王桂瑤，楊萌萌，常延斌，許 強(qiáng)，苗晨琳，趙國(guó)慶，李玉娥，宋紀(jì)真*

1. 中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)楓楊街2 號(hào) 450001

2. 江蘇中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，南京市建鄴區(qū)興隆大街29 號(hào) 210000

3. 吉林煙草工業(yè)有限責(zé)任公司，長(zhǎng)春市經(jīng)開(kāi)區(qū)世紀(jì)大街99 號(hào) 130022

煙草甲Lasioderma serricorne（Fabricius）屬鞘翅目（Coleoptera）竊蠹科（Anobiidae），是世界性倉(cāng)儲(chǔ)害蟲(chóng)，具有食性雜、繁殖力強(qiáng)和分布范圍廣的特點(diǎn)，主要為害貯藏的煙葉及煙草制品、糧食和中草藥等［1-2］。已有調(diào)查表明煙草甲為害給卷煙企業(yè)造成的直接損失率約為0.215%［3］，每年給國(guó)家?guī)?lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，磷化鋁熏蒸是防治煙草甲的主要手段，但長(zhǎng)期應(yīng)用化學(xué)防治已引起害蟲(chóng)抗藥性和環(huán)境污染等問(wèn)題［2，4-5］。嗅覺(jué)對(duì)昆蟲(chóng)搜尋食物、尋找配偶和產(chǎn)卵等至關(guān)重要［6］。隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，可利用昆蟲(chóng)嗅覺(jué)基因高通量篩選對(duì)昆蟲(chóng)嗅覺(jué)行為具有調(diào)節(jié)作用的小分子化合物來(lái)開(kāi)發(fā)昆蟲(chóng)行為調(diào)節(jié)劑，此方法相比使用昆蟲(chóng)嗅覺(jué)儀篩選昆蟲(chóng)行為調(diào)控劑的傳統(tǒng)方法［7-10］效率更高，對(duì)于煙草甲的綠色防控具有重要意義。

昆蟲(chóng)氣味受體是具有反向拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（N 端位于細(xì)胞內(nèi)，C 端位于細(xì)胞外）的G 蛋白偶聯(lián)受體［11］，能夠特異性地識(shí)別氣味分子，是昆蟲(chóng)嗅覺(jué)感受中最關(guān)鍵的嗅覺(jué)蛋白［11-13］。通過(guò)鑒定昆蟲(chóng)氣味受體基因，進(jìn)而研究氣味受體基因功能，可以解釋昆蟲(chóng)行為產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)，有助于昆蟲(chóng)行為調(diào)控劑的開(kāi)發(fā)［13-14］。已有研究表明，昆蟲(chóng)氣味受體主要分為兩種：一種是傳統(tǒng)氣味受體（ORx），它們?cè)诓煌ハx(chóng)間同源性較低且數(shù)量各異［15］；另一種是氣味受體輔助受體Orco（Odorant receptor co-receptor），每種昆蟲(chóng)只有1個(gè)，在不同昆蟲(chóng)間保守，能夠與ORx 形成配體門(mén)控性離子通道（異源二聚體）［12］。例如，利用星天牛（Anoplophora chinensis）觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，Wang 等［16］鑒定出43 個(gè)ORs基因和1 個(gè)Orco基因。Cheng 等［17］從黃野螟（Heortia vitessoides）觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定出27 個(gè)ORs基因和1 個(gè)Orco基因。在煙草甲中，Wang 等［18］對(duì)煙草甲觸角轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序分析，鑒定出14 個(gè)氣味結(jié)合蛋白、5 個(gè)化學(xué)感受蛋白和2 個(gè)Niemann-Pick C2 蛋白。然而，目前有關(guān)煙草甲氣味受體基因的鑒定研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，基于煙草甲觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)手段挖掘鑒定氣味受體基因，并分析煙草甲氣味受體與其他鞘翅目昆蟲(chóng)氣味受體之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，進(jìn)而通過(guò)熒光定量PCR 分析氣味受體基因在煙草甲雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng)觸角中的相對(duì)表達(dá)量，旨在增加對(duì)煙草甲嗅覺(jué)感受系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)，一方面為煙草甲氣味受體的功能研究奠定基礎(chǔ)，另一方面為煙草甲行為調(diào)控劑的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)，從而加快引誘劑和趨避劑等行為調(diào)控劑在煙草甲綠色防控中的應(yīng)用步伐。

