王亞月，賈方方，常 棟，馬文輝，閻海濤，許躍奇，王曉強

1. 商丘師范學院生物與食品學院，河南省商丘市睢陽區(qū)文化路298 號 476000

2. 河南省煙草公司平頂山市公司，河南省平頂山市建設路263 號 467000

煙草黑脛病是威脅煙葉產量與品質的嚴重土傳性病害之一，病原菌為煙草疫霉菌（Phytophthora parasiticavar. nicotianae），該病害極易在高溫和高濕環(huán)境下爆發(fā)［1］。近年來，隨著我國植煙區(qū)域的變化和煙田連作面積的進一步擴大，以及多數(shù)種植品種不抗（耐）黑脛病，致使部分產煙區(qū)煙草黑脛病頻繁發(fā)生和流行，嚴重者發(fā)病率高達75%以上，造成煙葉減產甚至絕收，嚴重影響了我國煙草業(yè)的發(fā)展［1-2］。目前煙草生產上通常采用農業(yè)防治、化學防治與生物防治等措施來防治煙草黑脛病。農業(yè)防治中采取間作和套作方式或者使用抗病品種，但間套作其他種類的作物可能會影響煙葉品質［3-5］?；瘜W防治中甲霜靈、氟吡菌胺、霜霉威鹽酸鹽、烯酰嗎啉以及丁吡嗎啉等化學藥劑對煙草黑脛病均有一定防效，但長時間大面積使用這些化學藥劑，易使病原菌產生抗藥性而導致防效逐漸降低，同時也易造成環(huán)境污染及煙葉農藥殘留超標［6-9］。而微生物防治具有無毒、無殘留和環(huán)境友好等優(yōu)點，符合煙草行業(yè)綠色發(fā)展的需要，在煙草病害防治中備受關注［1，10-13］。因此，針對土壤品質下降及土傳病害日益嚴重的問題，開發(fā)新型微生物菌劑成為煙草生產上的重要任務之一。

煙草黑脛病的發(fā)生與根際土壤微生物間關系密切，土壤中有益菌群數(shù)量的減少以及有害菌群數(shù)量的增加都會提高病害發(fā)生率。張維等［14］通過盆栽試驗發(fā)現(xiàn)，施用復配拮抗菌FP246 后與有益細菌相關的OTU比對照組顯著增加，提高了煙草根際土壤有益微生物的種類和數(shù)量。變形菌門和酸桿菌門是健康和受感染煙草植物根際土壤中的兩個主要門類，生防菌解淀粉芽胞桿菌ZM9 的施用可以提高促進植物生長的根際細菌的相對豐度，尤其是顯著提高變形桿菌的相對豐度，降低病原菌豐度［15］；田間施用解淀粉芽胞桿菌菌株Y4 與假單胞菌菌株Y8 生防菌，可改變根際土壤微生物群落，提高有益細菌的相對豐度，降低有害細菌的相對豐度，改善煙草抗病性，如Y4處理后乳酸桿菌和雙歧桿菌富集，Y8處理后乳酸桿菌富集［16］。目前，有關煙草黑脛病的研究主要集中在生防菌的分離鑒定以及生防菌的定殖，而通過大田試驗同時研究生防菌對煙草黑脛病的防控效果及對煙草根際土壤微生物多樣性的影響則報道較少。為此，以煙草黑脛病的微生物防治為目標，通過盆栽與大田試驗測定亞麻假單胞菌、沙福芽胞桿菌、暹羅芽胞桿菌與哈茨木霉菌對黑脛病的防效；同時，通過大田試驗研究了不同生防菌的施用對煙草根際土壤微生物群落豐度、組成和結構的影響，旨在篩選有效的生防菌，為煙草黑脛病的生物防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料：供試品種為中煙100，由河南省煙草公司平頂山市公司提供；微生物菌亞麻假單胞菌菌劑（Pseudomonas lini，KY）、沙福芽胞桿菌（Bacillus safensis，L9）、暹羅芽胞桿 菌（Bacillus siamensis，Q29）、哈茨木霉（Hypocrea lixii，M01）等由本實驗室發(fā)酵獲得；甲霜·錳鋅可濕性粉劑（有效成分58%，甲霜靈含量10%，代森錳鋅含量48%，江蘇寶靈化工股份有限公司）。

