袁 雷,吉雪花,張國(guó)儒,石林媛,3,郭河瑤,唐亞萍,楊 濤,楊生保
(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所,烏魯木齊 830091;2.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院/特色果蔬栽培生理與種質(zhì)資源利用兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆石河子 832003;3.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,新疆昌吉 831100)
【研究意義】辣椒(Capsicum annuumL.)屬于茄科,一年或多年生草本,同花或異花授粉,由于其果實(shí)豐富的營(yíng)養(yǎng)及特有的辣味,種植不受地域限制[1]。辣椒果實(shí)中還含有辣椒素、VC、蛋白質(zhì)、胡蘿卜素等豐富的營(yíng)養(yǎng)成分。辣椒紅素是口紅和食品色素的天然原料來(lái)源;辣椒堿類(lèi)物質(zhì)廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物害蟲(chóng)防治[2-9]。近幾年我國(guó)辣椒種植面積穩(wěn)定在210×104hm2以上,已超過(guò)大白菜等成為中國(guó)種植面積最大的蔬菜作物,其總產(chǎn)量達(dá)6 400×104多t[10],新疆由于獨(dú)特的地理氣候條件,年種植面積可達(dá)6.67×104hm2(100 萬(wàn)畝)左右,年產(chǎn)制干辣椒15×104~20×104t,辣椒相關(guān)制品品質(zhì)優(yōu),已成為我國(guó)制干辣椒的重要產(chǎn)區(qū)之一[11,12]。新疆辣椒種質(zhì)資源評(píng)價(jià)及資源整合效率低,進(jìn)一步的種質(zhì)資源評(píng)價(jià)及挖掘?qū)π陆苯愤z傳改良和種質(zhì)創(chuàng)新具有重要意義?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】采用2種方法對(duì)辣椒種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性和聚類(lèi)研究。一是農(nóng)藝性狀的統(tǒng)計(jì)分析,如通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析辣椒種質(zhì)的多個(gè)農(nóng)藝性狀,分別對(duì)湖南、四川、新疆、貴州和湖北等地保存的辣椒種質(zhì)資源進(jìn)行了資源評(píng)價(jià)和分類(lèi),并從中篩選出多個(gè)品質(zhì)好,具有較大研究和生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值的辣椒新種質(zhì)[13-17]。還有通過(guò)對(duì)國(guó)外引進(jìn)辣椒種質(zhì)資源的農(nóng)藝性狀進(jìn)行遺傳多樣性和聚類(lèi)分析,發(fā)現(xiàn)辣椒種內(nèi)和種間均存在豐富的遺傳變異[18-20]。二是分子標(biāo)記技術(shù),隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展,各種分子標(biāo)記技術(shù)不斷成熟,利用不同類(lèi)型分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)辣椒種質(zhì)資源的分類(lèi)和利用研究報(bào)道較多。如有利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)分析了辣椒資源的遺傳多樣性[21,22];有將SSR 標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于朝天椒、灌木椒和制干辣椒等辣椒種質(zhì)資源的遺傳多樣性和聚類(lèi)研究中[23-26];有利用SNP 標(biāo)記技術(shù)分別對(duì)來(lái)自不同國(guó)家的246 份、399 份和4652 份辣椒種質(zhì)資源進(jìn)行了種質(zhì)資源評(píng)價(jià)及核心種質(zhì)的挖掘工作[27-29];還有利用RAPD和AELP、SRAP和SCoT及RAPD 和ISSR 等兩種分子標(biāo)記相結(jié)合的方式對(duì)辣椒種質(zhì)進(jìn)行了遺傳多樣性分析[30-32]?