1 材料與方法

1.1 供試蟲(chóng)源和組織解剖

煙草甲從中國(guó)煙草總公司鄭州煙草研究院貯存的原煙上采集并在培養(yǎng)箱內(nèi)用人工飼料（全麥粉和燕麥粉的質(zhì)量比為7∶3）飼養(yǎng)多代。培養(yǎng)箱的溫度為29 ℃±1 ℃，相對(duì)濕度為75%±5%，光照條件為全暗。剛羽化的煙草甲被分成雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng)，收集大約500 對(duì)羽化2 d 的煙草甲成蟲(chóng)用來(lái)解剖其觸角、腹部和足［19-20］。解剖的組織樣品液氮冷凍后保存在-80 ℃冰箱中備用。

1.2 煙草甲ORs基因的挖掘

實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)高通量測(cè)序構(gòu)建了煙草甲觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，利用關(guān)鍵詞odorant receptor 對(duì)轉(zhuǎn)錄組注釋結(jié)果進(jìn)行搜索?；虻拈_(kāi)放閱讀框通過(guò)網(wǎng) 站https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/進(jìn) 行 預(yù)測(cè)。搜索到的序列在NCBI（National Center for Biotechnology Information）的Nr 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTX 分析，從而確認(rèn)序列注釋的正確性。

1.3 煙草甲ORs基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

選擇煙草甲的9 個(gè)氣味受體的氨基酸序列，與下載自NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)的暗黑鰓金龜（Holotrichia parallela）、綠豆象（Callosobruchus chinensis）、光肩星天 牛（Anoplophora glabripennis）和 赤 擬 谷 盜（Tribolium castaneum）等鞘翅目昆蟲(chóng)氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。利用Clustal Omega（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）對(duì)這些嗅覺(jué)基因進(jìn)行多序列聯(lián)配。使用最大似然法，在MEGA 7（JTT model，1 000 bootstrap）中 構(gòu) 建 系 統(tǒng) 進(jìn) 化樹(shù)。使用Figtree 1.4.0 軟件對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行可視化編輯。

1.4 煙草甲ORs基因的組織表達(dá)譜分析

利用Trizol 試劑（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）提取煙草甲雌雄蟲(chóng)觸角、腹部和足的總RNA。利用Nanodrop 微量核酸蛋白檢測(cè)儀（美國(guó)賽默飛公司）測(cè)定RNA 濃度。利用熒光定量PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）反轉(zhuǎn)錄1 μg RNA 為cDNA。以煙草甲的18SrRNA 和RPS15基因?yàn)閮?nèi)參基因，在線設(shè)計(jì)（http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0yi/）所有基因的引物，引物序列見(jiàn)表1。用Light Cycler 480 II 熒光定量PCR 儀（瑞士羅氏公司）進(jìn)行擴(kuò)增，使用SYBR 熒光定量專(zhuān)用染料（南京諾唯贊生物科技股份有限公司），PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火和延伸共30 s，40 個(gè)循環(huán)；95 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃15 s 形成融解曲線，通過(guò)融解曲線判斷引物的特異性。利用2-ΔΔCt方法計(jì)算ORs基因在煙草甲雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng)觸角、腹部和足中的相對(duì)表達(dá)量，以足為對(duì)照，RPS15基因?yàn)閮?nèi)參基因，進(jìn)行3 次生物學(xué)重復(fù)。用DPS 19.05 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA（One-way Analysis of Variance）方差分析，利用LSD（Least Significant Difference）法對(duì)差異顯著性（P＜0.05）進(jìn)行檢驗(yàn)。

表1 熒光定量PCR 使用的引物Tab.1 Primers for qRT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草甲ORs基因的挖掘

基于煙草甲觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共鑒定出9 個(gè)ORs基因（LserOR1 ～LserOR8，LserOrco）（表2）。這些ORs基因序列具有完整的開(kāi)放閱讀框，氨基酸長(zhǎng)度范圍為132 ～479 個(gè)氨基酸。煙草甲ORs基因在NCBI 進(jìn)行BLASTX 比對(duì)的結(jié)果顯示，煙草甲的Orco 序列與光肩星天牛的Orco 序列相似度最高（78.29%），而煙草甲其他的ORs 序列與其他昆蟲(chóng)ORs 的匹配度為24.06% ～55.36%。

表2 煙草甲觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定的氣味受體基因Tab.2 OR genes identified in antennal transcriptome data of L. serricorne

2.2 煙草甲ORs基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果（圖1）表明，煙草甲的LserOR6 與光肩星天牛AglaOR22 聚在同一個(gè)分支，表明它們之間進(jìn)化關(guān)系更接近。另外，煙草甲的LserOrco 與綠豆象等其他鞘翅目昆蟲(chóng)的Orco 也聚在同一個(gè)分支。

圖1 不同鞘翅目昆蟲(chóng)氣味受體蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of ORs from various coleopteran insects

