劉仲匯馬耀宏史建國(guó)

(1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院) 生物研究所,山東 濟(jì)南 250014;2.山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 濟(jì)南 250014)

發(fā)酵尾氣分析指在發(fā)酵過(guò)程中在線(xiàn)檢測(cè)尾氣中的CO2和O2的體積分?jǐn)?shù),計(jì)算呼吸代謝參數(shù)CO2釋放率(Carbon dioxide evolution rate,CER)、攝氧率(Oxygen uptake rate,OUR)和呼吸商(Respiratory quotient,RQ),得到細(xì)胞代謝信息,是發(fā)酵工程的一種過(guò)程分析技術(shù)(Process analysis technology,PAT)。無(wú)論是在微生物生長(zhǎng)階段,還是在產(chǎn)物合成階段,CER的變化都與菌體生長(zhǎng)狀態(tài)、碳源的消耗和供氧情況密切相關(guān)。OUR雖然取決于菌體濃度,但是也與發(fā)酵液的營(yíng)養(yǎng)成分、溶氧水平、菌體的比生長(zhǎng)速率以及碳源的種類(lèi)和濃度等因素有關(guān)。RQ的變化反映了微生物胞內(nèi)代謝的變化,揭示了發(fā)酵過(guò)程中微觀(guān)代謝途徑通量的變化,是微生物菌體生長(zhǎng)、能量代謝維持、產(chǎn)物和副產(chǎn)物合成代謝共同作用的結(jié)果[1-7]。利用這些參數(shù)及相關(guān)性分析,可以更好地對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)、分析,從而深入了解發(fā)酵規(guī)律,優(yōu)化發(fā)酵工藝,控制發(fā)酵過(guò)程,提高發(fā)酵產(chǎn)率和產(chǎn)量,降低成本,加快新品研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化。

與溶解氧和pH檢測(cè)相比,尾氣分析得到的參數(shù)CER,OUR和RQ在一定程度上反映了發(fā)酵過(guò)程的部分特質(zhì),揭示了微生物的生理特性,具有生物學(xué)意義。尾氣分析時(shí)僅采集發(fā)酵罐排出的尾氣,不影響發(fā)酵罐結(jié)構(gòu),不接觸發(fā)酵液,無(wú)染菌風(fēng)險(xiǎn)[8-10],更容易被業(yè)界接受,故成為現(xiàn)代發(fā)酵工程的重要分析手段,已被應(yīng)用于發(fā)酵、制藥、生化、農(nóng)業(yè)、環(huán)保和食品等領(lǐng)域。雖然該技術(shù)已在業(yè)內(nèi)得到應(yīng)用,但是由于歷史原因以及設(shè)備成本等因素的影響,對(duì)檢測(cè)設(shè)備是否需要采用獨(dú)立的單通道,認(rèn)識(shí)依舊模糊。因此,筆者從理論與實(shí)際應(yīng)用兩方面對(duì)該問(wèn)題加以分析探討。

1 發(fā)酵尾氣分析應(yīng)實(shí)時(shí)連續(xù)在線(xiàn)

在發(fā)酵過(guò)程中,微生物生長(zhǎng)一般需要經(jīng)歷遲緩期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和衰亡期[11]。常規(guī)的液態(tài)好氧分批發(fā)酵周期一般為數(shù)小時(shí)至數(shù)天。在看似較長(zhǎng)的發(fā)酵過(guò)程中,發(fā)酵狀態(tài)的轉(zhuǎn)變往往發(fā)生在很短的時(shí)間內(nèi),某些代謝變化可能用時(shí)更短。

張嗣良等在《多尺度微生物過(guò)程優(yōu)化》[12]及相關(guān)論文[13]中詳細(xì)闡述了生物過(guò)程的“實(shí)時(shí)性”:1) 從生物過(guò)程發(fā)生的時(shí)間以及生物技術(shù)發(fā)展特點(diǎn)來(lái)看,對(duì)于以活細(xì)胞為主體的細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的生物反應(yīng)過(guò)程,可粗分為在以基因水平的分子尺度、代謝調(diào)節(jié)的細(xì)胞尺度和工藝控制的反應(yīng)器尺度上發(fā)生的;2) 可將微生物和細(xì)胞在酶活性水平上(包括酶的激活、抑制，亞基的結(jié)合和解離以及共價(jià)修飾和降解)控制的時(shí)間常數(shù)描述在毫秒至秒的范圍內(nèi),在基因表達(dá)調(diào)控水平上(誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄的阻遏和去阻遏)描述至分鐘?？疾煳⑸锖图?xì)胞代謝調(diào)節(jié),在以秒為單位的時(shí)間尺度上是合適的。因此,作為動(dòng)態(tài)觀(guān)測(cè)記錄細(xì)胞代謝狀況的發(fā)酵尾氣分析設(shè)備,應(yīng)對(duì)排出的尾氣進(jìn)行實(shí)時(shí)連續(xù)在線(xiàn)檢測(cè),只有這樣,才能準(zhǔn)確捕捉到發(fā)酵過(guò)程中代謝的改變。

