劉浩星,王殿軒*,王 甜,黃依林,唐培安

(1.河南工業(yè)大學(xué)糧食和物資儲備學(xué)院,國家糧食產(chǎn)業(yè)(倉儲害蟲防控)技術(shù)創(chuàng)新中心,糧食儲運國家工程研究中心,鄭州 450001;2.江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心,南京 210023)

糧食產(chǎn)后儲藏中害蟲為害造成的損失備受關(guān)注,一些發(fā)展中國家因儲糧害蟲造成的糧食損失率達(dá)9%～20%[1],我國糧食儲藏中害蟲防治也受到高度重視。儲糧害蟲直接取食造成糧食數(shù)量和品質(zhì)損失,也會造成糧食的市場價值損失等[2]。適時有效地檢測儲糧害蟲,監(jiān)測其發(fā)生狀態(tài)是科學(xué)防治害蟲的重要基礎(chǔ)。對糧食里面可活動或可見到的害蟲進(jìn)行檢測的方法已有較多研究和應(yīng)用[3-8],對糧食隱蔽性害蟲的檢測方法也有報道和一定應(yīng)用[9],但總體上處于探討多應(yīng)用少。谷物中隱蔽性害蟲可直接取食原糧,在糧粒內(nèi)部生長發(fā)育,當(dāng)其從糧粒內(nèi)羽化出后,糧粒已受到嚴(yán)重為害,因此通常將隱蔽性害蟲列為嚴(yán)重危害性害蟲[10]。隱蔽性害蟲的幼蟲在內(nèi)部蛀食糧粒后,受損的糧粒及產(chǎn)生的粉屑為不能蛀食完整糧粒的后期性害蟲發(fā)生提供了有利條件,后期性害蟲取食粗屑糧后更加劇了糧食數(shù)量和質(zhì)量損失,大量害蟲代謝產(chǎn)生的熱量和水分會加速糧情惡化,引起霉變,甚至產(chǎn)生真菌毒素[2,11-13]。隱蔽性害蟲藏于糧粒內(nèi),常規(guī)的檢測不易發(fā)現(xiàn)它們[10,14],可以說隱蔽性害蟲是糧食受損和影響食品安全的重要因素[15]。對隱蔽性害蟲進(jìn)行及時、有效、快速的檢測對減少其發(fā)生和為害具有重要意義[1],是減少和避免糧食蟲害的重要措施。我國現(xiàn)行糧油儲藏技術(shù)規(guī)范GB/T29890中也將玉米象Sitophiluszeamais(Motschulsky)這類幼蟲隱藏于糧粒內(nèi)嚴(yán)重為害的昆蟲列為主要儲糧害蟲[16]。

已報道的檢測糧粒中隱蔽性害蟲的方法有剖粒檢測法[17-18]、聲學(xué)檢測法、ELISA檢測法、近紅外檢測法、X射線檢測法、PCR檢測法等[1,9,14,19-21],這些方法有的操作過程繁瑣,有的受環(huán)境干擾大,有的不便現(xiàn)場使用,有的設(shè)備價格昂貴不便推廣,有的在害蟲密度低時檢測效果差[22-23]以致缺乏實際應(yīng)用?！皣覙?biāo)準(zhǔn)GB/T24534.4-2009,谷物與豆類隱蔽性昆蟲感染的測定 第4部分:快速方法”[24]采用了ISO6639.4 Cereals and pulses-determination of hidden insect infestation -part 4:rapid methods的方法[25],其中主要推薦了二氧化碳(CO2)測定法、茚三酮法、整粒糧漂浮法、聲音測定法、X射線法等。研究表明一定條件下害蟲的活動會使環(huán)境中CO2濃度升高,通過CO2濃度變化可監(jiān)測害蟲發(fā)生[26-28]。在GB/T24534.4-2009或ISO6639.4-1987中,推薦采用玻璃儀器與化學(xué)試劑結(jié)合使用的氣體定量分析法和近紅外分析儀結(jié)合電位記錄儀的紅外氣體分析法來檢測CO2濃度,提出了CO2濃度值與害蟲感染度的大致關(guān)系,根據(jù)CO2濃度范圍將害蟲感染程度劃分為輕度、一般、嚴(yán)重感染等[24]。其方法中缺少害蟲感染后的發(fā)育階段與CO2濃度的關(guān)系,明確這一關(guān)系可更好地檢測預(yù)測害蟲發(fā)生狀態(tài)。與前述微環(huán)境中用化學(xué)法和近紅外分析法分析CO2濃度相比,CO2檢測儀快速檢測技術(shù)更加經(jīng)濟(jì)、方便,尤其近十年來得到迅速發(fā)展[29-30]。本文借鑒GB/T24534.4-2009(ISO6639.4)推薦的微環(huán)境容器容積,用CO2快速檢測儀并改進(jìn)為循環(huán)取樣檢測方式，測定了不同溫度下感染不同密度玉米象卵后小麥微環(huán)境中CO2濃度變化,分析了玉米象發(fā)生狀態(tài)與CO2濃度變化關(guān)系,以期為建立新的快速簡便方法有效檢測隱蔽性害蟲提供參考。

