豬口蹄疫O 型、A型二價滅活疫苗免疫抗體檢測試劑盒的應用評估

王紅娜，陳 偉

1.河南省寶豐縣動物疫病預防控制中心，河南 寶豐 467400；2.申聯(lián)生物醫(yī)藥（上海）股份有限公司，上海 200241

口蹄疫（foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）引起的一種急性、烈性、高度接觸性的動物傳染病，具有傳播速度快、傳播方式多樣、感染致病性強、潛伏期短、動物機體對口蹄疫病毒的免疫應答反應低等特點。該病發(fā)病率可達100%，仔豬常不見癥狀而猝死，嚴重時死亡率可達100%，對養(yǎng)殖業(yè)和國際畜產(chǎn)品貿(mào)易造成巨大的經(jīng)濟損失。因此，世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為必須法定報告的動物傳染病，我國將其列在一類動物傳染病的第1 位。目前，我國主要采取以疫苗免疫為主、撲殺為輔的綜合性防控措施，因此，口蹄疫疫苗免疫效果評估是防止口蹄疫發(fā)生和蔓延的一個重要環(huán)節(jié)，快速準確地檢測評估疫苗免疫抗體水平至關重要[1-2]。本試驗旨在通過對比評估7 個企業(yè)生產(chǎn)的口蹄疫抗體檢測試劑盒的性能，為養(yǎng)殖場開展疫苗免疫效果評估提供科學的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 血清樣品

278 份臨床血清樣品來源于7 個規(guī)?；i場，免疫疫苗為豬口蹄疫O 型、A 型二價滅活疫苗（Re-O/MYA98/JSCZ/2013 株+Re-A/WH/09 株），免疫劑量為2 mL/頭份，分別在一免及二免30 d 后按要求隨機采血，并制備血清，2～8 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 口蹄疫抗體檢測試劑盒

7 個口蹄疫抗體檢測試劑盒生產(chǎn)企業(yè)分別以企業(yè)A、企業(yè)B、企業(yè)C、企業(yè)D、企業(yè)E、企業(yè)F、企業(yè)G 代表，詳見表1。

表1 口蹄疫抗體檢測試劑盒

1.3 檢測方法及結果判定

按照各企業(yè)生產(chǎn)試劑盒中說明書的具體檢測步驟和注意事項進行操作，并根據(jù)相應的判定標準進行結果判定與分析。由于各企業(yè)生產(chǎn)的試劑盒對檢測結果的判定標準有所差異，因此，對于待檢樣品的抗體平均值不做對比分析。

2 結果與分析

2.1 一免血清抗體檢測結果

檢測結果顯示（表2），企業(yè)A、企業(yè)B 與企業(yè)D生產(chǎn)的試劑盒檢測一免血清的O 型抗體陽性率分別為73.7%～100%、85%～100%、90%～100%，離散度分別為12.6～65.9、13.6～31.9、19.8～50.9；A 型抗體陽性率分別為73.7%～100%、94.7%～100%、100%，離散度分別為13.2～71.8、3.5～22.2、21.5～59.3。由此可見，企業(yè)A、企業(yè)B 與企業(yè)D 生產(chǎn)的試劑盒檢測的抗體陽性率和離散度等主要指標均相對較好，而其他企業(yè)生產(chǎn)的試劑盒檢測的抗體陽性率和離散度等主要指標均相對較差。

表2 各企業(yè)口蹄疫抗體檢測試劑盒一免血清抗體檢測結果

續(xù)表2

2.2 二免血清抗體檢測結果

檢測結果顯示（表3），企業(yè)A、企業(yè)B、與企業(yè)D 生產(chǎn)的試劑盒檢測二免血清O 型抗體陽性率分別為90%～100%、100%、100%，離散度分別為19.4～69.9、1.8～10.7、5.3～8.5；A 型抗體陽性率分別為80%～100%、100%、100%，離散度分別為21.3～77.3、1.3～2.7、6.6～8.2。由此可見，企業(yè)A、企業(yè)B 與企業(yè)D 生產(chǎn)的試劑盒檢測的抗體陽性率和離散度等主要指標均相對較好，與一免血清抗體檢測結果保持一致，而其他企業(yè)生產(chǎn)的試劑盒檢測的抗體陽性率雖然都相對較好，但離散度都相對較差。