2 合理利用發(fā)酵過(guò)程中的臨界點(diǎn)

2.1 發(fā)酵過(guò)程中的臨界點(diǎn)

李強(qiáng)等[14]在《微生物發(fā)酵中二氧化碳釋放速率變化規(guī)律》中,通過(guò)青霉素、古龍酸、二元酸和葡萄糖酸4個(gè)體系的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)及動(dòng)力學(xué)分析,對(duì)CER的變化規(guī)律進(jìn)行了探究,研究結(jié)果表明:無(wú)論是霉菌、酵母菌、細(xì)菌、單液相體系、雙液相體系,還是純種發(fā)酵、混合菌發(fā)酵,CER的變化都與體系狀態(tài)變化有著密切聯(lián)系;CER曲線(xiàn)上的轉(zhuǎn)折點(diǎn)對(duì)應(yīng)的就是發(fā)酵狀態(tài)的轉(zhuǎn)變點(diǎn)。由該文獻(xiàn)的CER曲線(xiàn)可以發(fā)現(xiàn):在這些轉(zhuǎn)折點(diǎn)處曲線(xiàn)發(fā)生了方向性改變,即由升轉(zhuǎn)為降,或者由降轉(zhuǎn)為升,曲線(xiàn)出現(xiàn)明顯的峰或谷,發(fā)酵體系的狀態(tài)都發(fā)生了顯著改變。

在發(fā)酵過(guò)程中還存在另一類(lèi)極具價(jià)值的變化點(diǎn),即發(fā)酵體系的狀態(tài)變化由緩慢到快速,或由快速轉(zhuǎn)為緩慢的時(shí)間點(diǎn),比如在微生物生長(zhǎng)由遲緩期進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,由對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)入穩(wěn)定期以及由穩(wěn)定期進(jìn)入衰亡期的那些時(shí)間點(diǎn)上,都有可能出現(xiàn)該情況。在這類(lèi)時(shí)間點(diǎn)上,雖然發(fā)酵體系的CER曲線(xiàn)沒(méi)有發(fā)生方向性改變(由升到降或由降到升),但是發(fā)生了變化速率的顯著改變,或者說(shuō)發(fā)生了從一個(gè)發(fā)酵階段轉(zhuǎn)變到另一個(gè)發(fā)酵階段。這類(lèi)變化點(diǎn)在發(fā)酵過(guò)程中普遍存在,不僅有著明確的生物學(xué)意義,而且具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值?？蓪l(fā)酵過(guò)程中這類(lèi)變化速率顯著改變的點(diǎn)，以及發(fā)生方向性改變的轉(zhuǎn)折點(diǎn)統(tǒng)稱(chēng)為臨界變化點(diǎn),簡(jiǎn)稱(chēng)“臨界點(diǎn)”,其特征是發(fā)酵體系發(fā)生了從一個(gè)狀態(tài)到另一個(gè)狀態(tài)的改變,亦或從一個(gè)階段到另一個(gè)階段的改變。

應(yīng)用發(fā)酵尾氣分析技術(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)連續(xù)在線(xiàn)監(jiān)測(cè),可方便、直觀(guān)地獲得發(fā)酵過(guò)程中的臨界點(diǎn)。這些臨界點(diǎn)提供的豐富信息可以幫助人們辨識(shí)發(fā)酵過(guò)程狀態(tài),為調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速/通氣量、流加補(bǔ)料、基因誘導(dǎo)，以及異常發(fā)酵處理等一系列工藝操作提供明確指導(dǎo),同時(shí)也為工藝放大提供對(duì)比數(shù)據(jù)。充分重視和利用這些臨界點(diǎn)信息對(duì)優(yōu)化發(fā)酵工藝具有重要意義。