試劑：PCR Kit（北京全式金生物技術有限公司）；E.Z.N.A.?soil DNA Kit（美國Omega Bio-tek公司）；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（美國Axygen Biosciences 公 司）；NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq Kit（美國Bioo scientific 公司）；瓊脂糖（大連寶生物工程有限公司）。

儀器：NanoDrop2000（美國Thermo Scientific 公司）；Quantus?Fluorometer（美國Promega 公司）；PCR 儀（美國ABI 公司）；搖床（美國Thermo Scientific公司）；pH計（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 方法

1.2.1 盆栽與大田防效測定

按照常棟等［17］的方法測定拮抗菌KY、L9、M01和Q29 盆栽防效。試驗設置6 個處理：①對照CK0，僅接病原菌進行處理；②化學藥劑對照CK1，以稀釋2 000倍的甲霜·錳鋅進行灌根，每株10 mL，澆灌時間和次數(shù)同生防菌處理。拮抗菌處理③～⑥，為KY、L9、M01和Q29菌劑，煙苗還苗后灌根法接種拮抗菌濃度為1.0×108cfu/mL 的發(fā)酵液，接種量為10 mL/盆，培養(yǎng)煙株7 d 后劃傷煙株莖基部，灌根法接種10 mL 煙草黑脛病病原菌（孢子濃度約1.0×108cfu/mL），此后繼續(xù)接種拮抗菌液2次，每次間隔7 d，每個處理為9 盆，3 次重復，于接種完畢14 d 開始調查煙株發(fā)病情況。

大田試驗于2020 年在河南省平頂山市白龍廟村煙草種植基地進行，此基地為黑脛病高發(fā)田地，煙苗移栽后接種稀釋20倍的拮抗菌發(fā)酵液，每株菌劑灌根量為200 mL，確保接種孢子總量與盆栽試驗一致，鑒于大田煙株生育期長于盆栽煙株，調整大田接種周期為15 d，灌根3 次。每處理63 株煙苗，重復3次。以自然條件下未進行處理的煙株為對照，按照標準方法（GB/T23222—2008）［18］調查發(fā)病情況，并計算煙株發(fā)病率、病情指數(shù)以及生防菌相對防效。

計算公式：

1.2.2 土壤樣品采集與測定

運用棋盤采樣法在試驗大田中選擇取樣點，抖土法采集煙苗移栽后30 d（伸根期）、50 d（旺長期）、70 d（成熟期）處理和對照根際土壤樣品，于無菌袋中混勻，密封，低溫保存。

1.2.3 DNA抽提和PCR擴增

采用E.Z.N.A.?soil DNA Kit抽提樣品總DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 質量，NanoDrop 測定DNA 濃度和純度，以此為模板，運用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對16S rRNA 基因V3～V4可變區(qū)進行PCR 擴增；使用SSU0817F（5'-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3'）和1196R（5'-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3'）對18S rRNA基因V5～V7可變區(qū)進行PCR擴增。PCR反應體系20 μL，包括5×TransStart FastPfu 緩沖液4 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，上游引物（5 μmol·L-1）0.8 μL，下游引物（5 μmol·L-1）0.8 μL，TransStart FastPfu DNA 聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，加滅菌蒸餾水補足至20 μL。每個樣本重復3 次。擴增程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，27 個循環(huán)后72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。

1.3 Illumina Miseq測序

將同一樣本PCR 產物混合，2%瓊脂糖凝膠回收PCR 產物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit純化回收產物，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用Quantus?Fluorometer 對回收產物進行檢測定量。使用NEXTFLEX?Rapid DNA-Seq Kit建庫：①接頭鏈接；②使用磁珠篩選去除接頭自連片段；③利用PCR 擴增進行文庫模板的富集；④磁珠回收PCR 產物得到最終的文庫。利用Illumina Miseq PE300 平臺進行測序（上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

