李富玉 ,陳帥民 ,劉夢帥 ,陳苗苗 ,李小方 ,劉彬彬**

(1. 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所農(nóng)業(yè)資源研究中心 石家莊 050022;2. 中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049;3. 吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所 長春 130033;4. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院/植物-土壤相互作用教育部重點實驗室/中國農(nóng)業(yè)大學(xué)國家農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展研究院 北京 100193;5. 瓦赫寧根大學(xué)植物生態(tài)與自然保護(hù)組 瓦赫寧根 6700AA 荷蘭)

銅是生物系統(tǒng)中必不可少的微量元素,然而,高濃度的銅通常對生物有害[1]。生物體已經(jīng)進(jìn)化出復(fù)雜的銅穩(wěn)態(tài)系統(tǒng),以維持正常的細(xì)胞銅供應(yīng),同時解毒過量的銅[2]。闡明細(xì)菌對銅的抗性機(jī)制對利用微生物技術(shù)治理重金屬污染、實現(xiàn)污染耕地安全利用具有重要意義。

目前的研究已經(jīng)鑒定了多種細(xì)菌對銅的抗性機(jī)制,如丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)的cop機(jī)制,該機(jī)制包含copABCDRS基因,copRS為調(diào)節(jié)基因,copA 和copC 為周質(zhì)空間蛋白,copD 為內(nèi)膜蛋白,其功能是負(fù)責(zé)銅的運(yùn)輸;大腸桿菌(Escherichia coli)的銅抗性機(jī)制包括cut 機(jī)制、cus 機(jī)制和pco 機(jī)制。cut 機(jī)制包含cutABCDEFRS基因,cutA和cutB參 與銅的吸收,cutF參與銅的運(yùn)輸,cutC和cutD參與銅的排放;pco 機(jī)制包含pcoABCDRSE基因,pcoA具有氧化活性,可將Cu+氧化為Cu2+減弱對菌體的毒害,cus系統(tǒng)中的cusF 蛋白首先在大腸桿菌中被鑒定,細(xì)胞周質(zhì)中的Cu+被cusF 蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到cusABC 通道進(jìn)行離子外排[3]。銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosaPAO1)通過鐵載體與重金屬配合物結(jié)合增強(qiáng)其對銅的抗性[4]。具有重金屬抗性細(xì)菌也可以通過結(jié)合金屬硫蛋白(MT)和低分子量半胱氨酸蛋白來抑制有毒重金屬的生物利用度[5],如貪銅菌(Cupriavidus gilardiiCR3)通過半胱氨酸和谷胱甘肽的生物合成產(chǎn)生重金屬螯合分子,促進(jìn)其對銅的解毒作用[6]。這些機(jī)制在分子水平上是一個復(fù)雜的過程,盡管各種銅抗性系統(tǒng)的功能已在許多細(xì)菌中被鑒定出來,然而,這些復(fù)雜過程的很多分子調(diào)控機(jī)制仍不清楚。

全基因組測序是研究微生物功能的重要方法,從基因組層面研究細(xì)菌對銅的抗性機(jī)制能夠全面了解細(xì)菌體內(nèi)與重金屬抗性及代謝途徑相關(guān)的基因;轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析可以確定細(xì)菌如何對特定的非生物條件作出轉(zhuǎn)錄反應(yīng),是闡明細(xì)菌對重金屬抗性分子機(jī)制的重要手段;利用基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)合能夠全面地從分子層面揭示細(xì)菌對生理毒害和環(huán)境的響應(yīng)機(jī)制。溶桿菌Lysobacter soliRCu6 (以下簡稱RCu6)是我們在土壤中分離到的具有銅抗性的菌株,屬于溶桿菌(Lysobacter soli),該菌基因組攜帶有許多銅抗性基因簇,如copLABMGA、cusABC、czcABC等。然而,目前對溶桿菌屬細(xì)菌銅抗性機(jī)制的研究仍鮮見報道。本研究旨在揭示菌株RCu6 的基因組特性以及RCu6 對銅脅迫的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和可能參與銅抗性的代謝途徑,為微生物的重金屬抗性機(jī)制提供新的認(rèn)識,為通過微生物技術(shù)實現(xiàn)耕地的安全利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株RCu6 的分離和最小抑制濃度(MIC)的確定