2.2 利用發(fā)酵過(guò)程臨界點(diǎn)指導(dǎo)操作

2.2.1 利用臨界點(diǎn)調(diào)整供氧

溶解氧是好氧發(fā)酵微生物生長(zhǎng)及產(chǎn)物合成所必需的。在發(fā)酵過(guò)程中,特別是在高密度工程菌培養(yǎng)中,溶解氧往往成為限制性因素。如何適時(shí)調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量以達(dá)到最適溶解氧,是發(fā)酵工藝的關(guān)鍵點(diǎn)之一[15-17]。一般根據(jù)溶解氧DO、pH及鏡檢結(jié)果等進(jìn)行調(diào)整,比較粗放,而利用尾氣分析曲線(xiàn)的臨界點(diǎn),則可以準(zhǔn)確把握調(diào)整時(shí)機(jī)。

在山東省科學(xué)院生物研究所承擔(dān)的“植酸酶工程菌高密度發(fā)酵智能控制關(guān)鍵技術(shù)”(山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目2016ZDJS07A20)項(xiàng)目中,在10 L實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵罐上,采用FGA發(fā)酵尾氣分析儀,對(duì)重組畢赤酵母表達(dá)植酸酶過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)在線(xiàn)檢測(cè)。發(fā)酵溫度30 ℃,初始發(fā)酵液體積7 L,通氣量5 L/min,攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min。發(fā)酵6 h 5min時(shí),CER開(kāi)始緩慢上升;發(fā)酵25 h 26 min時(shí),CER出現(xiàn)快速上升,曲線(xiàn)上形成明顯的臨界點(diǎn),預(yù)示發(fā)酵進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,此時(shí)立刻調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速至400 r/min;之后隨著CER的上升,階段性小步調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速達(dá)530 r/min,并保持至發(fā)酵48 h 30 min,之后調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速至500 r/min,直至發(fā)酵結(jié)束。該發(fā)酵過(guò)程的CER變化曲線(xiàn)如圖1所示。在該過(guò)程中,發(fā)酵15 h時(shí)進(jìn)行甲醇誘導(dǎo),誘導(dǎo)5 h后開(kāi)啟蛋白表達(dá),SDS-PAGE檢測(cè)植酸酶表達(dá)見(jiàn)文獻(xiàn)[18],最終酶活達(dá)3 000 U/mL。

圖1 植酸酶工程菌高密度發(fā)酵尾氣CER曲線(xiàn)

由圖1可知:在臨界點(diǎn)改變攪拌轉(zhuǎn)速后,細(xì)胞快速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。實(shí)驗(yàn)中根據(jù)臨界點(diǎn)及曲線(xiàn)變化趨勢(shì),恰當(dāng)掌握攪拌轉(zhuǎn)速調(diào)整時(shí)機(jī),滿(mǎn)足供氧需求,使植酸酶表達(dá)量及酶活均達(dá)較高水平。

2.2.2 利用臨界點(diǎn)進(jìn)行補(bǔ)料

流加補(bǔ)料-分批發(fā)酵[19-23]是現(xiàn)代發(fā)酵工程普遍采用的方式,可以較好地解決底物阻遏,按設(shè)備能力供氧,減緩代謝有害物的不利影響;尤其對(duì)于基因工程菌高密度發(fā)酵,流加補(bǔ)料是實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵必不可少的手段。流加補(bǔ)料技術(shù)的關(guān)鍵是對(duì)補(bǔ)料時(shí)機(jī)的把握,利用發(fā)酵尾氣分析曲線(xiàn)中的臨界點(diǎn)能夠比較精準(zhǔn)地掌控補(bǔ)料時(shí)機(jī)。

某大型藥企在重組大腸桿菌培養(yǎng)白細(xì)胞介素-Ⅱ生產(chǎn)過(guò)程中,在1 t生產(chǎn)罐上應(yīng)用FGA發(fā)酵尾氣分析儀,監(jiān)測(cè)尾氣變化,其發(fā)酵過(guò)程CER曲線(xiàn)如圖2所示。由圖2可以看出CO2的整體變化規(guī)律:1) 發(fā)酵開(kāi)始后,CER先有極短的平緩區(qū),很快在1 h 32 min時(shí)曲線(xiàn)出現(xiàn)快速上升的臨界點(diǎn),預(yù)示重組大腸桿菌生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,此時(shí)開(kāi)始流加補(bǔ)料,并根據(jù)DO反饋值調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速,保持DO在較高水平。2) 在CER迅速上升的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,逐漸提高流加補(bǔ)料速率,在達(dá)到峰值，出現(xiàn)臨界點(diǎn)時(shí),流加速率達(dá)到最大。3) 在發(fā)酵后期,補(bǔ)料速率維持在某一穩(wěn)定水平,直至發(fā)酵結(jié)束。整個(gè)發(fā)酵過(guò)程約10 h,產(chǎn)物表達(dá)量占菌體總蛋白的40%。發(fā)酵過(guò)程中對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期起點(diǎn)和終點(diǎn)(臨界點(diǎn))的出現(xiàn)都發(fā)生在1 min內(nèi),如非采用實(shí)時(shí)連續(xù)在線(xiàn)檢測(cè)是難以觀(guān)察到的。