①使用Trimmomatic 軟件對原始測序序列進行質控，使用FLASH 軟件進行拼接：過濾reads 尾部質量值20以下的堿基，設置50 bp窗口，如果窗口內平均質量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，過濾質控后50 bp以下的reads，去除含N堿基reads；②根據(jù)PE reads之間的overlap關系，將成對reads拼接成1 條序列，最小overlap 長度為10 bp；③拼接序列overlap區(qū)允許的最大錯配比率為0.2，篩選不符合序列；④根據(jù)序列首尾兩端的barcode 和引物區(qū)分樣品，并調整序列方向，barcode 允許的錯配數(shù)為0，最大引物錯配數(shù)為2。使用的UPARSE 軟件（version 7.1，http：//drive5.com/uparse/），根據(jù)97%相似度對序列進行OTU 聚類并剔除嵌合體。利用RDP classifier（http：//rdp.cme.msu.edu/）對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva 數(shù)據(jù)庫（SSU128），設置比對閾值為70%。

防效數(shù)據(jù)運用Microsoft Excel 2010 和SPSS軟件進行分析，采用Duncan's 新復極差法進行顯著性差異檢驗（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 生防菌株的盆栽和大田防效

盆栽試驗結果如表1所示，與對照CK0相比，甲霜·錳鋅（CK1）、亞麻假單胞菌（KY）、沙福芽胞桿菌（L9）、哈茨木霉（M01）與暹羅芽胞桿菌（Q29）菌液處理的煙株發(fā)病率和病情指數(shù)均降低，分別降低30%和45.4%、66.7%和95.0%、75%和96.2%、75%和88.9%、60%和90.9%；且經生防菌處理后的煙株發(fā)病率和病情指數(shù)均低于甲霜·錳鋅，其中生防菌L9處理的煙株發(fā)病率與病情指數(shù)最低，分別為25%和2.8。生防菌株KY、L9、M01 和Q29 均表現(xiàn)出較高的防效，分別是甲霜·錳鋅防效的2.1 倍、2.1 倍、2.0倍和2.0倍，其中L9菌液相對防效最高，達96.2%。

表1 不同處理的盆栽防效比較①Tab.1 Control efficiencies of different treatments in pot experiments

大田試驗結果如表2所示，與對照CK0相比，甲霜·錳鋅與菌液處理的煙株黑脛病的發(fā)病率和病情指數(shù)均較低。施用生防菌的煙株發(fā)病率和病情指數(shù)均低于甲霜·錳鋅，其中亞麻假單胞菌處理后的煙株發(fā)病率和病情指數(shù)最低，分別為4.3%和2.1。同比施用甲霜·錳鋅對煙株的防效，生防菌KY、L9、M01和Q29 相對防效分別提高4.8 倍、4.1 倍、2.0 倍和4.0倍。與盆栽試驗結果一致，亞麻假單胞菌在大田中對煙草黑脛病也表現(xiàn)出較高防治效果，可應用于煙草黑脛病的生物防治。同比盆栽試驗，生防菌L9、M01與Q29施用于大田后防效均降低。

表2 不同處理大田防效比較Tab.2 Control efficiencies of different treatments in field experiments

2.2 生防菌對煙草根際土壤微生物組成的影響

2.2.1 微生物多樣性分析

如表3 所示，各處理的Coverage 值均高于0.9，表明測序序列群落覆蓋度高，具有代表性。與空白對照相比，施用化學藥劑與生防菌后，Shannon 指數(shù)與ACE 指數(shù)均降低，表明煙株根際土壤細菌群落多樣性與群落豐富度降低。進一步分析各處理分類水平群落數(shù)的變化（表4），發(fā)現(xiàn)化學藥劑與生防菌處理后細菌群落數(shù)在各分類水平上均低于CK0 處理，推測化學藥劑甲霜·錳鋅與4 種生防菌的施用可能抑制了煙株根際土壤中部分有害細菌的生長，從而達到一定的防效。

表3 不同處理根際土壤細菌Alpha多樣性比較Tab.3 Alpha diversity of rhizosphere soil bacteria of different treatments

表4 不同處理煙株根際土壤細菌群落數(shù)及OTU數(shù)目比較Tab.4 Total amounts of bacterial communities and OTU number of rhizosphere soil bacteria of different treatments

如表5 所示，各處理的Coverage 值為1，測序序列群落覆蓋程度高。與對照相比，施用化學藥劑與生防菌后，Shannon 指數(shù)、ACE 指數(shù)均降低，表明煙株根際土壤真菌群落豐富度與群落多樣性降低；進一步分析發(fā)現(xiàn)真菌在目、科、屬及種分類水平上群落數(shù)均低于CK0 處理，其變化趨勢與細菌類似。與細菌分類水平變化不同的是，施用甲霜·錳鋅、KY、L9與M01 后真菌在門水平上分別增加了3 個、2 個、3個與1 個門；在綱水平上，甲霜·錳鋅與L9 的施用分別增加2個與1個綱（表6）。