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】對(duì)于辣椒種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)與分類(lèi),2種研究方法各有優(yōu)勢(shì)且存在著不同作用。辣椒種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)分類(lèi)是遺傳改良的基礎(chǔ),果實(shí)是辣椒重要經(jīng)濟(jì)產(chǎn)品?!緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究重點(diǎn)針對(duì)49份新疆本地保存的高代自交辣椒種質(zhì)和3份引進(jìn)辣椒種質(zhì)資源的13個(gè)主要果實(shí)性狀進(jìn)行研究分析,其中對(duì)7個(gè)果實(shí)表型性狀和6個(gè)果實(shí)品質(zhì)性狀分別采用常規(guī)實(shí)驗(yàn)技術(shù)和高效液相進(jìn)行調(diào)查,并利用變異分析、相關(guān)性分析、主成分分析和聚類(lèi)分析等多種統(tǒng)計(jì)分析方法,對(duì)52份辣椒種質(zhì)資源進(jìn)行評(píng)價(jià)與分類(lèi)。評(píng)價(jià)與分類(lèi)保存的辣椒種質(zhì)資源、為豐富辣椒種質(zhì)資源,挖掘優(yōu)異辣椒種質(zhì)資源和品種改良提供支撐。
材料共52份,其中中國(guó)種辣椒(C.chinenseL,ZL-280)1 份;灌木椒(C.frutescens,LA-111)1 份;鳥(niǎo)辣椒(C.frutescensL,X-260)1 份;一年生辣椒(C.chinense)合計(jì)49 份,其中線(xiàn)椒8 份,螺絲椒6份,板椒35份,板椒按果形又細(xì)分為牛角椒10份和羊角椒25份,供試材料均由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝所收集保存。表1
表1 52份辣椒種質(zhì)材料信息Table 1 Information of 52 pepper germplasms
1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)
田間試驗(yàn)于2019年3月開(kāi)始,至2020年11月結(jié)束,分別在新疆和海南兩地開(kāi)展。2019年3~9月和2020年3~9月在新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院安寧渠良種繁育場(chǎng)進(jìn)行第一、三個(gè)種植季,2019年10月~2020年3月在新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院三亞南繁中心進(jìn)行第二個(gè)種植季,試驗(yàn)地肥力均中等,田間試驗(yàn)均采取隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),雙行種植,株距40 cm,溝心距1.5 m,每小區(qū)單獨(dú)種植一個(gè)品種,共計(jì)20 株,合計(jì)52個(gè)小區(qū),并且全部采用膜下滴灌,栽培管理同大田[33]。
1.2.2 辣椒果實(shí)性狀
在每一季度果實(shí)成熟期,在每一小區(qū)內(nèi),隨機(jī)摘取辣椒4~6 節(jié)位的10個(gè)紅熟果實(shí)。根據(jù)李錫香等[34]出版的《辣椒種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》用游標(biāo)卡尺、細(xì)線(xiàn)、直尺等工具對(duì)果實(shí)類(lèi)型、果實(shí)縱徑、果實(shí)橫徑、果梗長(zhǎng)度等8個(gè)性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