本研究中使用的RCu6 菌株分離自中國科學(xué)院欒城農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)試驗站(114°41′E,37°53′N)。將10 g 小麥季土壤和10 mL 無菌超純水置于50 mL 離心管中,于25 ℃、150 rpm 下振蕩培養(yǎng)1 h,然后將細(xì)菌培養(yǎng)物接種于選擇瓊脂培養(yǎng)基上(具體配方見電子版附表S1 或掃描首頁OSID 碼),取單菌落接種至選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行純化。

本研究利用Wang 等[7]使用的兩倍稀釋法來確定RCu6 的MIC (MIC 被定義為培養(yǎng)24 h 后無細(xì)菌生長的最低濃度)范圍,將RCu6 接種到Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基中,于25 ℃、150 rpm 下培養(yǎng)6 h,將CuSO4溶液(使培養(yǎng)基中Cu2+的濃度為0～4 mmol·L-1,每0.2 mmol·L-1為一個梯度)添加到相應(yīng)的錐形瓶中培養(yǎng)24 h。使用分光光度計(UV-6100S,上海元析)測量OD600值來監(jiān)測微生物量[8],每個Cu2+濃度梯度均設(shè)置3 個重復(fù)。

在LB 培養(yǎng)基中添加Cu2+,使其濃度分別為0.4 mmol·L-1、0.8 mmol·L-1、1.2 mmol·L-1和 1.6 mmol·L-1,于25 ℃、150 rpm 的速度振蕩培養(yǎng)72 h,每個Cu2+濃度梯度設(shè)置3 個重復(fù)。使用分光光度計每8 h 記錄一次OD600值,構(gòu)建細(xì)菌生長曲線。

1.2 銅去除能力的測定

在含有不同銅濃度(0.4 mmol·L-1、0.8 mmol·L-1、1.2 mmol·L-1和1.6 mmol·L-1)的LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)RCu6 菌48 h 后,以10 000 rpm 離心10 min,去掉上清,收集菌體,用無菌超純水洗滌3 次,然后加入10 mL 5 mmol·L-1EDTA,于25 ℃、150 rpm 振蕩培養(yǎng)30 min;用原子吸收光譜法(Shimadzu AA-6300,日本京都)測量上清液中的銅濃度以得到細(xì)胞表面吸附量;將細(xì)菌在85 ℃下干燥24 h,使用65%的濃硝酸在150 ℃下消解細(xì)菌2 h 后,測量銅的質(zhì)量以得到RCu6 菌株細(xì)胞內(nèi)銅吸附量。

1.3 菌種鑒定及全基因組測序、組裝、注釋

使用G-spin DNA 提取試劑盒(iNtRON Bio-technology Inc.,Sungnam,Korea),按照說明提取RCu6 菌的基因組DNA。使用27F (5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)引物擴(kuò)增16S rRNA 基因[9],擴(kuò)增過程為95 ℃初始變性5 min;然后進(jìn)行25 個循環(huán)(95 °C 變性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min);最后在72 ℃延伸10 min。16S rRNA 基因和細(xì)菌基因組測序工作委托蘇州金唯智生物科技有限公司完成。使用BLASTN (NCBI)和EzTaxon-e servers[10]對細(xì)菌16S rRNA 基因進(jìn)行比對分析。