2.3 煙草甲ORs基因的組織表達(dá)譜分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果顯示，兩個(gè)LserORs基因（LserOR5和LserOrco）在煙草甲雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng)觸角中表達(dá)量相對(duì)較高，是對(duì)照轉(zhuǎn)錄本量的3～5 倍（圖2）。其中，LserOR5在雄蟲(chóng)觸角中的表達(dá)量顯著高于雌蟲(chóng)，而LserOrco在雌蟲(chóng)和雄蟲(chóng)觸角中的表達(dá)量無(wú)顯著差異。另外，LserOR1和LserOR4在雄蟲(chóng)觸角中表達(dá)量是對(duì)照的1.7 倍，而其他氣味受體基因（LserOR2～LserOR3，LserOR6～LserOR8）在觸角和腹部低表達(dá)。

圖2 煙草甲氣味受體基因在雌雄蟲(chóng)的組織表達(dá)譜Fig.2 Tissue expression profiles of L. serricorne OR genes

3 討論

目前，研究人員已經(jīng)在多種鞘翅目昆蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)了ORs基因［21］。本研究中從煙草甲觸角轉(zhuǎn)錄組中共鑒定出9 個(gè)ORs基因，相比星天牛（44 個(gè)ORs）［16］和甘薯小象鼻蟲(chóng)（Cylas formicarius）（54 個(gè)ORs）［22］較少。在不同昆蟲(chóng)中鑒定出的ORs基因數(shù)目各異，一方面可能是由于昆蟲(chóng)本身的生理學(xué)差異［23］，另一方面可能是昆蟲(chóng)在特定條件下表達(dá)的基因數(shù)目有限，因?yàn)檗D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)呈現(xiàn)的只是特定時(shí)間細(xì)胞中表達(dá)的嗅覺(jué)基因，而缺少一些低豐度或不表達(dá)的氣味受體基因［24］。下一步可通過(guò)煙草甲全基因組測(cè)序，更全面地揭示煙草甲氣味受體基因信息［25］。

本研究中，煙草甲的ORs 與其他昆蟲(chóng)的ORs 相似度為24% ～55%，這與黑肩綠盲蝽（Cyrtorhinus lividipennis）（28% ～77%）［26］等其他昆蟲(chóng)的研究結(jié)果具有一致性，表明ORs在不同昆蟲(chóng)間同源性較低，可能與不同昆蟲(chóng)具有不同的氣味偏好有關(guān)［12-13］。氣味受體蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，煙草甲與其他鞘翅目昆蟲(chóng)的Orco 聚在一起，這與甘薯小象鼻蟲(chóng)Orco 蛋白聚類(lèi)分析結(jié)果一致［22］，進(jìn)一步說(shuō)明Orco序列在不同昆蟲(chóng)間的保守性。另外，煙草甲的LserOR6 與光肩星天牛AglaOR22 聚在同一個(gè)分支，說(shuō)明它們?cè)谶M(jìn)化上具有相似性［26-27］。

煙草甲LserOR5和LserOrco基因在觸角中表達(dá)量相對(duì)較高，已有研究表明昆蟲(chóng)觸角中一些高表達(dá)的ORs和Orco基因與感受植物揮發(fā)物和昆蟲(chóng)性信息素密切相關(guān)［28-29］。例如，暗黑鰓金龜觸角中特異性表達(dá)的氣味受體HparOR27 能夠感受3 種植物揮發(fā)物［29］。利用RNAi 技術(shù)降低Orco基因在黑肩綠盲蝽［26］和紅棕象甲（Rhynchophorus ferrugineus）［30］觸角中的表達(dá)量，可以使這些昆蟲(chóng)對(duì)植物揮發(fā)物等多種氣味的敏感性下降。在煙草甲中，LserOR5和LserOrco識(shí)別氣味分子的功能有待通過(guò)蛋白體外表達(dá)和RNAi等技術(shù)進(jìn)一步研究。另外，本研究中發(fā)現(xiàn)一些氣味受體基因（LserOR2～LserOR3，LserOR6～LserOR8）在煙草甲成蟲(chóng)觸角和腹部低表達(dá)，這可能是由于這些基因在煙草甲其他生長(zhǎng)發(fā)育階段高表達(dá)或具有其他生理功能［13，21］，仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

基于煙草甲觸角轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共鑒定出9 個(gè)ORs基因（LerOR1～LerOR8，LserOrco）。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明，煙草甲的LserOR6 與光肩星天牛AglaOR22 聚在同一個(gè)分支，它們的進(jìn)化關(guān)系更接近。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果顯示，煙草甲的兩個(gè)氣味受體基因（LserOR5和LserOrco）在觸角中表達(dá)量相對(duì)較高。上述結(jié)果可為煙草甲氣味受體基因的功能研究奠定基礎(chǔ)，從而促進(jìn)其引誘劑和趨避劑等行為調(diào)控劑的開(kāi)發(fā)。