圖2 重組大腸桿菌培養(yǎng)白細(xì)胞介素-ⅡCER曲線(xiàn)

2.2.3 利用臨界點(diǎn)進(jìn)行誘導(dǎo)

在重組大腸桿菌發(fā)酵過(guò)程中,通常采用IPTG誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)。IPTG誘導(dǎo)劑具有一定毒性,對(duì)宿主和代謝產(chǎn)物有抑制作用,且費(fèi)用高昂,在工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)中較難推廣。乳糖是一種廉價(jià)資源,可以作為碳源被大腸桿菌代謝利用,有報(bào)道在重組蛋白培養(yǎng)中用其作誘導(dǎo)劑,但尚不普遍,究其原因,除誘導(dǎo)機(jī)理復(fù)雜外,乳糖誘導(dǎo)時(shí)機(jī)不易把握也是重要因素。

張毅等[24]在LB培養(yǎng)基中,分別在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的早期、中期以及后期對(duì)融合蛋白表達(dá)菌BL21(DE3)(pFu)進(jìn)行乳糖誘導(dǎo),發(fā)現(xiàn)：乳糖的加入會(huì)造成菌體生長(zhǎng)遲滯,在早期、中期進(jìn)行誘導(dǎo)均不理想,只有在后期進(jìn)行誘導(dǎo)效果最佳,此時(shí)既可以得到較高的表達(dá)產(chǎn)物,又可以獲得較高的菌體密度。有研究報(bào)道[22-30]表明:在培養(yǎng)基葡萄糖剛剛耗盡,細(xì)胞濃度增加緩慢或略有下降時(shí)開(kāi)始誘導(dǎo),效果最佳。

應(yīng)用發(fā)酵尾氣分析技術(shù),可以直觀(guān)地辨識(shí)菌體生長(zhǎng)的各個(gè)階段。一般在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的后期,即培養(yǎng)基中葡萄糖剛剛耗盡,細(xì)胞濃度增加緩慢或略有下降時(shí),尾氣分析的CER曲線(xiàn)會(huì)出現(xiàn)一個(gè)由上升轉(zhuǎn)為下降的臨界點(diǎn),利用該臨界點(diǎn)可以方便地確定誘導(dǎo)時(shí)機(jī),及時(shí)進(jìn)行乳糖誘導(dǎo)。

2.2.4 利用臨界點(diǎn)處理異常發(fā)酵

雖然微生物發(fā)酵是一個(gè)非線(xiàn)性時(shí)變系統(tǒng),包含了生物、化學(xué)及物理的各種變化,過(guò)程較為復(fù)雜,但是當(dāng)各種條件固定后,微生物細(xì)胞代謝又遵循一定的規(guī)律。從發(fā)酵尾氣分析得到的大量數(shù)據(jù)來(lái)看,在某種發(fā)酵體系中,當(dāng)工藝條件確定后,其分析曲線(xiàn)整體形態(tài)是確定的,一旦發(fā)生改變,通常預(yù)示著某種代謝的改變。因此,捕捉那些異常臨界點(diǎn),對(duì)異常發(fā)酵的及早發(fā)現(xiàn)和處理很有意義,特別是對(duì)工業(yè)大生產(chǎn)和高附加值的生物制藥更是如此。就此而言,尾氣分析的敏感性和實(shí)用性均超過(guò)了pH、DO等其他現(xiàn)有檢測(cè)手段。

在廣東某高校進(jìn)行的重組大腸桿菌發(fā)酵藥物蛋白實(shí)驗(yàn)中,發(fā)酵開(kāi)始后,經(jīng)過(guò)短暫的遲緩期,CO2曲線(xiàn)開(kāi)始緩慢上升,約2 h后發(fā)酵快速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期;20 min后,CO2曲線(xiàn)突然出現(xiàn)了下折,CO2體積分?jǐn)?shù)迅速下降,在不到30 min的時(shí)間內(nèi)下降到接種前水平,鏡檢觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)此時(shí)發(fā)酵液中的工程菌已經(jīng)消失,判斷感染了噬菌體,隨即停止發(fā)酵,并迅速進(jìn)行滅菌處理。該實(shí)驗(yàn)過(guò)程的CO2體積分?jǐn)?shù)變化曲線(xiàn)如圖3所示。

