驢食草酚調控ERK1/2和p38 MAPK信號通路防治潰瘍性結腸炎的研究

馬沛廣,李秋逸,劉佳靜,李 娜,董瑞娟,葛東宇,彭桂英

(1. 北京中醫(yī)藥大學生命科學學院，北京 100029；2. 北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，北京 100029)

潰瘍性結腸炎是一種特發(fā)性、慢性結腸黏膜炎癥性疾病，其主要臨床表現(xiàn)為反復發(fā)生的腸道潰瘍，同時伴有腹痛、腹瀉、黏液膿血便等，常反復發(fā)作[1]。該病的發(fā)病機制尚不明確，可能與遺傳因素、環(huán)境因素、自身免疫和腸道微生物有關[2]。中醫(yī)學認為該病多由脾胃運化功能失調、濕熱內蘊，為氣血搏結、化為膿血所致，與中醫(yī)的“痢疾”“腸癖”相近[3]。相關研究表明，含甘草的藥物如復方甘草酸、甘草瀉心湯聯(lián)合西藥治療潰瘍性結腸炎可起到標本兼治的作用[4-5]。驢食草酚是從甘草中提取出的一種天然的異黃酮類化合物，其可以減少脂多糖或甲基化牛血清白蛋白誘導的中性粒細胞遷移以及巨噬細胞釋放CXCL1/KC和CXCL2/MIP-2，可減少小鼠腸系膜微循環(huán)中白細胞滾動和黏附[3，6]。相關研究發(fā)現(xiàn)驢食草酚在低濃度就顯示出良好的抗炎和抗菌活性，其抗炎作用和地塞米松相當，是一種有前途的新型抗炎劑[6-7]。驢食草酚對潰瘍性結腸炎是否有保護作用，以及其作用機制尚不明確，因此本研究觀察了驢食草酚對潰瘍性結腸炎的干預作用，并從ERK1/2和p38 MAPK信號通路角度探討了其可能作用機制。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性C57BL/6小鼠32只，6～8周齡，體重20～22 g，購自北京斯貝福生物有限公司，生產許可證號：SCXK(京)2011-0004。本實驗經過北京中醫(yī)藥大學試驗動物倫理委員會批準，實驗過程嚴格按照動物倫理相關指導原則進行。小鼠在清潔級動物房飼養(yǎng)，統(tǒng)一光照時間為6:00—18:00，恒溫，恒濕，自由飲水，飼喂固體飼料。適應性喂養(yǎng)7 d后用于正式實驗。

1.2藥物與試劑 驢食草酚(中國成都樂美天，CAS：35878-41-2)；葡聚糖硫酸鈉(美國MP Biomedicals公司，批號：S0433)；柳氮磺吡啶腸溶片(上海信宜天平藥業(yè)公司，國藥準字H31020557)；便隱血試劑(中國BASO公司，批號：BA-2020B)；PBS、D-Hank’s、紅細胞裂解液(中國Solarbio公司，批號：R1010)；胎牛血清(FBS，Hyclone)；膠原酶Ⅲ(Worthington)；Percoll分離液(GE Healthcare)；BCA蛋白測定試劑盒(美國Thermo公司，批號：A53225)；小鼠流式熒光抗體CD45-PB、CD11b-PE-Cy5、Ly6c-APC(美國，BioLegend)；磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)單克隆抗體、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)單克隆抗體、p38 MAPK單克隆抗體、ERK1/2單克隆抗體、GAPDH單克隆抗體(美國CST公司，批號分別為9377S，4511T，8460T，9145T，4967S)；辣根過氧化物酶二抗(美國CST公司，批號：7076S)。