使用FastQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)和Cutadapt 軟件[11]對基因組測序獲得的原始序列進(jìn)行質(zhì)量控制和過濾,以去除低質(zhì)量序列和接頭序列;使用HGAP4[12]對過濾后的read 進(jìn)行基因組組裝;使用Prodigal[13]預(yù)測蛋白質(zhì)編碼基因;使用默認(rèn)參數(shù)設(shè)置的tRNAScan-SE[14]和RNAmmer[15]預(yù)測tRNA 基因和rRNA 基因;使用Non-Redundant Protein Sequence Database (NRDB),Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG),Gene Ontology (GO)和Protein Orthologous Group (COG)對編碼基因的功能進(jìn)行注釋。本部分研究產(chǎn)生的原始序列(raw reads)已提交到NCBI (PRJNA799173)。

1.4 RNA 提取和轉(zhuǎn)錄組測序

選擇兩種濃度的銅脅迫(0.8 mmol·L-1和1.6 mmol·L-1)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組研究,不加銅的處理作為對照,每種處理設(shè)置3 個重復(fù)。將RCu6 菌株按1%的體積比接種量接種到50 mL LB 培養(yǎng)基中,于25 ℃、150 rpm 下培養(yǎng)至OD600為0.5。隨后添加CuSO4溶液(使其Cu2+的濃度分別為0.8 mmol·L-1和1.6 mmol·L-1,0 mmol·L-1為對照),并培養(yǎng)至OD600值為1.2,在4 ℃下以8000×g 離心2 min 收集菌體。使用RNAeasy Mini 試劑盒(Qiagen)提取細(xì)菌細(xì)胞中的總RNA;使用NEBNext? UltraTMDirectional RNA Library Prep Kit for Illumina 構(gòu)建RNA-seq 文庫,在Illumina HiSeq X Ten (Illumina,San Diego,CA,USA)平臺對文庫進(jìn)行2×150 bp 測序(文庫的構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測序工作委托蘇州金唯智生物科技有限公司完成)。

1.5 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

使用FastQC (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)對Raw reads 進(jìn)行質(zhì)量控制;使用Cutadapt[11]去除低質(zhì)量分?jǐn)?shù)(Phred 分?jǐn)?shù)＜30)的堿基以及接頭序列;使用Bowtie2 (http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml)構(gòu)建參考基因組索引并與RCu6 完整基因組進(jìn)行比對,使用HTSeq[16]計算基因表達(dá)count 值;使用Deseq2[17]分析銅脅迫下基因表達(dá)水平(無銅脅迫為對照);根據(jù)校正后的P值(P-adj)＜0.01 篩選出顯著差異表達(dá)基因(DEGs);并將DEGs 用于GO 富集分析和KEGG 通路分析。使用Annota-tionDbi (https://bioconductor.org/packages/AnnotationDbi)構(gòu)建R package 進(jìn)行GO 富集分析(P-adj＜0.05),使用KOBAS (http://kobas.cbi.pku.edu.cn)進(jìn)行KEGG 通路富集分析。本部分研究產(chǎn)生的原始序列已提交到NCBI (PRJNA799196)。

1.6 實時定量PCR

從1.6 mmol·L-1銅脅迫的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中隨機(jī)選擇12 個與銅抗性相關(guān)的DEGs (copZ,copA,1_585,hisD,copG,hisG,copM,cueR,copB,sufC,copL,copB),使用12 種引物進(jìn)行qPCR 以驗證RNA-seq 數(shù)據(jù)的可靠性。使用Primer 3 軟件(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/)設(shè)計引物序列;在qPCR 之前,使用RNase-free DNase I (Promega,美國)從總RNA 中去除基因組DNA;并利用primeScriptTMRT reagent Kit with gDNA eraser (TaKaRa)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄;qPCR 體系包含10 μL TB Green? Premix Ex TaqTMII(Takara),正、反向引物各0.5 μL(10 μmol·L-1)、1 μL cDNA和 8 μL 無菌蒸餾水,qPCR 程序為95 ℃下變性3 min,然后進(jìn)行35 個周期的擴(kuò)增(即95 ℃下5 s,60 ℃下30 s);利用16S rRNA 基因和GAPDH 基因作為內(nèi)參基因,每個反應(yīng)重復(fù)3 次;使用2-ΔΔCT方法計算相對表達(dá)量[18-19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 RCu6 菌株的銅抗性和富集能力