表3 各企業(yè)口蹄疫抗體檢測試劑盒二免血清抗體檢測結果

續(xù)表3

3 討 論

血清學檢測在口蹄疫檢疫及免疫群體疫苗效力評估中發(fā)揮重要作用，其中病毒中和試驗（VNT）是口蹄疫血清學檢測的“黃金標準”，但該試驗需要使用口蹄疫活病毒，按照國家規(guī)定必須在有相關研究資質(zhì)的生物安全三級實驗室中進行操作，這就限制了絕大多數(shù)普通實驗室的檢測使用。隨著現(xiàn)代生物技術的快速發(fā)展，目前國內(nèi)外已成功研究出一些可替代的檢測方法進行口蹄疫疫苗免疫抗體的評估，如液相阻斷酶聯(lián)免疫吸附試驗（LPB-ELISA），該方法不使用口蹄疫活病毒，具有敏感性高、特異性強等特點，是國際貿(mào)易中認可的一種標準化檢測方法，該方法最大的優(yōu)點是采用滅活的病毒抗原，而抗原是在液相中與抗體發(fā)生特異性結合反應，與病毒中和試驗原理基本一致，因此又被稱為體外病毒中和試驗，這種方法就可以從要求較高的專業(yè)化生物安全實驗室走向大眾化的普通實驗室來推廣使用[3-4]。此外，固相競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗（SPCELISA）也是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）指定的口蹄疫血清學檢測評估方法之一，也是我國口蹄疫診斷技術（GB T18935-2018）中推薦使用的檢測方法。這種方法除具備液相阻斷ELISA 的優(yōu)點以外，其檢測特異性更好、操作更簡單、重復性更好，目前也在口蹄疫流行病學調(diào)查及疫苗免疫抗體監(jiān)測等方面廣泛使用[5-6]。

本試驗旨在通過對278 份疫苗免疫臨床血清樣品進行檢測，對比評估7 個企業(yè)生產(chǎn)的口蹄疫抗體檢測試劑盒的性能，檢測結果顯示，企業(yè)A、企業(yè)B 及企業(yè)D 生產(chǎn)的試劑盒對臨床血清的檢測結果，無論是O 型抗體還是A 型抗體，其抗體陽性率和離散度等主要評估指標均相對較好，而其他企業(yè)生產(chǎn)的試劑盒的檢測結果相對較差，尤其是一免血清抗體檢測結果，不同企業(yè)試劑盒的檢測結果差異比較大，這可能與試劑盒的特異性、敏感性、檢測反應體系或者包被的口蹄疫抗原種類等諸多因素有關，這些試劑盒的檢測性能還有待進一步優(yōu)化提升，從而確保檢測結果的可靠性；而二免血清抗體檢測結果均相對較好，大多數(shù)企業(yè)生產(chǎn)的試劑盒都可以檢測評估。

目前，我國對于包括口蹄疫診斷試劑在內(nèi)的大多數(shù)獸用診斷生物制品還沒有制定統(tǒng)一明確的國家標準。因此，現(xiàn)有口蹄疫診斷制品還存在諸多問題，如生產(chǎn)企業(yè)多且大多數(shù)資質(zhì)不健全；各企業(yè)試劑盒包被的口蹄疫病毒抗原不同、檢測反應體系不同，導致檢測結果差異較大，從而不能有效對口蹄疫疫苗免疫抗體進行科學評價，導致豬場免疫程序制定困難，或者需要反復調(diào)整，甚至造成免疫失敗。因此，養(yǎng)殖場需要結合本場實際情況，通過對口蹄疫抗體檢測試劑盒比對篩選，同時還可以結合口蹄疫疫苗有效146S 抗原含量、總蛋白含量、內(nèi)毒素含量等關鍵技術指標的檢測結果形成一套相對可靠的評價標準，以便制定科學合理的免疫程序，保障疫苗的免疫效果。