攜帶OX40L重組溶瘤病毒的構(gòu)建及靶向殺傷肝癌的研究*

楊 豪 鄧卓雅 孫 芳 雷光林 程晉霞 于洪妤田崇瑜 張紹庚** 楊鵬輝**

（1）中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心，北京 100039；2）河北北方學(xué)院，張家口 075000）

免疫療法旨在改善機(jī)體免疫能力，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，免疫制劑通過激活或增強(qiáng)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，利用機(jī)體自身的免疫機(jī)制攻擊癌細(xì)胞，促進(jìn)機(jī)體對(duì)癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答，抑制癌組織生長(zhǎng)［1-2］。免疫療法是一種通過重塑免疫系統(tǒng)抑制腫瘤生長(zhǎng)的治療手段，主要分為主動(dòng)免疫、被動(dòng)免疫和聯(lián)合免疫，包括檢查點(diǎn)抑制劑、CAR-T療法、溶瘤病毒、非特異性免疫調(diào)節(jié)劑等［3-4］。免疫療法彌補(bǔ)了手術(shù)、傳統(tǒng)放化療在腫瘤治療領(lǐng)域的局限性，在預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)方面也發(fā)揮著積極作用。免疫療法改變了腫瘤治療方式，逐步成為極具潛力的臨床治療手段，被認(rèn)為是治療甚至治愈癌癥最有前途的策略［5］。

溶瘤病毒（oncolytic viruses，OVs）是一類重要的免疫治療藥物，可以是天然存在或基因工程技術(shù)設(shè)計(jì)的病毒［6］。研究表明，OVs可選擇性感染腫瘤細(xì)胞，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制，最終裂解細(xì)胞，并釋放大量的腫瘤抗原和新抗原，激活機(jī)體的免疫反應(yīng)，抑制腫瘤生長(zhǎng)［7-9］。溶瘤病毒具有選擇性裂解腫瘤細(xì)胞、激活免疫系統(tǒng)的組合效應(yīng)，使其成為潛在的原位腫瘤疫苗［10-11］。隨著基因工程技術(shù)的進(jìn)步，越來越多的研究人員將免疫檢查點(diǎn)抑制劑嵌合在溶瘤病毒基因組序列上，構(gòu)建重組溶瘤病毒，以優(yōu)化靶向性，增強(qiáng)免疫原性。目前已有4款溶瘤病毒產(chǎn)品上市，用于惡性腫瘤的臨床治療［12-14］。溶瘤病毒療法效果存在個(gè)體差異性，且治療范圍較為局限，盡管如此，溶瘤病毒療法作為最有前途的免疫治療方式，值得深入研究。

溶瘤病毒免疫治療的最終目的是刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，激活T細(xì)胞，抑制腫瘤生長(zhǎng)。T細(xì)胞的活化不僅由抗原刺激T細(xì)胞受體介導(dǎo)，也可由共刺激分子的共刺激信號(hào)介導(dǎo)，抗原與共刺激信號(hào)的結(jié)合能更好地激活T 細(xì)胞［15］。T 細(xì)胞表面表達(dá)的CD28 和抗原提呈細(xì)（APC）表面的CD80/CD86 是最著名的共刺激信號(hào)；腫瘤壞死因子（TNF）受體超家族OX40（CD134）與其同源性配體OX40L（CD134L，CD252）結(jié)合參與T 細(xì)胞與APC 細(xì)胞的相互作用，也可為激活T細(xì)胞提供重要的共刺激信號(hào)［16-17］。在抗原呈遞發(fā)生后，兩種分子的表達(dá)增加，同時(shí)建立多種促炎因子信號(hào)通路，包括CD28連接，CD40L連接和干擾素γ 信號(hào)傳導(dǎo)。它們的相互作用促進(jìn)T細(xì)胞激活，增加效應(yīng)細(xì)胞因子的產(chǎn)生并增強(qiáng)細(xì)胞遷移率［18］。研究表明，OX40-OX40L 相互作用可增強(qiáng)CD4+、CD8+T細(xì)胞功能，增強(qiáng)T細(xì)胞的抗腫瘤活性［19-20］。調(diào)節(jié)OX40-OX40L 通路可以影響體內(nèi)腫瘤的發(fā)病機(jī)制，可作為治療人類自身免疫性疾病的潛在靶點(diǎn)［21-22］。Porciuncula 等［23］研 究 發(fā) 現(xiàn)，OX40L能明顯改善人非小細(xì)胞肺癌預(yù)后，Moderna公司基于OX40L的mRNA-2752免疫療法，在治療實(shí)體瘤和淋巴瘤患者的臨床Ⅰ期試驗(yàn)顯現(xiàn)了良好的抗腫瘤效果（clinicaltrials.gov）。本研究利用課題組前期成熟的流感病毒反向遺傳學(xué)（reverse genetics，RG）技術(shù)，以A/PuertoRico/8/34（PR8）為骨架，將編碼OX40L的基因片段嵌合在NS片段特定位置，成功拯救獲得重組溶瘤流感病毒rFlu-OX40L，并通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)重組病毒靶向殺傷肝癌細(xì)胞的效果，有望為肝癌的臨床免疫治療提供新策略。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