1.3儀器 高壓滅菌鍋；精密天平(中國，ACS-3C型)；搖床(中國，SHIPING)；5415型高速離心機(德國，Eppendorf)；Aperio VERSA超分辨顯微組織成像系統(tǒng)、自動組織脫水機、全自動輪轉式切片機(德國，Leica Biosystems)；流式細胞儀(美國，Beckman Coulter)；電泳儀、電轉儀、GelDoc Go凝膠成像系統(tǒng)(美國，Bio-Rad)；SpectraMax i3x(美國，MD)。

1.4實驗方法 將32只雄性C57BL/6小鼠隨機分為正常組、模型組、驢食草酚組、柳氮磺胺吡啶組，每組8只。除正常組外，其余組小鼠參考文獻[7]方法給予加入3% DSS溶液的飲用水(自由飲用)飼養(yǎng)7 d建立潰瘍性結腸炎模型。從實驗第1天起，每天同一時間點，驢食草酚組按10 mg/kg的劑量給予驢食草酚灌胃，柳氮磺吡啶組按0.5 g/kg的劑量給予柳氮磺胺吡啶灌胃，正常組和模型組給予等量的生理鹽水灌胃，均連續(xù)7 d。

1.5標本采集 末次灌胃后，禁食不禁水12 h，小鼠經2%戊巴比妥鈉深度麻醉后眼球取血，然后處死小鼠，分離結腸組織，測量結腸長度，距肛門4 cm處截取1～2 cm的結腸組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，剩余結腸組織凍存管分裝，液氮速凍后放置于-80 ℃冰箱保存。

1.6觀察指標

1.6.1體重及疾病活動指數(DAI) 每日同一時間測量小鼠體重，觀察糞便性狀、便血情況，按糞便隱血試劑盒說明書進行檢測。記錄實驗結束后各組小鼠體重，計算各組小鼠的DAI。DAI=(體重評分+糞便性狀評分+糞便隱血評分)/3。

1.6.2結腸組織病理學形態(tài) 結腸組織經4%多聚甲醛固定后放入包埋盒中，酒精梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切成厚度為4 μm的切片，二甲苯脫蠟、梯度水化后進行HE染色，中性樹膠封片，晾干后使用光學顯微鏡觀察。

1.6.3血清白細胞介素(IL)-17A含量 眼球取血常溫靜置2 h，待血液凝固血塊收縮后，4 000 r/min離心10 min，取上清于干凈的離心管中，放置冰上備用。根據ELISA試劑盒說明書檢測血清中IL-17A含量。

1.6.4結腸組織中中性粒細胞比例 取小鼠結腸組織，將組織剪成小塊，用含5 mmol/L EDTA的D-Hank’s洗滌2次，每次20 min，置于1 mg/mL膠原酶Ⅲ的RPMI1640溶液中消化60 min后，經70 μm的細胞篩過濾，離心收集細胞沉淀，經冷PBS洗滌2次后，重懸于40%Percoll分離液中進行梯度離心，沉淀細胞用紅細胞裂解液裂解，冷PBS洗滌2次，重懸于含0.5%BSA的PBS溶液中計數。調整細胞濃度為1×106個/mL，加入anti-mouse CD45、anti-mouse CD11b、anti-mouse Ly6C熒光抗體冰上避光孵育30 min，最后用含0.5%BSA的PBS洗滌2次后重懸，上流式細胞儀檢測。框門策略：CD45+CD11b+Ly6C+。

1.6.5結腸組織中p-ERK1/2、p-p38 MAPK、ERK1/2、p38 MAPK表達情況 采用Western blot法檢測：取已加入RIPA裂解液、COCKTAIL、PMSF 蛋白酶抑制劑的結腸組織勻漿液，13 000 r/min離心40 min，取20 μL上清液用于檢測蛋白濃度，剩余量加入相應體積的蛋白上清緩沖液(Loading buffer)振蕩混勻。加熱使蛋白變性后待其自然冷卻，分裝。取24 μg蛋白上樣，電泳、轉膜、封閉后，分別用5%BSA 按1∶1 000的比例稀釋p-ERK1/2、p-p38 MAPK、ERK1/2、p38 MAPK抗體,4 ℃搖床孵育過夜，用5% BSA 按1∶5 000 的比例稀釋IgG二抗，搖床室溫孵育1.5 h，TBST清洗后，滴入顯影液在凝膠成像系統(tǒng)成像，采用Image J 1.52v 軟件進行定量分析，用內參GAPDH計算蛋白相對表達量。