1.2.3 辣椒果實(shí)品質(zhì)
對(duì)隨機(jī)摘取的成熟度一致果實(shí),經(jīng)自然晾干、破碎和過(guò)篩等步驟后,將辣椒粉末封裝保存,用于后續(xù)色價(jià)、辣椒素、辣椒紅素等辣椒主要果實(shí)品質(zhì)的測(cè)定。
1.2.3.1 辣椒色價(jià)
稱(chēng)取0.02 g 破碎處理過(guò)的辣椒粉末至10 ml離心管中,每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。然后向每管中加入5 mL丙酮,并放置在超聲波清洗器內(nèi)超聲30 min。超聲處理結(jié)束后離心5 min(轉(zhuǎn)速不低于4 000 r/min)。吸取約2 mL的上層提取液,用丙酮定容至5 mL,再用分光光度計(jì)在460 nm 波長(zhǎng)處,于1 cm 比色皿中測(cè)定稀釋后提取液的吸光度值。計(jì)算色價(jià):
式中A為實(shí)測(cè)標(biāo)樣的吸光度;f 為稀釋倍數(shù);m為樣品質(zhì)量,單位為g。
1.2.3.2 辣椒素類(lèi)物質(zhì)
辣椒素類(lèi)物質(zhì)的測(cè)定使用甲醇溶劑作為萃取劑,后使用高效液相色譜儀測(cè)定。稱(chēng)取0.5000 g的辣椒粉末至10 mL離心管中,后向管中加入5 mL 甲醇。然后放置在超聲波清洗器中超聲30 min,結(jié)束后在4 000 r/min下離心5 min,并將上清液轉(zhuǎn)移至10 ml 容量瓶中。在濾渣中重新加入5 mL 甲醇,超聲和離心結(jié)束后將2 次上清液合并,用甲醇定容至10 mL。將定容后的提取液倒入燒杯中,用帶有0.22μm 有機(jī)濾膜的一次性注射器過(guò)濾后用于色譜分析。色譜柱采用SymmetryORC18(5μm,4.6 mm×250 mm);流動(dòng)相為7:3的甲醇與超純水;流速為1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm;進(jìn)樣量為5μL;柱溫為35 ℃。
1.2.3.3 辣椒紅素
稱(chēng)取0.200 0 g 的辣椒粉末至10 mL 離心管中,向管中加3 mL 丙酮,超聲25 min,然后在3500 r/min 下離心5 min,再將上清液移至10 mL容量瓶。再依次向?yàn)V渣中加入3、4 mL丙酮,重復(fù)上述操作,并將3 次上清液合并后用丙酮定容至10 ml。將上清液倒入燒杯中,用帶有0.45μm 有機(jī)濾膜的一次性注射器過(guò)濾后用于色譜分析。色譜柱采用waters-3(5μm,4.6 mm×250 mm);流動(dòng)相為甲醇和二氯甲烷(25:75);流速為1 ml/min;進(jìn)樣量為5μL;色譜檢測(cè)波長(zhǎng)為474 nm;柱溫為30 ℃。
辣椒類(lèi)物質(zhì)和辣椒紅素均需要用標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),計(jì)算回歸公式,從而將吸光度換算為含量值,總辣椒素類(lèi)物質(zhì)含量和辣度均采用GB/T 21266-2007 計(jì)算得到[35]。
數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel 2019 和SPSS 25.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,圖形使用R 和Origin 2018 制作。果實(shí)表型性狀的分級(jí)采用陳雪燕等[36]描述的分級(jí)方法,根據(jù)數(shù)據(jù)的平均值(M)和標(biāo)準(zhǔn)差(S)將數(shù)據(jù)分為10 級(jí),第一級(jí)為Xi <(M- 2S)、第二級(jí)為(M- 2S)≤Xi <(M- 1.5S)、第三級(jí)為(M-1.5S)≤Xi <(M-S)、以此類(lèi)推,每0.5 S 為1 級(jí)直至第10 級(jí)Xi ≥(M+2S),計(jì)算果實(shí)表型性狀的頻率分布。