質(zhì)粒提取試劑盒、轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自德國(guó)QⅠAGEN 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自全式金公司；UltraSYBR Mix 購(gòu)自康為世紀(jì)； Trizol 購(gòu)自Ⅰnvitrogen 公司；MTS 試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega 公司；Annexin V-FⅠTC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；Brilliant Violet 510?anti-mouse CD3、 FⅠTC anti-mouse CD4、 PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD8a、APC anti-mouse CD45、PE antimouse CD69均購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司；小鼠淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。

1.2 菌種與質(zhì)粒

PR8流感病毒的8個(gè)骨架質(zhì)粒（pHW191-PB2、pHW192-PB1、 pHW193-PA、 pHW194-HA、pHW195-NP、 pHW196-NA、 pHW197-M、pHW198-NS）均由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)購(gòu)自TianGen公司；pHW2000載體質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 細(xì)胞與病毒

非洲綠猴腎細(xì)胞COS Ⅰ 細(xì)胞、犬腎細(xì)胞MDCK均采購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；人正常肝細(xì)胞L02、人肝癌細(xì)胞HepG2、Huh7 均購(gòu)自ATCC（American Type Culture Collection）細(xì)胞庫(kù)；小鼠肝癌細(xì)胞H22由解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心保存；流感病毒A/Puerto Rico/8/34（PR8）由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF雞胚購(gòu)自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司；4～6 周齡雌Balb/c 小鼠購(gòu)自維通利華；所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的指導(dǎo)方針進(jìn)行。

1.5 重組質(zhì)粒pFlu-OX40L-NS構(gòu)建

在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Ⅰnformation，NCBⅠ）獲得OX40L 基因序列，經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研及生物信息學(xué)預(yù)測(cè)分析，將OX40L 基因組開放閱讀框序列經(jīng)優(yōu)化后插入流感病毒PR8 骨架質(zhì)粒NS 基因第406 位點(diǎn)。重組序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成?？寺∪雙HW2000 載體，并通過陽性克隆測(cè)序驗(yàn)證。

1.6 拯救重組溶瘤流感病毒rFlu-OX40L

將非洲綠猴腎細(xì)胞COSⅠ 細(xì)胞、犬腎細(xì)胞MDCK 在6 孔細(xì)胞板按2∶1 比例共培養(yǎng)，細(xì)胞數(shù)4×105個(gè)/孔。細(xì)胞長(zhǎng)至單層約70%～80%，棄上清，PBS 洗3 次，換無抗無血清DMEM 培養(yǎng)基，按Effectene 轉(zhuǎn)染試劑盒 （QⅠAGEN， Hilden，Germany）說明書轉(zhuǎn)染。重組質(zhì)粒pFlu-OX40L-NS與PR8 其余7個(gè)骨架質(zhì)粒（pHW191-PB2、pHW192-PB1、 pHW193-PA、 pHW194-HA、pHW195-NP、pHW196-NA、pHW197-M）均稀釋至200 μg/L，各取1 μl 等量混勻，共轉(zhuǎn)染COSⅠ /MDCK 細(xì)胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱放置72 h 后，-80℃冰箱凍存。