在本研究中,Cu2+對菌株RCu6 的最小抑制濃度為3.2 mmol·L-1,RCu6 菌在低銅濃度(0.4 mmol·L-1、0.8 mmol·L-1和1.2 mmol·L-1)下的生長速度與對照組(0 mmol·L-1)相似;在1.6 mmol·L-1的Cu 濃度下,與對照組相比,RCu6 的生長被抑制(圖1a)。隨著Cu 濃度的增 加(從0.4 mmol·L-1到1.6 mmol·L-1),細(xì)胞表面吸收量從0.16 mg·g-1增加到1.59 mg·g-1,在細(xì)胞內(nèi)富集量從0.28 mg·g-1增加到0.92 mg·g-1(圖1b)。

圖1 Lysobacter soli RCu6 在不同銅濃度培養(yǎng)基中的生長情況(a)及其細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)銅吸附累積量(b)Fig.1 Growth curve (a) and copper extracellular adsorption and intracellular accumulation (b) of Lysobacter soli RCu6 in medium with different copper concentrations

2.2 菌株RCu6 的基因組學(xué)特性

利用NCBI 數(shù)據(jù)庫對16S rRNA 基因序列進(jìn)行BLAST 分析,結(jié)果顯示菌株RCu6 與溶桿菌Lysobacter soliDCY21 的一致性最高(99.72%) (圖2)。RCu6菌株的基因組為4.1 Mbp,GC 含量為67.86%,共有3681 個編碼序列,21 個rRNA 基因和52 個tRNA 基因?；蚪M的功能注釋顯示,蛋白質(zhì)編碼基因的比例為97%,被注釋到COG 數(shù)據(jù)庫的基因比例為67%。最豐富的3 個類別是轉(zhuǎn)錄(transcription)、氨基酸運(yùn)輸和代謝(amino acid transport and metabolism)以及細(xì)胞壁/膜/包膜生物形成(cell wall/membrane/envelope biogenesis) (圖3)。

圖2 溶桿菌Lysobacter soli RCu6 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic position of Lysobacter soli RCu6

圖3 Lysobacter soli RCu6 基因組信息Fig.3 Lysobacter soli RCu6 genome information

RCu6 與該屬菌株的基因組比較,在其他菌株基因組上顯示了一些缺口(圖4),表明該菌株基因組的獨特性。RCu6 與L.soliXL170、L.soliKCTC 22011、L.ummosus3.2.11 和L.capsici55 之間的平均核苷酸一致性(ANI)值分別為96.53%、96.73%、78.76%和78.81%。

圖4 基于比較基因組圈圖的Lysobacter soli RCu6 和密切相關(guān)菌株的BLAST 比較基因組分析Fig.4 Genome comparison between Lysobacter soli RCu6 and closely related strains based on BLAST comparative genomic analysis

2.3 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析和驗證

轉(zhuǎn)錄組測序后,經(jīng)過質(zhì)量控制,從9 個測序樣本中共產(chǎn)生了3.51 億條序列,99%以上的RNA 測序序列映射到了RCu6 基因組上(見電子版附表S2,或掃描首頁OSID 碼)。與對照組相比,0.8 mmol·L-1和1.6 mmol·L-1銅處理組表現(xiàn)出強(qiáng)烈的響應(yīng),分別共有315個(占檢測基因的8.6%,239 個上調(diào)和76 個下調(diào))和839 個(占檢測基因的22.8%,449 個上調(diào)和390 個下調(diào)) DEGs。