1 材料與方法

1.1 小麥

試驗用小麥為白皮硬質(zhì)冬小麥,品種為‘西農(nóng)979’,容重755 g/L,試驗前清除雜質(zhì)與不完善粒,在60℃處理2 h滅蟲,并調(diào)節(jié)水分含量至12.5%。

1.2 試蟲

試驗用的玉米象采自河南省鄭州市的糧庫,后在河南工業(yè)大學(xué)儲藏物昆蟲研究室以小麥為飼料在(28±1)℃、RH(70±5)% 條件培養(yǎng)了數(shù)代。試驗前,在大口玻璃瓶中裝入1 kg水分含量13%的無蟲小麥,接入羽化14 d的成蟲5 000頭使其產(chǎn)卵于小麥中,24 h后移出成蟲。將感染蟲卵的小麥采用酸性品紅染色法處理[31],在雙目體視顯微鏡下挑取帶有卵斑的小麥作為帶蟲卵小麥。經(jīng)前期多批次將帶蟲卵小麥培養(yǎng)至幼蟲期,再抽樣剖粒檢驗其中幼蟲出現(xiàn)情況,確認(rèn)采用上述方法帶蟲卵小麥的染蟲率為95%以上。

1.3 微環(huán)境與檢測條件

采用高140 mm、瓶身外直徑80 mm、瓶口內(nèi)直徑76 mm、容積750 mL的透明玻璃瓶配置硅膠塞加蓋設(shè)置容器環(huán)境。在密封塞上穿2個孔密封設(shè)置直徑5 mm的塑料管,其瓶外端分別連接CO2氣體檢測儀的進(jìn)氣和出氣端口,瓶內(nèi)端分別開口于瓶內(nèi)糧食上部空間和瓶底部(圖1)。CO2氣體檢測儀型號為MS-400,深圳市逸云天電子有限公司生產(chǎn)。量程為0～10 000 mL/m3,精度±0.01% FS,氣體流量為500 mL/min,響應(yīng)時間為30 s。經(jīng)氣密性測試,試驗微環(huán)境的正壓500 Pa的壓力半衰期大于2 min。

圖1 微環(huán)境容器及CO2濃度檢測裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of CO2 monitoring device and microenvironment container

1.4 樣品設(shè)置

參照GB/T29890-2013糧油儲藏技術(shù)規(guī)范中蟲糧等級推薦值[16]設(shè)置樣品。玻璃瓶中先裝入無蟲小麥500 g,再按照0、5、10、20粒/kg的密度混入帶蟲卵小麥(每粒糧帶1粒卵,文中用害蟲頭數(shù)計,即 頭/kg)。分別裝箱置于20、25、30℃的環(huán)境中,每隔12 h檢測CO2濃度。同時,另設(shè)同條件下足量帶蟲卵小麥于同環(huán)境中對照培養(yǎng),用以參照檢查玉米象發(fā)育期。每個處理設(shè)3個重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel進(jìn)行統(tǒng)計,用IBM SPSS Statistics軟件進(jìn)行單因素方差分析,用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同微環(huán)境中CO2濃度的變化