表5 不同處理根際土壤真菌Alpha多樣性比較Tab.5 Alpha diversity of rhizosphere soil fungi of different treatments

表6 不同處理煙株根際土壤真菌群落數(shù)及OTU數(shù)量比較Tab.6 Total amounts of bacterial communities and OTU number of rhizosphere soil fungi of different treatments

2.2.2 不同處理對土壤微生物豐度的影響

如圖1 所示，與空白對照CK0 相比，施用甲霜·錳鋅（CK1）、KY、L9、M01 和Q29 后，煙株根際土壤中細菌的核心物種（核心物種是所有樣本共有的物種）數(shù)量均增加，而真菌的核心物種數(shù)量則降低，表明土壤中核心物種細菌菌群對煙株病害的防治有促進作用。無論是真菌還是細菌，伸根期、旺長期與成熟期的煙株根際土壤微生物核心物種數(shù)量依次表現(xiàn)出降低趨勢。

圖1 不同處理煙株根際土壤中細菌（A）和真菌（B）核心物種數(shù)量變化Fig.1 Quantitative variations of main bacterial（A）and fungal（B）species in rhizosphere soil of different treatments

不同生防菌處理后，煙株根際土壤細菌優(yōu)勢菌群組成類似。在門水平上，優(yōu)勢菌群均為變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、綠彎菌門（Chloroflexi）、厚壁菌門（Firmicutes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、黏菌門（Myxococcota）及Patescibacteria 等優(yōu)勢菌組成（表7）。與CK0相比，化學藥劑與生防菌處理后，變形菌門、放線菌門、厚壁菌門和Patescibacteria 4類菌群數(shù)量有所增加，酸桿菌門、綠彎菌門和芽單胞菌門菌群均有所減少。KY 處理后，優(yōu)勢菌群厚壁菌門所占百分比為11%，分別是CK0、CK1、L9、M01與Q29的1.9倍、1.6倍、1.1倍、1.7倍與1.1倍，且隨著防效的降低呈現(xiàn)減少趨勢。

表7 不同處理煙株根際土壤細菌優(yōu)勢菌群所占比例比較Tab.7 Proportions of dominant bacteria in rhizosphere soil of different treatments （%）

在屬水平上，微生物豐度變化與門水平上相呼應，則由放線菌門中的Gaiellales 與節(jié)細菌屬（Arthrobacter）、厚壁菌門的芽胞桿菌屬（Bacillus）以及變形菌門的鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）等組成（圖2），KY 的施用提高了煙株根際芽胞桿菌屬菌群數(shù)量，從而使得其表現(xiàn)出較高防效。

圖2 不同處理對煙株根際土壤細菌屬水平相對豐度的影響Fig.2 Effects of different treatments on relative abundances of bacteria in rhizosphere soil at genus level

經甲霜·錳鋅和生防菌處理后的煙株，根際土壤真菌優(yōu)勢菌群組成類似。在門水平上，優(yōu)勢菌群依次均為子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、毛霉門（Mucoromycota）。與對照CK0 相比，子囊菌門與擔子菌門群落所占百分比變化不大，毛霉門群落數(shù)量升高（表8）。

表8 不同處理煙株根際土壤真菌優(yōu)勢菌群所占比例比較Tab.8 Proportions of dominant fungi in rhizosphere soil of different treatments （%）

甲霜·錳鋅和生防菌雖然對煙草黑脛病都表現(xiàn)出防治效果，然而對煙株根際土壤優(yōu)勢群落豐度卻表現(xiàn)出不同影響。甲霜·錳鋅的施用增加了擔子菌門群落豐度，而生防菌的施用卻降低了該類群豐度。在屬水平上均由毛殼菌屬（Chaetomium）、子囊菌綱（Sordariomycetes）未分類屬、木霉屬（Trichoderma）、散囊菌屬（Eurotium）、norank_p_Mucoromycota、Solicoccozyma、Heterocephalacria、纓霉屬（Thysanophora）等優(yōu)勢菌群組成（圖3）；經KY處理后，煙株根際土壤散囊菌屬豐度明顯多于其他處理。