研究表明,13個(gè)指標(biāo)的變異系數(shù)均值為58.19%,果實(shí)表型性狀變異系數(shù)普遍較小,而果實(shí)品質(zhì)性狀變異系數(shù)普遍較大。
7個(gè)果實(shí)性狀的平均變異系數(shù)29.38%。以變異系數(shù)從大到小排序,單果重(50.42%)>胎座大小(39.36%)>果實(shí)橫徑(30.54%)>果實(shí)縱徑(29.78%)>果肉厚(21.58%)>果梗長(zhǎng)度(20.80%)>心室數(shù)(13.15%)。其中單果重的變異幅度(60.92)和變異系數(shù)(50.42%)均最高,在此52 份辣椒種質(zhì)中單果重存在豐富的遺傳變異。
以變異系數(shù)的從大到小排序,辣椒素含量(143.15%)>總辣椒素類(lèi)物質(zhì)含量(122.66%)>二氫辣椒素含量(104.52%)>辣度(102.54%)>辣椒紅素含量(43.61%)>色價(jià)(34.38%)。其中辣椒素含量、二氫辣椒素含量、總辣椒素類(lèi)物質(zhì)含量和辣椒紅素含量變異系數(shù)均在100%以上,52 份辣椒素種質(zhì)中這4個(gè)指標(biāo)的遺傳多樣性最為豐富,而辣椒紅素含量和色價(jià)變異系數(shù)均低于50%,這2個(gè)指標(biāo)在該份辣椒種質(zhì)資源中豐富性不高。魔鬼椒(ZL-280)的辣椒素含量(35.54 g/kg)、二氫辣椒素含量(12.39 g/kg)、總辣椒素類(lèi)物質(zhì)含量(53.25 g/kg)和辣度(3134)均最高,但辣椒紅素含量最低,僅為2.55 mg/kg。辣椒紅素和辣素呈反相關(guān)。
7個(gè)性狀均屬于正態(tài)分布。其中果梗長(zhǎng)度、胎座大小、單果重均在5級(jí)附近達(dá)到高峰,果實(shí)橫徑、果實(shí)縱徑、果肉厚以及心室數(shù)均在7級(jí)附近出現(xiàn)高峰。7個(gè)性狀的分布頻率出現(xiàn)高峰時(shí)等級(jí)不一致,但每一等級(jí)的分布頻率十分接近,7個(gè)指標(biāo)相關(guān)性較強(qiáng)。表2,圖1
表2 52份辣椒種質(zhì)果實(shí)性狀遺傳變異Table 2 Genetic variation analysis of fruit characters in 52 pepper germplasms
圖1 辣椒果實(shí)性狀頻率分布Fig.1 Frequency distribution of pepper fruit characters
研究表明,13個(gè)性狀之間存在著不同程度的極顯著或顯著正負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)介于-0.61 ~1。果實(shí)縱徑與果梗長(zhǎng)度呈極顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.46。果實(shí)橫徑與胎座大小呈極顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.93。果肉厚與果實(shí)橫徑、胎座大小呈極顯著正相關(guān),與果實(shí)縱徑、果梗長(zhǎng)度呈顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)介于0.32 ~0.70。心室數(shù)與果實(shí)橫徑、胎座大小極顯著正相關(guān),與果肉厚顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.49、0.42、0.29。單果重與果實(shí)縱徑、果實(shí)橫徑、胎座大小、果肉厚和心室數(shù)均呈極顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)介于0.40 ~0.88。色價(jià)與果實(shí)縱、橫徑和辣椒紅素均顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.29、0.30、0.26。辣椒素類(lèi)物質(zhì)含量與果實(shí)縱徑均顯著負(fù)相關(guān),與色價(jià)均極顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)性系數(shù)介于-0.39 ~-0.13。辣度與果實(shí)縱、橫徑等7個(gè)性狀極顯著負(fù)相關(guān),相關(guān)性系數(shù)介于-0.61 ~-0.28,辣度又與辣椒素類(lèi)物質(zhì)含量呈極顯著正相關(guān),相關(guān)性系數(shù)介于0.660 ~0.675。圖2
