不同生長(zhǎng)階段白花蛇舌草高效液相色譜指紋圖譜及化學(xué)模式識(shí)別

黃家輝

（中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九○○醫(yī)院藥劑科，福建 福州 350000）

白花蛇舌草屬茜草科植物白花蛇舌草Hedyotis diffusa的干燥全草，為民間常用傳統(tǒng)中藥材，味苦、甘，性寒，其葉形如舌，花白色，又名蛇舌癀、羊須草，主要分布于我國(guó)廣西、湖南、云南等地［1-2］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，白花蛇舌草含環(huán)烯醚萜類（車葉草苷、去乙酰車葉草酸酐）、黃酮類（槲皮素、蘆丁和山柰酚）、三萜類、有機(jī)酸類（阿魏酸、4 - 香豆酸）等成分，具有抗氧化及增強(qiáng)非特異性免疫作用，對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有抑制作用［3-4］。主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）法是化學(xué)模式識(shí)別常用的技術(shù)手段，具有直觀、可視化的分類效果和高精度的預(yù)測(cè)性，廣泛應(yīng)用于中藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)［5］。白花蛇舌草化學(xué)成分復(fù)雜，毒副作用小，臨床應(yīng)用廣泛，但缺乏法定的質(zhì)量控制方法，僅收載于各省的中藥材炮制規(guī)范。雖已有文獻(xiàn)報(bào)道運(yùn)用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定該藥材中槲皮素、熊果酸、車葉草苷等多種成分的含量［6-8］，但未報(bào)道不同生長(zhǎng)階段白花蛇舌草化學(xué)成分的變化。為全面、整體監(jiān)控白花蛇舌草整個(gè)生長(zhǎng)階段的質(zhì)量，本研究中采用HPLC 法分析白花蛇舌草的生長(zhǎng)期、開(kāi)花期、結(jié)果期3 個(gè)生長(zhǎng)階段指紋圖譜的差異，篩選差異標(biāo)志物，并通過(guò)PCA 及OPLS-DA法分析白花蛇舌草的最佳采收期，為其質(zhì)量控制提供理論支持?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

e2695 - 2998 型高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世公司），配有2998型二極管陣列檢測(cè)器（DAD）；AL105A 型電子天平（梅特勒-托利多儀器<上海>有限公司，精度為0.01 mg）；Elmasonic P 型超聲波清洗器（德國(guó)Elma公司，功率為350 W，頻率為40 kHz）；QYSW-20A型超純水儀（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品車葉草苷（批號(hào)為181117，含量≥98.0%），去乙酰車葉草酸酐（批號(hào)為190121，含量≥96.0%），山柰酚（批號(hào)為180928，含量≥98.0%），均購(gòu)于成都瑞芬思科技有限公司；對(duì)照品4 - 香豆酸（批號(hào)為112037 -201801，含量以99.3%計(jì)），阿魏酸（批號(hào)為110773 -202015，含量以99.2%計(jì)），槲皮素（批號(hào)為100081 -202010，含量以 98.3% 計(jì)），蘆?。ㄅ?hào)為 100080 -202012，含量以92.5%計(jì)），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇均為色譜純，其他試劑均為分析純；12 批白花蛇舌草（編號(hào)為S1-S12）來(lái)源于安徽亳州皖北中藥材種植基地，陰干，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)黃葉方教授鑒定均為正品。采收時(shí)間與生長(zhǎng)階段見(jiàn)表1。

表1 12批白花蛇舌草采收時(shí)間與生長(zhǎng)階段Tab.1 Harvest time and growth stages of 12 batches of Hedyotis diffusa

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［9-11］

色譜柱：ShiseidoCapcellPakMGC Ⅱ-C18柱（250mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）- 0.15%醋酸溶液（B），梯度洗脫（0～19 min時(shí)6%A，19～35 min時(shí)6%A →10%A，35～42 min 時(shí) 10%A → 35%A，42～62 min 時(shí)35%A → 65%A）；流速：0.9 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm（0～10 min 時(shí)去乙酰車葉草酸酐，19～35 min 時(shí)車葉草苷），306 nm（10～19 min 時(shí) 4 - 香豆酸），323 nm（35～42 min 時(shí)阿魏酸），369 nm（42～62 min 時(shí)槲皮素、蘆丁及山柰酚）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