3個試驗溫度下在0.5 d檢測時,混入帶蟲卵小麥的微環(huán)境中CO2濃度從0.04%升高至0.053%～0.055%,說明所用方法可檢測微小環(huán)境中糧食以及蟲卵微弱呼吸時產(chǎn)生CO2的濃度變化,但感染害蟲的樣品與對照試驗環(huán)境相比,CO2濃度變化差異不顯著。

隨著玉米象卵的發(fā)育,CO2濃度發(fā)生了顯著變化,在不同溫度的微環(huán)境中,CO2濃度顯著升高的時間明顯不同,20℃,感染5、10頭/kg和20 頭/kg蟲卵的小麥微環(huán)境中,CO2濃度首次顯著升高的時間分別為18.5、18 d和15.5 d,在25℃下分別為12、8.5 d和6.5 d,在30℃下分別為7、5 d和2 d。在相同溫度下各個微環(huán)境中CO2濃度顯著升高的時間隨感染害蟲的密度增大顯著縮短。0.5～34 d期間,感染不同密度害蟲的微環(huán)境中CO2濃度顯著升高的次數(shù)差異明顯,在20℃時對應(yīng)地為2、6次和7次,在25℃時對應(yīng)地為11、12次和14次,在30℃時對應(yīng)地為13、19次和23次。此過程中,同一溫度下微環(huán)境中CO2濃度顯著升高次數(shù)隨害蟲感染密度增大而增加,相同感染密度下,隨溫度升高CO2顯著升高次數(shù)也相應(yīng)增多。

在測試過程中,不同溫度和害蟲密度下,CO2濃度達(dá)到峰值的時間和大小也有明顯差異。20℃時感染5、10頭/kg和20 頭/kg蟲卵的微環(huán)境中CO2濃度峰值均出現(xiàn)在34 d時,分別達(dá)0.069 7%、0.112 4%和0.128 5%(表1);25℃時對應(yīng)卵密度下CO2的濃度相應(yīng)達(dá)到峰值0.189 1%、0.285 4%和0.351 7%(表2)的時間分別為23.5、24.5 d和24.5 d;30℃時對應(yīng)卵密度下CO2的濃度分別達(dá)到峰值0.233 5%、0.266 4%和0.468 3%(表3)的時間相應(yīng)為22、21 d和20.5 d。總體表現(xiàn)為20℃時微環(huán)境中CO2濃度峰值小,峰值出現(xiàn)時間晚,且不同害蟲密度之間的差異比較小。溫度25℃和30℃時微環(huán)境中CO2濃度峰值相應(yīng)增大,峰值出現(xiàn)時間前移,相同卵密度環(huán)境下CO2濃度峰值也因溫度升高而升高。此過程中無蟲卵感染的小麥微環(huán)境中CO2濃度變化不明顯。

表1 20℃時小麥微環(huán)境中感染不同密度玉米象卵后不同發(fā)育時期的CO2濃度 1)Table 1 CO2 concentration in the wheat microenvironment corresponded to different developmental stages and densities of Sitophilus zeamais at 20℃

從總體CO2濃度變化趨勢看,30℃時檢測期內(nèi)感染害蟲的小麥微環(huán)境中CO2濃度為達(dá)到第1個峰值后出現(xiàn)下降又上升的過程,即相應(yīng)的CO2濃度從峰值降至0.054 4%、0.067 2%和0.066 2%的谷值,而后又上升至0.094 3%、0.164 9%和0.205 7%。25℃時各卵密度下環(huán)境中CO2濃度在檢測期內(nèi)達(dá)到峰值后只出現(xiàn)了下降趨勢,至第34天時CO2濃度分別降至0.052 5%,0.062 3%,0.065 4%。20℃的微環(huán)境中檢測期內(nèi)CO2濃度一直處于增加中?？傮w上CO2濃度變化趨勢與溫度及糧粒內(nèi)害蟲蟲態(tài)有關(guān),20℃低溫下害蟲發(fā)育速度較慢,一直處于卵至幼蟲的發(fā)育中,呼吸代謝產(chǎn)生CO2量少且增長慢,溫度升高至25℃時,糧粒內(nèi)害蟲發(fā)育速度加快,大齡幼蟲數(shù)量增多,產(chǎn)生CO2量增大,而且幼蟲發(fā)育到了代謝量較小的蛹期,故而又出現(xiàn)CO2濃度再次降低的趨勢。溫度達(dá)到30℃時,幼蟲發(fā)育更快,測試期間發(fā)育到了成蟲期,故而出現(xiàn)CO2濃度下降再升高的過程。