圖3 不同處理對煙株根際土壤真菌屬水平相對豐度的影響Fig.3 Effects of different treatments on relative abundances of fungi in rhizosphere soil at genus level

3 討論

微生物菌劑可以提高土壤酶活性、改變土壤微生物菌群、改良土壤養(yǎng)分環(huán)境，從而調控土壤微生物群落，改變其功能多樣性，進而抑制作物病蟲害［19-22］。目前已發(fā)現(xiàn)多種微生物可以抑制煙草黑脛病病原菌的生長，如細菌類包括解淀粉芽胞桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、綠針假單胞 菌（Pseudomonas chlororaphis）、多黏類芽胞桿 菌（Paenibacillus polymyxa）、枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）、伯克氏菌（Burkholderia cepacia）、芽胞桿菌（Bacillus sp.）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、煙草節(jié)桿菌（Arthrobacter nicotianae） 、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）［1，11，13，23-26］；真菌類如哈茨木霉（Trichoderma harzianum）［27］；放線菌如鏈霉菌（Streptomyces）［28］。這些生防菌分布于芽胞桿菌屬、假單胞菌屬、伯克氏菌屬、節(jié)細菌屬、木霉屬和鏈霉菌屬中，在本試驗中也發(fā)現(xiàn)芽胞桿菌屬、伯克氏菌屬、節(jié)細菌屬、木霉屬為優(yōu)勢菌群，這些菌群與煙草生長有密切關系［5，29-30］。本試驗中亞麻假單胞菌在盆栽和大田試驗中均表現(xiàn)出較高防效，假單胞菌屬中的許多菌株如銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌、綠針假單胞菌、惡臭假單胞菌等對煙草病害均具有防治作用。這些菌株可通過產生抑菌次生代謝產物如吩嗪-1-羧酸、藤黃綠膿菌素、環(huán)狀脂多肽或者鐵載體等活性物質破壞病原菌細胞壁、改變細胞膜通透性或者影響病原菌蛋白質合成而達到抑菌作用，或者通過誘導植物系統(tǒng)抗性及促進植物生長等機制發(fā)揮防治功能［31-32］。亞麻假單胞菌施用后提高了煙株根際土壤芽胞桿菌屬與散囊菌屬菌群數(shù)量，芽胞桿菌屬中的許多菌株已被報道應用于植物病害的防治，如枯草芽胞桿菌、蘇云金芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌、側胞芽胞桿菌、蠟樣芽胞桿菌、多黏類芽胞桿菌和短小芽胞桿菌等，這些菌可以產生抑菌活性物質、誘導植物抗性或者促進植物生長［33-34］；散囊菌也可產生抑菌活性物質［35-36］。推測亞麻假單胞菌的生物防治作用與這些有益微生物數(shù)量增加有關，然而該菌株是通過產生活性次生代謝產物或者誘導植物系統(tǒng)抗性或者促進植物生長等機理而實現(xiàn)防控效果仍需進一步研究。

煙草黑脛病的發(fā)生與根際土壤微生物群體的作用密切相關。土壤從“細菌型”到“真菌型”的轉變會加重作物病害的發(fā)生；生防菌的施用可以使土壤從“真菌型”到“細菌型”轉變，改善土壤微生態(tài)環(huán)境［19］。在本研究中，甲霜·錳鋅、亞麻假單胞菌、沙福芽胞桿菌、暹羅芽胞桿菌與哈茨木霉菌的施用雖然降低了煙株根際土壤微生物多樣性，然而卻增加了細菌核心物種數(shù)量，降低了真菌核心物種數(shù)量，即意味著土壤核心物種是向細菌化狀態(tài)轉變，為煙株提供良好生長環(huán)境，提高其抗病能力。

4 結論

通過盆栽和大田試驗比較4 株生防菌對煙草黑脛病的防治效果，獲得具有較高防效的亞麻假單胞菌、沙福芽胞桿菌和暹羅芽胞桿菌，相對防效均高于75%。高通量測序分析表明藥劑與生防菌的施用并不影響細菌和真菌優(yōu)勢菌群群落結構，但改變了煙株根際土壤菌群豐度，微生物多樣性降低，細菌和真菌核心物種數(shù)量分別呈現(xiàn)上升和下降的趨勢。