分別取車葉草苷、去乙酰車葉草酸酐、4-香豆酸、阿魏酸、槲皮素、蘆丁、山柰酚對(duì)照品各適量，精密稱定，加甲醇溶解并定容，制成質(zhì)量濃度分別為225.4，196.8，162.7，200.1，207.9，151.5，181.5 μg/ mL 的混合對(duì)照品溶液。取粉碎過(guò)2 號(hào)篩的白花蛇舌草1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲提?。üβ蕿?50 W，頻率為40 kHz，溫度為30 ℃）40 min，放冷至室溫，再次稱定質(zhì)量，并用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取白花蛇舌草（編號(hào)為S11）適量，依法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次。結(jié)果以11號(hào)峰車葉草苷為參照峰，17個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.17%～0.65%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD為0.29%～1.02%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取白花蛇舌草（編號(hào)為S11）適量，依法制備供試品溶液，于室溫下放置0，5，10，15，20，24，36 h時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果以11號(hào)峰車葉草苷為參照峰，17 個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.28%～0.77%（n=7），相對(duì)峰面積的RSD為0.46%～1.83%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取白花蛇舌草（編號(hào)為S11）適量，依法制備供試品溶液，平行6 份，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果以11號(hào)峰車葉草苷為參照峰，17個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.67%～1.23%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD為0.89%～2.44%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.4 HPLC 指紋圖譜研究

參照峰選定：取12批（編號(hào)為S1-S12）白花蛇舌草各適量，依法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果色譜圖中11 號(hào)峰車葉草苷的保留時(shí)間適中，峰面積最大且分離度好，故以車葉草苷為參照峰。

相似度評(píng)價(jià)：采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012 版分析12 批（編號(hào)為S1-S12）白花蛇舌草的色譜圖。以S11為參照?qǐng)D譜，多點(diǎn)校正全峰匹配，12批白花蛇舌草HPLC 疊加指紋圖譜見(jiàn)圖1。標(biāo)定了17個(gè)共有峰，以對(duì)照?qǐng)D譜為參照進(jìn)行相似度計(jì)算，12批白花蛇舌草的相似度分別為 0.735，0.717，0.755，0.763，0.862，0.818，0.835，0.849，0.942，0.936，0.953，0.937，表明12 批白花蛇舌草在生長(zhǎng)期、開(kāi)花期、結(jié)果期3 個(gè)不同生長(zhǎng)階段間存在一定差異。

圖1 12批白花蛇舌草高效液相色譜疊加指紋圖譜Fig.1 HPLC superimposed fingerprint of 12 batches of Hedyotis diffusa

相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積：12批（編號(hào)為S1-S12）白花蛇舌草指紋圖譜中，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.21%～1.83%，共有峰相對(duì)峰面積的RSD為3.73%～39.18%，表明12 批白花蛇舌草共有峰的出峰時(shí)間相對(duì)穩(wěn)定，峰面積相差較大，白花蛇舌草不同生長(zhǎng)階段間存在差異。

共有峰指認(rèn)及相關(guān)分析：通過(guò)保留時(shí)間指認(rèn)出7個(gè)色譜峰，分別為3 號(hào)峰去乙酰車葉草酸酐（保留時(shí)間7.896 min）、5 號(hào)峰4- 香豆酸（保留時(shí)間17.058 min）、11 號(hào)峰車葉草苷（保留時(shí)間32.288 min）、12 號(hào)峰阿魏酸（保留時(shí)間37.045 min）、15 號(hào)峰蘆丁（保留時(shí)間45.187min）、16 號(hào)峰槲皮素（保留時(shí)間48.966 min）、17 號(hào)峰山柰酚（保留時(shí)間53.884 min）。詳見(jiàn)圖2。

圖2 混合對(duì)照品溶液高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of mixed reference solution

2.5 PCA

采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，導(dǎo)入17個(gè)共有指紋峰數(shù)據(jù)，采用因子分析項(xiàng)下PCA 分析12 批不同生長(zhǎng)階段白花蛇舌草的主成分，并生成因子得分系數(shù)（FACn）。將提取的3 個(gè)主成分（特征值 >1.0）通過(guò)權(quán)重系統(tǒng)組合，可得綜合得分公式F=0.513f1+0.196f2+0.102f（3f代表3個(gè)主成分得分）。F值越高，白花蛇舌草指紋圖譜綜合得分越高。由表2可知，白花蛇舌草3個(gè)生長(zhǎng)階段的綜合質(zhì)量排序?yàn)榻Y(jié)果期>開(kāi)花期>生長(zhǎng)期。

表2 主成分因子得分系數(shù)及綜合得分Tab.2 Factor score coefficients and comprehensive scores of PCA

2.6 OPLS-DA

為快速識(shí)別出3 個(gè)不同生長(zhǎng)階段白花蛇舌草指紋圖譜的相似性和差異性，篩選出差異性成分，將17個(gè)共有指紋峰面積導(dǎo)入SIMCA 16.0 軟件，對(duì)12 批白花蛇舌草進(jìn)行OPLS-DA。結(jié)果見(jiàn)圖3 和圖4。為綜合分析白花蛇舌草不同生長(zhǎng)階段的差異性，提取3 個(gè)主成分，設(shè)置分類Y矩陣變量隨機(jī)排列進(jìn)行置換檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖5。模型解釋率參數(shù)（R2）= 0.984 > 0.5，預(yù)測(cè)能力參數(shù)（Q2）=0.968 > 0.5，表明所建模型預(yù)測(cè)能力較強(qiáng)；R2擬合直線和Q2擬合直線在Y坐標(biāo)軸的截距分別為0.041 1 和-0.349 0，表明所建模型不存在過(guò)擬合現(xiàn)象。