表2 25℃時小麥微環(huán)境中感染不同密度玉米象卵后不同發(fā)育時期的CO2濃度Table 2 CO2 concentration in the wheat microenvironment corresponded to different developmental stages and densities of Sitophilus zeamais at 25℃

表3 30℃時小麥微環(huán)境中感染不同密度玉米象卵后不同發(fā)育時期的CO2濃度Table 3 CO2 concentration in the wheat microenvironment corresponded to different developmental stages and densities of Sitophilus zeamais at 30℃

續(xù)表3 Table 3(Continued)

2.2 不同溫度下玉米象發(fā)育期與微環(huán)境中CO2濃度變化關(guān)系

總體上,在玉米象發(fā)育過程中,卵為不取食蟲態(tài),代謝產(chǎn)生CO2量微小,相應(yīng)微環(huán)境中CO2濃度變化不顯著。進(jìn)入幼蟲期后,隨著蟲齡增加、害蟲個體增大,取食和代謝量相應(yīng)增加,CO2濃度隨之增加。由于溫度高時害蟲生長發(fā)育加快,代謝產(chǎn)生的CO2量更多,因此CO2濃度增加更快。進(jìn)入蛹期后代謝率降低故而微環(huán)境中CO2濃度再次降低。溫度30℃時的檢測末期(第29天前后),蛹羽化出成蟲后,因其取食代謝再次升高,CO2濃度又有升高。見表1～表3。

2.2.120℃時幼蟲發(fā)育較慢,微環(huán)境中CO2濃度一直處于上升中

表1顯示,溫度20℃時,當(dāng)玉米象從卵發(fā)育到1齡幼蟲時,密度為5頭/kg和10頭/kg的小麥微環(huán)境中CO2濃度增加不明顯,而20頭/kg的小麥微環(huán)境中CO2濃度變化較為明顯。當(dāng)玉米象發(fā)育至2齡幼蟲時3個密度微環(huán)境中CO2濃度均顯著增加。玉米象發(fā)育至3齡幼蟲時,密度為5頭/kg的微環(huán)境中CO2濃度與2齡幼蟲期時相比增加不明顯,密度10頭/kg和20頭/kg的微環(huán)境中CO2濃度比2齡幼蟲期有顯著性增加。玉米象發(fā)育至4齡幼蟲時,密度5頭/kg的微環(huán)境中的CO2濃度增加不明顯,10頭/kg和20頭/kg微環(huán)境中的CO2濃度則均較前面齡期有顯著增加。

2.2.225℃時幼蟲發(fā)育至蛹期,微環(huán)境中CO2濃度上升又有下降

表2顯示,溫度25℃時,1齡幼蟲期內(nèi)3個密度微環(huán)境中的CO2濃度均有顯著增加,同一時間不同密度樣品間的CO2濃度差異顯著。在2齡、3齡和4齡幼蟲期內(nèi),微環(huán)境中CO2濃度均較對應(yīng)的前一齡期顯著增加,同齡期不同密度的微環(huán)境中CO2濃度差異顯著。至4齡幼蟲及其后期,微環(huán)境的CO2濃度又有降低。至蛹期時,微環(huán)境中CO2濃度與卵期的值相近。