1.7 鑒定重組溶瘤流感病毒rFlu-OX40L

1.7.1 血凝實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)染后細(xì)胞反復(fù)凍融1 次后，接種9～11 日齡SPF 雞胚，200 μl/枚，每個(gè)轉(zhuǎn)染孔接種2 枚雞胚，接種后蠟塊封口，置37℃孵育箱孵育，72 h后4℃冰箱過夜。收取雞胚尿囊液100 μl，倍比稀釋后，用1%雞紅細(xì)胞測(cè)定血凝效價(jià)。

1.7.2 TCⅠD50測(cè)定

MDCK細(xì)胞鋪96孔細(xì)胞板，細(xì)胞計(jì)數(shù)2×104/孔。細(xì)胞密度長(zhǎng)至70%～80%，棄培養(yǎng)基，PBS 洗3 次。重組溶瘤流感病毒rFlu-OX40L 依次按10-1、10-2、10-3、10-4……10-10倍比稀釋后，接種MDCK細(xì)胞，5 d 后觀察細(xì)胞狀態(tài)，用1%雞紅細(xì)胞測(cè)定血凝效價(jià)。

1.7.3 RT-PCR鑒定

Trizol法提取重組溶瘤流感病毒rFlu-OX40L的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后，用甲型流感病毒NS 通用引物擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物跑瓊脂糖凝膠電泳，用pHW198-NS 做對(duì)照。瓊脂糖凝膠電泳鑒定后PCR產(chǎn)物送生工測(cè)序。

1.7.4 電鏡觀察重組溶瘤流感病毒rFlu-OX40L

重組溶瘤流感病毒rFlu-OX40L 按1∶5 000 倍稀釋，接種9～11日齡雞胚，200 μl/枚。72 h后收取陽性雞胚尿囊液，4 000 r/min離心25 min后，取上清經(jīng)100 ku 膜包超濾，30%和60%的蔗糖梯度離心，32 000 r/min離心4 h，PBS脫糖，32 000 r/min離心2 h，獲得純化后rFlu-OX40L病毒，負(fù)染透射電鏡觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)與大小分布。

1.8 體外評(píng)價(jià)重組溶瘤流感病毒rFlu-OX40L生物學(xué)活性

1.8.1 重組病毒在MDCK細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

評(píng)價(jià)重組溶瘤流感病毒rFlu-OX40L 體外復(fù)制能力，用無血清的DMEM按10-1、10-2、10-3、10-4……10-10倍比稀釋后，接種MDCK 細(xì)胞，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱，分別在12、24、48、72、96 h取上清液，測(cè)病毒滴度。

1.8.2 MTS細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

人正常肝細(xì)胞L02、人肝癌細(xì)胞HepG2 和Huh7 分別鋪96 孔細(xì)胞板，細(xì)胞計(jì)數(shù)1×104/孔，細(xì)胞長(zhǎng)至單層70%～80% 后，分別按感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）0.1、1、3 接種，并設(shè)置陰性對(duì)照，于37℃、5% CO2培養(yǎng)24、48、72 h后，棄上清，PBS洗3次，加MTS試劑，37℃溫箱避光孵育30 min 后，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢測(cè)490 nm處吸光度值（A490）。

1.8.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞死亡方式

L02、Huh7分別鋪6孔細(xì)胞板，細(xì)胞長(zhǎng)至單層70%～80%后，重組溶瘤流感病毒rFlu-OX40L 按MOI值為1、3 感染細(xì)胞，并設(shè)置空白對(duì)照。感染48 h后，根據(jù)Annexin V-FⅠTC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書操作，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.9 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)重組溶瘤流感病毒rFlu-OX40L溶瘤效果