1.7統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量數據如果符合正態(tài)分布，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，利用LSD檢驗進行多重比較。若數據不符合正態(tài)分布，則采用非參數檢驗中的Kruskal-wallis分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1各組小鼠體重、結腸長度及DAI比較 模型組小鼠體重明顯低于正常組(P<0.05)，結腸長度明顯短于正常組(P<0.05)，DAI明顯高于正常組(P<0.05)；驢食草酚組和柳氮磺吡啶組小鼠體重均明顯高于模型組(P均<0.05)，結腸長度明顯長于模型組(P<0.05)，DAI明顯低于模型組(P<0.05)，且驢食草酚組小鼠DAI明顯低于柳氮磺吡啶組(P<0.05)，但2組小鼠體重和結腸長度比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 正常組和潰瘍性結腸炎各組小鼠體重、結腸長度及DAI比較

2.2各組小鼠結腸組織HE染色病理形態(tài) 正常組小鼠結腸黏膜組織結構完整，無充血水腫，腺體和杯狀細胞排列規(guī)則，無炎性細胞浸潤及潰瘍形成；模型組小鼠結腸黏膜組織結構破損，腺體排列紊亂，部分壞死、消失，隱窩腫脹，杯狀細胞破壞減少，同時有大量炎性細胞浸潤；驢食草酚組及柳氮磺胺吡啶組小鼠結腸黏膜上皮組織增生修復，腺體及杯狀細胞數目增多，排列較為整齊，炎細胞浸潤明顯減少。見圖1。

圖1 正常組和潰瘍性結腸炎各組小鼠結腸組織HE染色病理形態(tài)(×100)

2.3各組小鼠血清IL-17A含量和結腸組織中中性粒細胞比例比較 模型組小鼠血清IL-17A含量和結腸組織中中性粒細胞比例均明顯高于正常組(P均<0.05)；驢食草酚組和柳氮磺吡啶組小鼠血清IL-17A含量和結腸組織中中性粒細胞比例均明顯低于模型組(P均<0.05)，驢食草酚組和柳氮磺吡啶組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 正常組和潰瘍性結腸炎各組小鼠血清IL-17A含量和結腸組織中中性粒細胞比例比較

2.4各組小鼠結腸組織中p38 MAPK和ERK1/2信號通路因子表達情況 模型組小鼠結腸組織中p-ERK1/2/ERK1/2和p-p38 MAPK/p38 MAPK比值均明顯高于正常組(P均<0.05)，驢食草酚組和柳氮磺吡啶組均明顯低于模型組(P均<0.05)，驢食草酚組和柳氮磺胺吡啶組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見圖2及表3。

圖2 正常組和潰瘍性結腸炎各組小鼠結腸組織中p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-ERK1/2、ERK1/2、GAPDH蛋白表達情況

表3 正常組和潰瘍性結腸炎各組小鼠結腸組織中p-p38 MAPK、p-ERK1/2蛋白相對表達量比較

3 討 論

潰瘍性結腸炎是一種發(fā)病率較高的結直腸慢性非特異性炎癥性疾病，其病變部位主要局限在大腸黏膜及黏膜下層。世界衛(wèi)生組織根據該病病程長、遷延難愈、易癌變的特點，將其列為消化內科的難治病之一[1]。在過去幾年中，潰瘍性結腸炎在全球范圍內的發(fā)生率不斷增高，但不同地區(qū)的患病率存在明顯差異，如在亞洲人群中，患病率為5.3～63.6/10萬，而北美的患病率為37.5～238/萬[8]。潰瘍性結腸炎已然成為一個重要的社會公共問題，因此迫切需要開展對該病的療效和機制研究。