圖3 重組大腸桿菌培養(yǎng)蛋白藥物CO2曲線(xiàn)

3 實(shí)時(shí)連續(xù)在線(xiàn)檢測(cè)

3.1 實(shí)時(shí)連續(xù)在線(xiàn)檢測(cè)的意義

利用發(fā)酵尾氣分析技術(shù),特別是利用分析曲線(xiàn)上的臨界點(diǎn),監(jiān)測(cè)發(fā)酵過(guò)程中細(xì)胞的代謝變化,可以為發(fā)酵操作及進(jìn)一步工藝優(yōu)化提供依據(jù)。發(fā)酵尾氣分析技術(shù)的關(guān)鍵在于對(duì)發(fā)酵過(guò)程中尾氣的CO2及O2進(jìn)行實(shí)時(shí)連續(xù)在線(xiàn)監(jiān)測(cè),只有這樣才能捕捉到發(fā)酵狀態(tài)改變的臨界點(diǎn),監(jiān)測(cè)到細(xì)胞代謝狀態(tài)的改變。由于發(fā)酵過(guò)程中臨界點(diǎn)的出現(xiàn)和狀態(tài)的改變往往發(fā)生在極短的時(shí)間內(nèi),所以實(shí)時(shí)連續(xù)在線(xiàn)檢測(cè)尤為重要。

3.2 采用單通道確保實(shí)時(shí)連續(xù)在線(xiàn)檢測(cè)

隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展,發(fā)酵尾氣分析所采用的各檢測(cè)部件本身的響應(yīng)時(shí)間非常短,一般在毫秒級(jí),但從發(fā)酵罐排氣口到檢測(cè)腔,尾氣的傳輸需要時(shí)間,相比之下檢測(cè)時(shí)間可忽略不計(jì),故完成一次檢測(cè)的時(shí)間主要取決于尾氣的傳輸時(shí)間。

雖然采用一套檢測(cè)部件加轉(zhuǎn)換開(kāi)關(guān)對(duì)多套發(fā)酵設(shè)備分時(shí)切換輪巡檢測(cè)的方式,可以實(shí)現(xiàn)一套尾氣分析系統(tǒng)測(cè)定多點(diǎn)尾氣,降低發(fā)酵設(shè)備的平均成本,但是在切換過(guò)程中,氣路轉(zhuǎn)換無(wú)法瞬間完成,必須反復(fù)用后一通道的尾氣頂出前一通道的尾氣,會(huì)造成尾氣混合帶來(lái)檢測(cè)誤差,此外還存在傳輸時(shí)間長(zhǎng)、信號(hào)延時(shí)等問(wèn)題，也增加了染菌風(fēng)險(xiǎn)。因此,在進(jìn)行發(fā)酵尾氣分析檢測(cè)時(shí),應(yīng)該采用獨(dú)立的單通道檢測(cè),即一套檢測(cè)設(shè)備連接一個(gè)發(fā)酵罐,唯有采用此方式才可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)連續(xù)在線(xiàn)檢測(cè),捕捉到那些極其重要的臨界點(diǎn)。

4 結(jié) 論

應(yīng)用發(fā)酵尾氣分析技術(shù)可以深入了解細(xì)胞的代謝狀況。分析曲線(xiàn)上的“臨界點(diǎn)”往往反映了發(fā)酵過(guò)程狀態(tài)的改變,對(duì)研究發(fā)酵工藝至關(guān)重要。要捕捉這些臨界點(diǎn)就需要進(jìn)行實(shí)時(shí)連續(xù)在線(xiàn)檢測(cè),唯有采用獨(dú)立的單通道檢測(cè)方能做到。目前,發(fā)酵尾氣分析技術(shù)日臻成熟,尾氣分析裝置也成為發(fā)酵罐的標(biāo)準(zhǔn)配置。隨著設(shè)備的普及和尾氣分析在多方面應(yīng)用的深入開(kāi)展,業(yè)界對(duì)其應(yīng)用效果的期望愈來(lái)愈高,單通道檢測(cè)在發(fā)酵尾氣分析中的意義會(huì)日益清晰明了，該檢測(cè)方式有望被業(yè)界廣泛接受。