在qPCR 中,選定的上調(diào)和下調(diào)基因的表達(dá)量也得到了證實(見電子版附表S3 或掃描首頁OSID 碼),qPCR 和RNA-seq 數(shù)據(jù)之間顯示出顯著的相關(guān)性,GAPDH 基因作內(nèi)參基因時的相關(guān)性R2=0.84;16S rRNA 基因作內(nèi)參基因時R2=0.98 (P＜0.001) (圖5;引物見電子版附表S4 或掃描首頁OSID 碼)。這些結(jié)果證實了RNA-Seq 數(shù)據(jù)的可靠性。

圖5 銅濃度為1.6 mmol·L-1 下Lysobacter soli RCu6 基因表達(dá)qPCR 和RNA-Seq 間的相關(guān)性Fig.5 Correlation of gene expression data between qPCR and RNA-Seq of strain Lysobacter soli RCu6 at a copper concentration of 1.6 mmol·L-1

2.4 響應(yīng)銅脅迫的基因和代謝途徑

為深入了解RCu6 銅脅迫有關(guān)的代謝途徑,采用超幾何檢驗(Hypergeometric tests)來確定顯著富集的GO terms 和KEGG 代謝途徑。結(jié)果顯示在0.8 mmol·L-1銅脅迫組中富集的GO terms 包括: 離子結(jié)合(GO:0043169、0005507、0043167 和0046872)、對氧化脅迫的反應(yīng)(GO: 0006979)和氧化還原酶活性(GO:0016491);在1.6 mmol·L-1銅脅迫組中富集的GO terms 包括: 運(yùn)輸(GO: 0051181 和1901678)、氨基酸代謝過程(GO: 0009072、0006547 和0052803)、金屬離子結(jié)合(GO: 0005507 和0046872)、氧化還原過程(GO: 0055114)、氧化還原酶活性(GO: 0016491)以及電子傳輸鏈(GO: 0022900) (圖6)。KEGG 富集分析顯示,在0.8 mmol·L-1和1.6 mmol·L-1銅脅迫時,顯著富集的途徑有(詳見電子版附表S5 或掃描首頁OSID 碼): 檸檬酸循環(huán)(TCA cycle)、氨基酸的生物合成(biosynthesis of amino acids)、碳代謝(carbon metabolism)、組氨酸代謝(histidine metabolism)和硫代謝(sulfur metabolism)。這一結(jié)果表明,這些過程可能在銅抗性機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。

圖6 0.8 mmol·L-1 和1.6 mmol·L-1 銅脅迫下Lysobacter soli RCu6 細(xì)菌差異表達(dá)基因的GO 功能富集圖Fig.6 GO function enrichment plots of differentially expressed genes in Lysobacter soli RCu6 bacteria under 0.8-and 1.6-mmol·L-1 Cu stress

表S6 和S7 (見電子版附表或掃描首頁OSID 碼)分別顯示上調(diào)和下調(diào)程度最高的基因,這些基因功能分類主要包括金屬離子運(yùn)輸和代謝、氧化還原酶家族以及部分未知功能基因;在0.8 mmol·L-1銅脅迫下,兩個上調(diào)最高的基因分別是銅伴侶基因copZ(1_1472)和重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)P 型ATP 酶copA(1_2614)(log2foldchange 分別為7.68 和7.46),而下調(diào)最大的是編碼外膜受體蛋白基因1_143(log2foldchange 為-4.17);在1.6 mmol·L-1銅脅迫時,兩個上調(diào)最高的基因分別是血紅素吸收蛋白基因hmuP(1_1268)和外膜受體基因(1_2539) (log2foldchange 為9.88 和9.07),下調(diào)最大的是編碼與外膜受體蛋白相互作用的基因(1_143) (log2foldchange 為-6.66)。