2.2.330℃時幼蟲發(fā)育到蛹再至成蟲羽化,微環(huán)境中CO2濃度出現(xiàn)上升下降再上升

表3顯示,溫度30℃時,1齡幼蟲期內(nèi),3個蟲口密度微環(huán)境中CO2濃度均有顯著增加,且增幅更大。2齡幼蟲期內(nèi),5頭/kg的微環(huán)境中的CO2濃度與其前期相比增加不明顯,10頭/kg和20頭/kg的微環(huán)境中CO2濃度則增加顯著。3齡幼蟲期內(nèi),3個密度微環(huán)境中CO2濃度增加更加顯著。4齡幼蟲期內(nèi),其前期微環(huán)境CO2濃度繼續(xù)增加,后期在化蛹進(jìn)程中微環(huán)境CO2濃度又有降低,至蛹期時降至最低值,再后又隨新羽化且暫隱藏于糧粒內(nèi)的成蟲出現(xiàn)再度增高。

3 結(jié)論與討論

干燥儲藏的谷物通常自身呼吸代謝率低,密閉環(huán)境中產(chǎn)生的CO2量也很微小,當(dāng)其中有害蟲感染時,昆蟲的呼吸代謝會促使密閉環(huán)境中CO2濃度顯著升高,借此可通過CO2濃度變化檢測隱蔽性害蟲的發(fā)生。《GB/T24534.4-2009 谷物與豆類隱蔽性昆蟲感染的測定 第4部分:快速方法》中推薦了玻璃儀器組成的裝置與化學(xué)試劑結(jié)合使用的氣體定量分析法,以及近紅外分析儀結(jié)合電位記錄儀的紅外氣體分析法,來檢測與本研究中同容積微環(huán)境中的CO2濃度變化。在氣體定量分析法中,微環(huán)境封閉24 h時CO2濃度小于等于0.2%視為無感染,濃度在0.3%～0.5%、0.6%～0.9%和大于等于1.0%時分別視為輕度、輕度至中度和重度感染。在紅外氣體分析法中,每千克樣品產(chǎn)生CO2速率小于等于1.1 μL/min視為無感染,速率在1.0～1.9、2.0～3.9、4.0～5.9 μL/min 和大于等于6 μL/min時分別視為輕度、輕度至中度和重度感染,這兩個方法中均未明確測定濃度條件下感染的害蟲發(fā)育期和感染害蟲密度。本研究試驗溫度和感染密度下，當(dāng)玉米象發(fā)育處于卵期時,CO2濃度變化均不顯著。溫度20℃時,小麥中玉米象密度5、10頭/kg和20 頭/kg的處理在玉米象進(jìn)入幼蟲期時CO2濃度分別于18.5、18 d和15.5 d第1次出現(xiàn)顯著升高;溫度25℃時,CO2濃度分別于12、8.5 d和6.5 d出現(xiàn)第1次顯著升高;溫度30℃時,CO2濃度分別于7、5 d和2 d時第1次出現(xiàn)顯著升高。實際類似環(huán)境中,可通過相近時期CO2濃度的類似變化,參考本結(jié)果推算糧食中隱蔽性害蟲尤其是玉米象的發(fā)生狀態(tài)。

玉米象可在田間感染小麥等谷物[32],收獲入倉后其卵、幼蟲、蛹和成蟲初期均隱藏于糧粒內(nèi),至其在糧粒內(nèi)成蟲羽化時,籽粒幾乎被完全損毀。害蟲密度較大時蛀食造成數(shù)量損失嚴(yán)重,被蛀糧粒的質(zhì)量也受到嚴(yán)重影響。對新收獲入倉的糧食中的隱蔽性害蟲進(jìn)行檢測,有助于有計劃地指導(dǎo)科學(xué)入倉管理和后期及時防治。在已報道的隱蔽性害蟲檢測方法[17-21]中CO2檢測法是一種快速的檢測方法[33]。本研究采用便攜式CO2快速檢測儀(一種用于檢測隱蔽性害蟲的裝置,專利號:ZL201921286028.0)結(jié)合循環(huán)取氣檢測,更加便捷迅速,循環(huán)取氣檢測對濃度值影響也較小,在操作的方便性、經(jīng)濟(jì)性、有效性方面更有優(yōu)勢。研究結(jié)果初步明確了CO2濃度變化與害蟲發(fā)生期、害蟲發(fā)生密度及環(huán)境溫度之間的關(guān)系,可通過檢測微環(huán)境CO2濃度掌握糧食中隱蔽性害蟲的發(fā)生情況。