1.9.1 肝癌荷瘤小鼠模型的建立

用4～6周齡雌性Balb/c小鼠，腹腔注射小鼠肝癌細(xì)胞H22，5～7 d后腹水形成，取腹水，3 000 r/min離心5 min，棄上清，PBS 重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)5×106/只，于小鼠右側(cè)腹股溝皮下接種。待瘤體長(zhǎng)至80～120 mm3，隨機(jī)分3 組（PBS 陰性對(duì)照組、PR8 陽性對(duì)照組、rFlu-OX40L 實(shí)驗(yàn)組），6 只/組，每隔1 d 瘤內(nèi)分別接種PBS、PR8、重組溶瘤流感病毒rFlu-OX40L，連續(xù)接種7次，接種劑量分別為100 μl、3×105TCⅠD50/100 μl、3×106TCⅠD50/100 μl，每隔1 d測(cè)量小鼠腫瘤體積并觀察小鼠生命體征。

1.9.2 病毒載量測(cè)定

MDCK細(xì)胞鋪96孔細(xì)胞板，細(xì)胞計(jì)數(shù)2×104/孔。細(xì)胞密度長(zhǎng)至70%～80%，棄培養(yǎng)基，PBS 洗3 次。取小鼠心、肝、脾、肺、腎、腦、腫瘤組織至無血清DMEM 后研磨，12 000 r/min 離心1 min 后吸取上清，上清依次按10-1、10-2、10-3、10-4……10-10倍比稀釋后，感染MDCK細(xì)胞，5 d后觀察細(xì)胞狀態(tài)，并用1%雞紅細(xì)胞測(cè)定上清液TCⅠD50。

1.9.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞

取小鼠脾組織研磨過濾，濾液沿離心管管壁緩慢加入6 ml小鼠淋巴細(xì)胞分離液（達(dá)優(yōu)），分離小鼠淋巴細(xì)胞，用含2% 胎牛血清的生理鹽水（FACE 液） 配置抗體，每管樣品分別加CD3、CD4、CD8、CD45、CD69 抗 體1 μl、FACE 液100 μl，充分混勻后4℃避光孵育30 min，F(xiàn)ACE洗液洗去多余抗體，8 000 r/min離心1 min后棄上清，加入4%多聚甲醛200 μl/管，避光20 min后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用統(tǒng)計(jì)軟件GraphPad Prism 8.0 分析數(shù)據(jù)，采用單因素t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pFlu-OX40L-NS的構(gòu)建與鑒定

將OX40L 基因組開放閱讀框序列552 bp，插入PR8 骨架質(zhì)粒NS 序列，構(gòu)建策略見圖1a，大小為1 477 bp，克隆入pHW2000載體；由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，重組質(zhì)粒pFlu-OX40L-NS與pHW198-NS跑瓊脂糖凝膠電泳鑒定。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒片段大小與預(yù)期一致（圖1b），表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

Fig.1 Construction and identification of recombiant plasmid pFlu-OX40L-NS

2.2 重組溶瘤流感病毒rFlu-OX40L的拯救及全面鑒定

重組質(zhì)粒pFlu-OX40L-NS與PR8其余7個(gè)骨架質(zhì)粒（pHW191-PB2、pHW192-PB1、pHW193-PA、pHW194-HA、 pHW195-NP、 pHW196-NA、pHW197-M）等量混勻后，共轉(zhuǎn)染COSⅠ /MDCK細(xì)胞（圖2a），成功拯救重組溶瘤流感病毒，命名為rFlu-OX40L。重組溶瘤流感病毒rFlu-OX40L，第一代血凝效價(jià)25～26，經(jīng)SPF 雞胚穩(wěn)定傳代后，血凝效價(jià)可達(dá)27～28（圖2b），病毒滴度達(dá)7～8 Lg(TCⅠD50/ml)（圖2c）。

Fig.2 Stability of recombinant virus rFlu-OX40L

2.3 RT-PCR鑒定

Trizol法提取重組溶瘤流感病毒rFlu-OX40L的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用甲型流感病毒NS 通用引物擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物跑膠結(jié)果顯示，重組溶瘤流感病毒rFlu-OX40L 中NS 片段大小與重組質(zhì)粒pFlu-OX40L-NS 大小一致（圖3），PCR 產(chǎn)物送生工測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期完全一致。

