS內(nèi)=0.615008473 ＜ F0.05（9, 20），所以本樣品是均勻的。

表3 綠茶中茚蟲威均勻性檢驗(yàn)的測量數(shù)據(jù)Table 3 Measurement data of indoxacarb homogeneity test in green tea

均勻性檢驗(yàn)的不確定度ubb=sbb=0.004。

從上表可見，以υ1（即組間）=9及υ2（即組內(nèi)）=20查F界值表，得F0.05(9, 20)=2.39，由于F= MS間/MS內(nèi)= 1.879 ＜ F0.05（9, 20），所以本樣品是均勻的。

2.2 穩(wěn)定性

2.2.1 短期穩(wěn)定性

用t-檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)結(jié)果見表 5。三唑磷和茚蟲威的都小于 t(0.95,nμ2)s(b1)，說明斜率不顯著，表明此綠茶中三唑磷和茚蟲威基體標(biāo)準(zhǔn)樣品的短期穩(wěn)定性較好。

表5 短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Short-term stability test results

2.2.2 長期穩(wěn)定性

用t-檢驗(yàn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)結(jié)果見表 6。三唑磷和茚蟲威的都小于 t(0.95,nμ2)s(b1)，說明斜率不顯著，表明此綠茶基體標(biāo)準(zhǔn)樣品在12個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定性較好。

表6 穩(wěn)定性檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果Table 6 Test Results of stability check

2.3 定值結(jié)果

2.3.1 不同原理方法的測定結(jié)果比較

根據(jù)相關(guān)的國家標(biāo)準(zhǔn)中對于三唑磷和茚蟲威的測定方法，不同測定方法的結(jié)果如表7所示。結(jié)果表明，不同原理的測定方法對于綠茶中的三唑磷和茚蟲威的相對相差較小，標(biāo)準(zhǔn)中的相關(guān)方法都可以使用，但為了在實(shí)際檢測工作中快速便捷，推薦該基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中的三唑磷和茚蟲威采用GB 23200.121—2021中的LC-MS/MS方法進(jìn)行測定。

表7 兩種測定方法比較Table 7 Comparison of the two determination methods

2.3.2 定值結(jié)果

三唑磷和茚蟲威的多家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值結(jié)果及相關(guān)計(jì)算分別見表8和表9。

表8 三唑磷聯(lián)合定值結(jié)果Table 8 Results of joint determination of triazophos

表9 茚蟲威聯(lián)合定值結(jié)果Table 9 Results of joint determination of indoxacarb

2.3.3 不確定度計(jì)算

根據(jù)GB/T 15000.3—2008的規(guī)定，定值結(jié)果由特性值和不確定度組成。根據(jù)本次綠茶中三唑磷和茚蟲威基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制過程，其不確定度uCRM由標(biāo)準(zhǔn)值定值試驗(yàn)產(chǎn)生的不確定度天平稱量產(chǎn)生的不確定度u1（使用的電子天平分辨率為0.00001 g，它的最大允許誤差為0.00010 g，按均勻分布，故儀器產(chǎn)生的不確定度、均勻性檢驗(yàn)的不確定度ubb、短期穩(wěn)定性檢驗(yàn)的不確定度usts和長期穩(wěn)定性檢驗(yàn)的不確定度ults組成，如表10所示。

表10 綠茶中三唑磷和茚蟲威基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性值Table 10 Characteristic values of matrix reference material of triazophos and indoxacarb in green tea

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用在茶樹上噴灑三唑磷和茚蟲威農(nóng)藥制備得到陽性樣品，并按照綠茶加工工藝制備得到成品茶后進(jìn)一步粉碎、過篩、分裝后得到綠茶中三唑磷和茚蟲威基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。均勻性和穩(wěn)定性檢驗(yàn)表明該基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性較好，且12個(gè)月內(nèi)較穩(wěn)定。通過多家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值結(jié)果為：三唑磷0.317±0.027 mg/kg、茚蟲威 0.572±0.029 mg/kg。