芪骨膠囊高效液相指紋圖譜研究

陽麗華 肖惠琳 何迎慶 車莉 張建忠

（1. 廈門中藥廠有限公司 廈門 361100；2. 上海醫(yī)藥集團股份有限公司 上海 200020）

芪骨膠囊由淫羊藿、制何首烏、黃芪、石斛、肉蓯蓉、骨碎補、菊花組成，具有滋養(yǎng)肝腎，強筋健骨的功效。用于女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥肝腎不足證，癥見腰膝酸軟無力、腰背疼痛、步履艱難、不能持重[1-2]。目前芪骨膠囊產(chǎn)品質(zhì)量控制方法中沒有指紋圖譜技術(shù)，而中藥指紋圖譜技術(shù)具有信息量大，特征性強，可同時反映中藥復(fù)雜混合體系中各種化學(xué)成分的整體情況，較完整地反映中藥材及其制劑的質(zhì)量[3]。目前范興等[4]研究的芪骨膠囊指紋圖譜指認出5個化合物，為了指認出盡可能多的活性化學(xué)成分及控制盡可能多的處方藥味的質(zhì)量，我們進一步深入研究了芪骨膠囊指紋圖譜，現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀（沃特世有限公司）；ME1002E電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；KQ-600DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

松果菊苷（批號111670-201706，含量89.7%）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號111920-201606，含量97.6%）、柚皮苷（批號110722-201815，含量91.7%）、淫羊藿苷（批號110737-201516，含量94.2%）、朝藿定C（批號111780-201804，含量92.6%）、大黃素（批號110756-201512，含量98.7%）均購自中國食品藥品檢定研究院；2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷（批號must-18051611，含量99.44%）、朝藿定B（批號must-18071403，含量99.23%）、朝藿定A（批號must-18072304，含量98.13%）、淫羊藿次苷Ⅰ（批號must-18102120，含量97.78%）、寶藿苷Ⅰ（批號must-18042203，含量99.58%）購自成都曼思特生物科技有限公司；芪骨膠囊來自廈門中藥廠有限公司；乙腈、甲醇為色譜純；水為純化水；其余試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流速1 mL/min；檢測波長270 nm；進樣量10 μL；流動相[4]為甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液，進行梯度洗脫（表1）。

表1 流動相梯度洗脫

1.3.2 溶液的制備

1）供試品溶液 精密稱量芪骨膠囊內(nèi)容物0.5 g加入50 mL甲醇，稱定重量；超聲30 min，用甲醇補足減失的質(zhì)量，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液進樣分析[4]。

2）對照品溶液 取各對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL中含松果菊苷18.55 μg、毛蕊異黃酮葡萄糖苷25.22 μg、2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷30.95 μg、柚皮苷 26.89 μg、朝藿定 A 25.75 μg、淫羊藿苷18.92 μg、朝藿定 B 20.00 μg、淫羊藿次苷Ⅰ 26.60 μg、朝藿定 C 22.48 μg、大黃素 16.07 μg、寶藿苷Ⅰ 22.70 μg的對照品溶液。

2 結(jié)果

2.1 專屬性考察

分別取空白溶劑和芪骨膠囊供試品溶液進行HPLC分析，結(jié)果表明，空白溶劑（甲醇）對供試品溶液的分析不存在干擾，專屬性良好（圖1）。

圖1 專屬性考察用HPLC分析

2.2 精密度試驗

吸取供試品溶液進樣6次分析，以淫羊藿苷的峰面積和保留時間為參照，計算15個共有峰的相對峰面積和相對保留時間。結(jié)果顯示，15個共有峰的相對峰面積的RSD在0.09%～2.29%之間，相對保留時間的RSD在0.01%～0.09%之間，表明儀器的精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液分別于室溫放置0、2、4、6、10、16、24、36、48、72 h時進樣分析，以淫羊藿苷的峰面積和保留時間為參照，計算15個共有峰的相對峰面積和相對保留時間。結(jié)果顯示，15個共有峰的相對峰面積的RSD在0.49%～3.18%之間，相對保留時間的RSD在0.01%～0.62%之間，表明供試品在72 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4 重復(fù)性試驗

取同一批芪骨膠囊粉制備6份芪骨膠囊供試品溶液，進樣分析，以淫羊藿苷的峰面積和保留時間為參照，記錄15個共有峰的相對峰面積和相對保留時間。結(jié)果顯示，15個共有峰的相對峰面積的RSD在0.20%～2.95%之間，相對保留時間的RSD在0.01%～1.15%之間，表明實驗的重現(xiàn)性良好。

2.5 HPLC指紋圖譜的建立與相似度、共有峰分析

取21批芪骨膠囊粉末進樣和分析，運用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012版）進行21批樣品HPLC圖譜分析，得HPLC指紋圖譜（圖2、3）。

圖2 21批樣品的HPLC疊加指紋圖譜

2.6 相似度評價

運用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》，以對照指紋圖譜進行對照，對整體相似度進行評價。各樣品圖譜與對照指紋圖譜的相似度均大于0.9，表明21批樣品質(zhì)量穩(wěn)定性良好。

圖3 樣品的HPLC對照指紋圖譜

2.7 共有峰的指認

通過與各味藥材、陰性樣品色譜圖比對，對15個共有色譜峰進行指認，共指認了14個峰的藥味歸屬[4-10]，其中峰7、8、9、10、11、12、13、14歸屬淫羊藿；峰4、15歸屬何首烏；峰5、6歸屬骨碎補；峰3歸屬黃芪；峰2歸屬肉蓯蓉。與混合對照品色譜圖比對，指認出了11個峰的化學(xué)成分，峰2為松果菊苷、峰3為毛蕊異黃酮葡萄糖苷、峰4為2,3,5,4’-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷、峰6為柚皮苷、峰7為朝藿定A、峰8為朝藿定B、峰9為朝藿定C、峰10為淫羊藿苷、峰11為淫羊藿次苷1、峰14為寶藿苷1、峰15為大黃素。

3 討論

通過大量實驗，對流動相組成和流動相洗脫條件的優(yōu)化研究，最終優(yōu)選出液相色譜條件，在該技術(shù)條件下所建立的指紋圖譜能同時檢測出芪骨膠囊的11個化學(xué)成分，比范興等建立的芪骨膠囊HPLC指紋圖譜可多指認出6個化學(xué)成分，加嚴了產(chǎn)品的質(zhì)量控制。另外對15個峰進行了藥味歸屬，可提升產(chǎn)品的質(zhì)量控制水平。

本研究建立的芪骨膠囊指紋圖譜檢測方法，其專屬性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性考察結(jié)果均符合要求，具有較好的可行性。后期將繼續(xù)收集大量批次的芪骨膠囊樣品來驗證所建立的對照指紋圖譜的合理性，對其不斷完善，為產(chǎn)品質(zhì)量評價提供更加全面的理論依據(jù)。