與銅抗性相關(guān)的基因?qū)煞N濃度的銅脅迫表現(xiàn)出較大的響應(yīng)(見電子版附表S8 或掃描首頁OSID 碼),大多數(shù)基因(0.8 mmol·L-1濃度下有23 個,1.6 mmol·L-1濃度下有21 個)在銅脅迫下顯著上調(diào),DEGs 包括3 個銅抗性基因簇:copLABMGA_cusABC_soxR_copZ_merT、copLABA_cueR和czcABCD。轉(zhuǎn)錄組結(jié)果表明這些基因可能與菌株RCu6 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控(copL)、銅結(jié)合(copZ、copG)、銅運(yùn)輸(copA1、copB)、多銅氧化酶(copA2、copG)和銅外排系統(tǒng)(cusAB、czcC)相關(guān)。此外,在0.8 mmol·L-1和1.6 mmol·L-1銅脅迫下與氧化應(yīng)激和氧化還原酶活性有關(guān)的基因分別有28 個和74 個顯著差異表達(dá)。有趣的是除多銅氧化酶外,脫氫酶還原酶(fabg)、鐵依賴性加氧酶(piuC)、細(xì)胞色素C 氧化酶(copM)、脫氫酶(qor)和催化酶(KatG,AHPC)顯著上調(diào),表明這些基因可能在銅脅迫下的氧化應(yīng)激和維持細(xì)胞氧化還原平衡中發(fā)揮作用。

3 討論與結(jié)論

本文揭示了菌株RCu6 對銅的耐受性及其對銅脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制。我們進(jìn)行了菌株的全基因組測序,并利用轉(zhuǎn)錄組研究了在銅脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄水平響應(yīng)機(jī)制,揭示了銅抗性基因表達(dá)、組氨酸代謝途徑、硫代謝和Fe-S 簇組裝系統(tǒng)對銅脅迫有明顯的響應(yīng)。

在本研究中,RCu6 攜帶許多與銅抗性有關(guān)的基因,這些基因?qū)︺~脅迫表現(xiàn)出強(qiáng)烈的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)。RCu6 菌的銅抗性的實現(xiàn)可能與copL基因(轉(zhuǎn)錄調(diào)控)[20]相關(guān),這與多種細(xì)菌(如丁香假單胞菌[21]和貪銅菌)[3]中描述的雙組分調(diào)控系統(tǒng)(copRS)不同。銅結(jié)合蛋白(copZ、copG編碼)可以與細(xì)胞內(nèi)的游離Cu+或Cu2+結(jié)合以降低銅的毒性[3,22-23],銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(copA1、copB)可以跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)銅離子[24-25],多銅氧化酶(copA2、copG)可以將Cu+氧化為Cu2+以降低銅離子的細(xì)胞毒性[26-28],銅離子外排系統(tǒng)(cusAB、czcC)形成的外膜通道可以跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)銅[2-4,29-30]。本研究中，CopA1和copZ是銅抗性基因中上調(diào)幅度最大的基因(表S8),這表明銅的轉(zhuǎn)運(yùn)和結(jié)合可能是RCu6抵抗銅脅迫的重要途徑。

硫是生物體內(nèi)必不可少的元素,硫化合物具有重金屬解毒的作用[31],多種硫代謝產(chǎn)物參與氧化應(yīng)激條件下的細(xì)胞反應(yīng)[32-33]。在本研究中,與硫代謝途徑有關(guān)基因的差異表達(dá)(表S2)表明它們可能與銅抗性的發(fā)揮有重要關(guān)聯(lián),高銅脅迫高度誘導(dǎo)了編碼亞硫酸鹽蛋白合成的基因(cysH、cysI)、編碼半胱氨酸合成的基因(cysK)以及編碼谷胱甘肽合成酶基因(gshB)的表達(dá)。前期研究已經(jīng)明確了硫參與微生物對重金屬的解毒作用[34],例如Huang 等[6]利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)確定了銅脅迫下Cupriavidus gilardiiCR3 中硫同化基因的上調(diào);Liu 等[35]利用同化硫代謝菌來增強(qiáng)對重金屬的耐受性。此外,硫同化途徑還為谷胱甘肽和氨基酸的合成以及S-Fe 合成提供了硫酸鹽。重金屬脅迫和氧化環(huán)境下增加了谷胱甘肽的合成[36-38],谷胱甘肽已被證明在革蘭氏細(xì)菌中能增強(qiáng)細(xì)菌對銅的抗性[39-40];它可以還原Cu2+形成Cu+-GSH 復(fù)合物,以穩(wěn)定體內(nèi)游離銅離子[41];而谷胱甘肽在螯合過程中可以螯合金屬離子[42],從而增加細(xì)胞對銅的抵抗力。本研究中,編碼谷胱甘肽合成酶基因(gshB)的上調(diào)表明菌株RCu6 抵抗銅毒性可能與谷胱甘肽合成相關(guān)。