目前臨床上治療潰瘍性結腸炎仍然以氨基水楊酸類、糖皮質激素、免疫抑制劑和生物制劑等西藥治療為主，短期效果較好，但是長期使用會出現(xiàn)明顯不良反應、耐藥、易復發(fā)等問題。中醫(yī)藥治療潰瘍性結腸炎顯示出明顯優(yōu)勢，其中甘草瀉心湯應用較多，相關研究證實其具有抗?jié)?、調節(jié)黏膜分泌和機體免疫功能的作用，被稱為黏膜修復劑[5，9]。甘草為甘草瀉心湯的主藥，而驢食草酚是從甘草中提取的有效成分，故本研究探討了其對潰瘍性結腸炎的潛在作用。

p38 MAPK是MAPK家族的重要成員[10]，廣泛存在于各種組織中。在生理條件下，p38 MAPK主要位于細胞質中，且活性很低；病理條件下，它可以被各種細胞因子[腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-1]、脂多糖、應激刺激(如熱休克、高滲性損傷、缺血再灌注)激活，促進TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等促炎細胞因子的產生，進而增強炎癥反應；且p38 MAPK可以介導中性粒細胞的激活，顯著增強中性粒細胞呼吸爆發(fā)效應，從而導致持續(xù)的炎癥反應和損傷[11]。p38 MAPK還可以促進細胞內誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的產生，上調細胞內一氧化氮(NO)的表達，引起炎癥和組織損傷[12]。Ren等[13]報道，p38 MAPK可通過磷酸化NF-κB上游組蛋白H3和IKK或NF-κB p65活性，促進炎癥細胞因子的釋放。ERK1/2是最經典的MAPK之一[14]，激活ERK1/2通路可引起多種促炎細胞因子如TNF-α、IL-6、IL-8等表達，參與炎癥反應的調節(jié)[15]。許多研究發(fā)現(xiàn)ERK1/2在潰瘍性結腸炎結腸組織中高表達，ERK1/2通路與潰瘍性結腸炎發(fā)病密切相關[16]。

IL-17A和IL-17F是IL-17家族的主要成員，活動期炎癥性腸病患者的血漿和腸黏膜均高表達IL-17A[17]。IL-17A和IL-17F與細胞表面受體IL-17RA、IL-17RC結合，通過Act1、TRAF6進而激活NF-κB、MAPK、C/EBP等信號通路，刺激內皮細胞產生IL-6、IL-8、TNF-α、粒細胞-巨噬細胞刺激因子等，介導炎癥反應[18]。中性粒細胞在潰瘍性結腸炎的發(fā)病中起著重要作用，中性粒細胞在IL-17A的作用下向結腸病變位置遷移，引起一系列腸道疾病[19]。在炎癥反應中，IL-17A對中性粒細胞的招募至關重要，同時中性粒細胞也可以分泌產生IL-17A[20-21]。近年研究認為中性粒細胞浸潤是潰瘍性結腸炎活動期的重要標志[22]，因此抑制中性粒細胞浸潤可能成為治療潰瘍性結腸炎的重要靶點。

本實驗結果顯示，驢食草酚組小鼠體重明顯高于模型組，結腸長度明顯長于模型組，DAI明顯低于模型組，結腸組織損傷程度明顯減輕，血清IL-17A含量、結腸組織中中性粒細胞比例、結腸組織中p-ERK1/2/ERK1/2和p-p38 MAPK/p38 MAPK比值均較模型組低。由此推測驢食草酚可能通過下調p38 MAPK和ERK1/2的磷酸化表達，抑制IL-17A分泌與中性粒細胞遷移，從而減輕炎癥反應和結腸組織損傷。驢食草酚的抗炎特性具有潛在的臨床應用價值，值得進一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。