Fig.3 NS segment of rFlu-OX40L was identified with RT-PCR method

2.4 電鏡觀察重組病毒rFlu-OX40L形態(tài)

重組溶瘤流感病毒rFlu-OX40L 經(jīng)蔗糖濃度梯度純化后，負(fù)染透射電鏡觀察，其形態(tài)呈球形，核衣殼表面有囊膜包裹，囊膜表面有纖毛（圖4a），病毒顆粒大小分布在80～120 nm 之間（圖4b），具有流感病毒典型的形態(tài)特征。

Fig.4 Morphology of recombinant oncolytic virus rFlu-OX40L under electron microscope(a)and size distribution of rFlu-OX40L virus(b)

2.5 重組溶瘤流感病毒rFlu-OX40L的生長(zhǎng)曲線

重組溶瘤流感病毒rFlu-OX40L 用無血清DMEM 按10-1、10-2、10-3、10-4……10-10倍比稀釋后，感染MDCK 細(xì)胞，分別在24、48、72、96 h取上清測(cè)定血凝效價(jià)。結(jié)果顯示，重組溶瘤流感病毒效價(jià)逐漸升高，72 h 時(shí)HA 效價(jià)達(dá)峰值為27，到96 h呈明顯下降趨勢(shì)（圖5）。結(jié)果表明：重組溶瘤病毒株rFlu-OX40L與PR8毒株生長(zhǎng)趨勢(shì)相一致。

Fig.5 Growth kinetics of recombinant virus rFlu-OX40L

2.6 MTS檢測(cè)重組病毒rFlu-OX40L對(duì)肝癌細(xì)胞活力的影響

人正常肝細(xì)胞L02、人肝癌細(xì)胞HepG2 和Huh7 分別鋪96 孔板，重組溶瘤流感病毒rFlu-OX40L按MOI值為0.1、1、3感染細(xì)胞，并設(shè)置陰性對(duì)照，培養(yǎng)24、48、72 h 后加MTS 試劑，顯色30 min后上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果顯示，重組溶瘤流感病毒rFlu-OX40L 可顯著降低HepG2 和Huh7 的細(xì)胞活力，對(duì)正常肝細(xì)胞L02 無明顯影響，且隨時(shí)間延長(zhǎng)、劑量增加，肝癌細(xì)胞活力明顯降低，呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性（圖6）。

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)重組溶瘤流感病毒rFlu-OX40L誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果

重組溶瘤流感病毒rFlu-OX40L 按MOI值為1、3 分 別 感 染L02、HepG2 細(xì) 胞，48 h 后 按 照Annexin V-FⅠTC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑說明書操作，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況（圖7）。結(jié)果顯示，HepG2 細(xì)胞感染重組溶瘤流感病毒rFlu-OX40L 凋亡率分別為10.91%、19.08%，對(duì)照組為8.46%（P＜0.001）。結(jié)果表明，重組溶瘤流感病毒rFlu-OX40L 可誘導(dǎo)HepG2 細(xì)胞凋亡，并呈現(xiàn)劑量依賴性。

Fig.6 Cell viability of rFlu-OX40L virus on different hepatocyte cell lines were detected with MTS assay

Fig.7 Cell apoptosis induced by rFlu-OX40L virus were detected with flow cytometry