L-組氨酸的生物合成存在于古細(xì)菌、細(xì)菌、真核生物和植物中。以前的研究已經(jīng)揭示了L-組氨酸在細(xì)菌中的基本調(diào)節(jié)過程[43],以及L-組氨酸生物合成在真菌金屬平衡和毒力中的作用[44]。然而,關(guān)于L-組氨酸在結(jié)合銅和增強(qiáng)細(xì)菌銅抗性方面的機(jī)制仍然不清楚。本研究發(fā)現(xiàn),編碼組氨酸生物合成途徑的基因在銅脅迫條件下明顯高表達(dá)(圖6,表S5)。在RCu6 基因組中,我們發(fā)現(xiàn)了8 個組氨酸生物合成酶基因(HisG、HisI、HisA、HisF、HisD、HisC、HisH和HisB),所有8 個組氨酸生物合成基因都位于同一個操縱子上,研究表明這些基因的轉(zhuǎn)錄可能受到嚴(yán)格調(diào)控[43],過量的銅可能是誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄的原因。無論是作為游離氨基酸還是作為蛋白質(zhì)中的金屬結(jié)合殘基,組氨酸對結(jié)合的金屬有很大的親和力[42,44-47],因此組氨酸代謝可能對銅脅迫條件下的蛋白質(zhì)生物合成以及細(xì)菌金屬穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。

本研究中發(fā)現(xiàn)硫鐵簇的組裝可能與菌株RCu6銅解毒相關(guān),但在不同的生物體中Fe-S 簇的組裝系統(tǒng)有所不同,例如RCu6 可能是由SUF 系統(tǒng)介導(dǎo),而Cupriavidus gilardiiCR3 是由ISC 系統(tǒng)介導(dǎo)[6]。我 們的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明,參與硫鐵簇生物生成的基因(sufS、sufC、sufD、sufB)在銅脅迫下上調(diào)(表S8,見電子版附表或掃描首頁OSID 碼),這一結(jié)果也與Giner-Lamia 等[48]使用微陣列測序數(shù)據(jù)結(jié)果一致。

SUF 系統(tǒng)被認(rèn)為可以對氧化應(yīng)激和重金屬應(yīng)激的調(diào)節(jié)作出反應(yīng)[49-50],SufE 和SufS 向SufB 提供硫,SufB蛋白可以形成硫鐵原子簇,硫鐵團(tuán)簇在組裝過程中可以參與氧化還原過程[51-52],而銅離子通過替換硫鐵簇中的鐵,減少了細(xì)胞中游離的銅離子[6],從而增強(qiáng)對銅的抗性能力。

本研究結(jié)果揭示了溶桿菌Lysobacter soliRCu6對銅的抗性能力和抗性機(jī)制。RCu6 對銅的抗性MIC 值為3.2 mmol·L-1;該菌基因組中攜帶有許多銅抗性同源基因(copLABMGA、cusABC、czcABC等);結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明,RCu6 的銅抗性可能是一個細(xì)胞內(nèi)多系統(tǒng)協(xié)同過程,包括銅穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)、硫代謝和硫鐵簇合成途徑以及組氨酸代謝途徑。這些結(jié)果為揭示溶桿菌的銅抗性分子機(jī)制提供了新的見解,為開發(fā)農(nóng)田土壤重金屬污染的微生物修復(fù)技術(shù)提供了依據(jù)。