圖2 13個(gè)辣椒果實(shí)指標(biāo)的相關(guān)性Fig.2 Correlation analysis of 13 pepper fruit indexes
研究表明,提取了特征值大于1 的4個(gè)主成分,其貢獻(xiàn)率分別為38.39%、23.33%、11.30%、8.52%,累積貢獻(xiàn)率為81.54%,已足以代表全部指標(biāo)的大部分信息。
第一主成分的特征值為4.990,其貢獻(xiàn)率最高,為38.39%。其中單果重載荷值最大,為0.785,果實(shí)橫徑、胎座大小載荷較高且為正值,載荷值分別為0.716 和0.667,主要反映果實(shí)重量。載荷較高且為負(fù)值的性狀有辣椒紅素含量、辣椒素含量、二氫辣椒素含量和總辣椒素含量,載荷值介于-0.852~-0.706。第二主成分的特征值為3.033,貢獻(xiàn)率為23.33%。其中二氫辣椒素最高為0.654,辣椒素、總辣椒素等載荷均較高且為正值,主要反映果實(shí)辣度。第三主成分的特征值為1.469,貢獻(xiàn)率為11.30%。其中果梗長(zhǎng)和果實(shí)縱徑載荷值較高,分別為0.876、0.637,主要反映果實(shí)長(zhǎng)度,其余載荷值均較小。第四主成分的特征值為1.107,貢獻(xiàn)率為8.52%。其中辣椒紅素載荷值最大,為0.851,主要反映果實(shí)中辣椒紅素含量。表3
表3 13個(gè)辣椒果實(shí)指標(biāo)的主成分Table 3 Principal component analysis of 13 pepper fruit indexes
研究表明,在歐式距離5.0處,可以將這52份辣椒材料分為四個(gè)類(lèi)群。第一類(lèi)群只含有1份材料,為魔鬼椒,色價(jià)為3.57,總辣椒素類(lèi)物質(zhì)含量為53.25g/kg,該材料的獨(dú)特性。第二類(lèi)群包含2份材料,分別為鳥(niǎo)椒和灌木椒,平均色價(jià)為3.55,平均總辣椒素類(lèi)物質(zhì)含量為4.12 g/kg,該類(lèi)群資源色價(jià)最低,但總辣椒素含量較高。第三類(lèi)材料包含11 份材料,主要為一年生栽培辣椒種,其在閾值2.5 處,又可分為兩個(gè)亞群,第一亞群ⅢA 含有6份材料,包含1份線(xiàn)椒、2份羊角椒和3份牛角椒,平均色價(jià)為20.98,平均總辣椒素類(lèi)物質(zhì)含量為0.67g/kg;第二亞群ⅢB 包含5 份材料,且全為羊角椒,平均色價(jià)為24.89,平均總辣椒素類(lèi)物質(zhì)含量為0.55g/kg。第三類(lèi)群資源色價(jià)最高,但總辣椒素含量最低,第二亞群ⅢB 與第一亞群ⅢA相比,其色價(jià)更高,總辣素含量相對(duì)較低。第四類(lèi)材料涵蓋的種質(zhì)資源最為豐富,共包含38份材料,平均色價(jià)為13.94,平均總辣椒素類(lèi)物質(zhì)含量為3.13 g/kg,該類(lèi)群資源色價(jià)和總辣椒素含量均較高,當(dāng)閾值為2.5 時(shí),可分為三個(gè)亞群,第一亞群ⅣA共18份種質(zhì)材料,共包含10份羊角椒,6份牛角椒,2 份線(xiàn)椒;第二亞群ⅣB 所含種質(zhì)資源最為豐富,共19 份材料,其中6 份羊角椒,6 份螺絲椒,5份線(xiàn)椒,2份牛角椒;第三亞群ⅣC僅有一份材料,為羊角椒(GB-35),其色價(jià)為13.63,總辣椒素含量?jī)H低于魔鬼椒為7.31,該份種質(zhì)資源較為獨(dú)特。圖3
圖3 52份辣椒種質(zhì)資源聚類(lèi)Fig.3 Cluster analysis of 52 pepper germplasm resources