圖3 OPLS-DA荷載散點(diǎn)圖Fig.3 Loading plot of OPLS - DA

圖4 OPLS-DA VIP圖Fig.4 VIP plot of OPLS - DA

圖5 OPLS-DA模型置換檢驗(yàn)圖Fig.5 Permutation test of OPLS - DA

由圖3 可知，OPLS - DA 模型中所有數(shù)據(jù)點(diǎn)均在95%置信區(qū)間內(nèi)，表明生長(zhǎng)期、開(kāi)花期、結(jié)果期3個(gè)生長(zhǎng)階段白花蛇舌草的化學(xué)成分及含量存在一定差異，但同一生長(zhǎng)階段樣品的相似度高。由圖4可知，峰13、峰12、峰4、峰16、峰3、峰17 的變量重要性投影值（VIP）均大于1，分別為2.02，1.64，1.23，1.19，1.08，1.01，即為差異標(biāo)志物，這6 個(gè)化合物對(duì)結(jié)果權(quán)重的影響率大于50%。因此，引起不同生長(zhǎng)階段白花蛇舌草含量差異的主要標(biāo)志性成分分別為峰13、峰12（阿魏酸）、峰4、峰16（槲皮素）、峰3（去乙酰車葉草酸酐）、峰17（山柰酚）。

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

最佳檢測(cè)波長(zhǎng)選擇：用DAD 對(duì)車葉草苷、去乙酰車葉草酸酐、4 - 香豆酸、阿魏酸、槲皮素、山柰酚對(duì)照品甲醇溶液的紫外- 可見(jiàn)光（200～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)）進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，得到最大波長(zhǎng)分別為車葉草苷及去乙酰車葉草酸酐（λmax= 238 nm），4 - 香豆酸（λmax=306 nm），阿魏酸（λmax=323 nm），槲皮素、蘆丁及山柰酚（λmax=369 nm），故選擇分段變換波長(zhǎng)檢測(cè)法檢測(cè)上述7種成分。

流動(dòng)相選擇：由于白花蛇舌草中7種化學(xué)成分的極性相差較大，本研究中選用不同流動(dòng)相體系［乙腈-水溶液、甲醇-水溶液、乙腈-醋酸溶液（0.10%，0.15%，0.20%）］進(jìn)行梯度洗脫，以優(yōu)化色譜條件。結(jié)果表明，流動(dòng)相體系為乙腈-醋酸溶液時(shí)對(duì)色譜峰峰形和保留時(shí)間均有明顯影響。不加醋酸時(shí)，色譜峰出現(xiàn)不同程度拖尾；加入醋酸后，隨著濃度的增加，色譜峰的對(duì)稱性增加?？紤]到色譜柱的耐酸范圍，最終選擇乙腈-0.15%醋酸溶液為流動(dòng)相。

3.2 化學(xué)模式識(shí)別分析

指紋圖譜作為一種綜合的可量化技術(shù)手段，能反映中藥內(nèi)在化學(xué)成分的多變量信息和數(shù)據(jù)，但目前所采用的指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)缺乏多維立體性［12-13］?；瘜W(xué)模式識(shí)別技術(shù)可迎合指紋圖譜的整體性和模糊性要求，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所含成分進(jìn)行分類，可對(duì)指紋圖譜進(jìn)行多維綜合分析，實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的識(shí)別功能［14-15］。本研究中通過(guò)PCA 模型間接反映了不同生長(zhǎng)階段白花蛇舌草的綜合質(zhì)量；OPLS-DA 模型判別出白花蛇舌草生長(zhǎng)期、開(kāi)花期、結(jié)果期3 個(gè)生長(zhǎng)階段的指紋圖譜，篩選出6 個(gè)差異標(biāo)志物，并通過(guò)對(duì)照品比對(duì)確認(rèn)出4 種成分，分別為3 號(hào)峰去乙酰車葉草酸酐、12 號(hào)峰阿魏酸、16號(hào)峰槲皮素、17號(hào)峰山柰酚。

3.3 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立了3個(gè)生長(zhǎng)階段白花蛇舌草的HPLC指紋圖譜分析方法，確定出了17個(gè)共有指紋峰，經(jīng)化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)確定最佳采收期為結(jié)果期，并篩選出6個(gè)差異標(biāo)志物，可為完善白花蛇舌草的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。