種質(zhì)資源是作物遺傳育種的重要基礎(chǔ),而種質(zhì)資源的遺傳多樣性是評(píng)價(jià)種質(zhì)資源是否豐富的重要指標(biāo),種質(zhì)資源越豐富[37]。目前,采用形態(tài)學(xué)性狀進(jìn)行辣椒種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究很多,并且均取得了不錯(cuò)的研究成果[13,15-17,20]。分子標(biāo)記技術(shù)利用基因進(jìn)行遺傳多樣性研究,研究結(jié)果更為穩(wěn)定和可靠,利用分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)的研究日益增多[21-32]。并且形態(tài)學(xué)標(biāo)記性狀易獲得,且簡(jiǎn)單、直接[38,39]。52份辣椒種質(zhì)資源的13個(gè)主要果實(shí)性狀平均變異系數(shù)為58.19%,遺傳多樣性較為豐富,與前人研究結(jié)果相似[19]。研究中果實(shí)縱徑、果實(shí)橫徑和果梗長(zhǎng)度等7個(gè)主要果實(shí)表型性狀的變異系數(shù)均值僅為29.38%,這52 份辣椒種質(zhì)在果實(shí)表型方面種質(zhì)資源類(lèi)型不夠豐富,而色價(jià)、辣椒紅素含量、辣椒素含量等6個(gè)果實(shí)品質(zhì)性狀的變異系數(shù)均值高達(dá)91.81%,這52 份辣椒種質(zhì)在果實(shí)品質(zhì)方面具有豐富的遺傳多樣性。
相關(guān)性分析是能夠反映變量間關(guān)聯(lián)密切程度的一種統(tǒng)計(jì)方法,目前也已廣泛應(yīng)用于辣椒研究中[14,15,20]。研究通過(guò)SPSS 25.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析表明,果實(shí)橫徑、胎座大小、果肉厚、心室數(shù)以及單果重兩兩之間均存在顯著正相關(guān);色價(jià)與辣椒素類(lèi)物質(zhì)含量和辣度之間呈極顯著負(fù)相關(guān);辣椒素類(lèi)物質(zhì)含量和辣度之間均呈極顯著正相關(guān),研究結(jié)果與前人相似[14,20]。
聚類(lèi)分析是種質(zhì)資源分類(lèi)研究常用的一種統(tǒng)計(jì)方法,其在辣椒種質(zhì)資源研究中也已被廣泛應(yīng)用[14-19,23-26,31]。研究主成分分析表明,單果重、果實(shí)大小、辣度及辣椒紅素含量是辣椒果實(shí)的4個(gè)主要因子;52辣椒種質(zhì)在果實(shí)品質(zhì)方面遺傳差異較大;并且在辣椒中,色價(jià)和辣度常作為辣椒品質(zhì)的重要評(píng)判性狀[14]。將52份辣椒種質(zhì)分為4大類(lèi),并成功將魔鬼椒、鳥(niǎo)椒和灌木椒這3份特殊材料與一年生辣椒栽培種區(qū)分開(kāi)來(lái),與前人研究結(jié)果部分相似[16]。四大類(lèi)群中,第三類(lèi)群平均色價(jià)最高,其中又以第二亞群ⅢB 平均色價(jià)最高,達(dá)24.89,且全為羊角椒,可用于后期高色價(jià)制干辣椒的育種和色素研究中。在第四類(lèi)材料中,GB-35被單獨(dú)分離出來(lái),其色價(jià)為13.63,總辣椒素含量為7.31 g/kg,可作為高色價(jià)、高辣素的遺傳育種材料。
52 份辣椒種質(zhì)資源13個(gè)主要果實(shí)性狀均存在不同程度的變異,變異系數(shù)介于13.15%~143.15%,變異系數(shù)均值為58.19%,這52 份辣椒種質(zhì)資源遺傳多樣性比較豐富。其中果實(shí)品質(zhì)相關(guān)性狀遺傳多樣性最為豐富,變異系數(shù)均值達(dá)91.81%。在歐式距離7.5處,可將灌木椒、鳥(niǎo)椒和魔鬼椒與一年生辣椒區(qū)分開(kāi)來(lái);在歐式距離5.0處,可將52 份辣椒種質(zhì)分為四大類(lèi),其中第三類(lèi)群第二亞群ⅢB 的5 份羊角椒材料色價(jià)最高,第四類(lèi)材料中存在一份高色價(jià)、高辣素的特殊材料,均可用于后期辣椒果實(shí)品質(zhì)的品種改良。