2.8 重組病毒rFlu-OX40L在動(dòng)物體內(nèi)的抑瘤效果

肝癌小鼠瘤體體積達(dá)80～120 mm3時(shí)，分別接種PBS、PR8 和rFlu-OX40L，每隔1 d 接種1 次，連續(xù)接種7次，每次接種前測(cè)量小鼠體積變化，最后一次接種7 d后，取小鼠腫瘤組織，稱量腫瘤體積及重量；取小鼠肝、肺、腫瘤組織做病理切片；心、肝、脾、肺、腎、腦、腫瘤組織研磨后過濾，離心取上清，測(cè)量各組織病毒載量；小鼠脾組織研磨后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD3+、CD4+、CD8+、CD45+、CD69+變化。結(jié)果顯示：重組溶瘤流感病毒rFlu-OX40L組與PBS和PR8組相比，rFlu-OX40L組小鼠腫瘤體積變化明顯比PBS 和PR8 組緩慢（圖8a），處死小鼠，分離腫瘤組織，rFlu-OX40L組體積、重量明顯小于PBS 和PR8 組（圖8b～d）；PBS組小鼠各組織未檢測(cè)到病毒；PR8組僅在腫瘤組織中檢測(cè)到病毒，滴度為3～4 LgTCⅠD50/ml；重組溶瘤流感病毒rFlu-OX40L 實(shí)驗(yàn)組僅在腫瘤組織中檢測(cè)到病毒，滴度為7～8 LgTCⅠD50/ml，且實(shí)驗(yàn)組明顯高于PR8對(duì)照組（圖8e）；實(shí)驗(yàn)組小鼠的脾組織經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)可見CD4+CD69+T 達(dá)34.4%、CD8+CD69+T 達(dá)33.5%，與PR8、PBS 組相比明顯升高（圖8f）。結(jié)果表明，重組溶瘤流感病毒rFlu-OX40L 可顯著抑制小鼠腫瘤生長(zhǎng)，在腫瘤部位可檢測(cè)到較高病毒載量，且小鼠脾臟T細(xì)胞數(shù)量顯著增加，推測(cè)重組病毒rFlu-OX40L 可激活T細(xì)胞，從而靶向殺傷腫瘤細(xì)胞發(fā)揮抑瘤效果。

Fig.8 Oncolytic effect of rflu-OX40L was evaluated in vivo

3 討 論

OX40L 是TNF 超家族成員，是一種由多種免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞表達(dá)的共刺激分子，已被證明其參與T細(xì)胞活化，增強(qiáng)T細(xì)胞的抗腫瘤活性［24］。OX40L 信號(hào)對(duì)于成熟的CD4+T 細(xì)胞活化和CD4+記憶T細(xì)胞的產(chǎn)生至關(guān)重要［25］?；罨疌D4+T細(xì)胞上OX40L，對(duì)建立有效的T 細(xì)胞免疫具有輔助作用，能有效增強(qiáng)免疫系統(tǒng)對(duì)抗癌癥［26］。OX40 和OX40 配體（OX40L） 作為必需的免疫檢查點(diǎn)（ⅠC）調(diào)節(jié)劑，與癌癥免疫調(diào)節(jié)以及腫瘤微環(huán)境（TME）高度相關(guān)［27］。利用OX40L 這一特性，研究人員嘗試將OX40L 作為腫瘤治療的靶點(diǎn)，與不同的抗癌藥物結(jié)合，增強(qiáng)機(jī)體免疫，抑制腫瘤生長(zhǎng)。

本課題組前期構(gòu)建了成熟的流感病毒8質(zhì)粒病毒拯救技術(shù)平臺(tái)，成功拯救了嵌合GM-CSF、CTLA4 抗體的多株重組溶瘤流感病毒株［28-29］。利用這一技術(shù)平臺(tái)，將OX40L 基因組序列，構(gòu)建在PR8流感病毒株的NS片段上，克隆入pHW2000載體，通過陽性克隆驗(yàn)證其片段大小與預(yù)期一致。利用RG 技術(shù)成功拯救的重組溶瘤流感病毒株rFlu-OX40L，可在雞胚連續(xù)穩(wěn)定傳代，HA 效價(jià)達(dá)27～28，病毒滴度達(dá)7～8 LgTCⅠD50/ml；重組溶瘤流感病毒株rFlu-OX40L 的NS 片段經(jīng)RT-PCR 鑒定，片段大小與預(yù)期一致；電鏡觀察重組溶瘤流感病毒株rFlu-OX40L 呈球型，大小在80～120 nm 之間，形態(tài)結(jié)構(gòu)與流感病毒典型特征相符；重組溶瘤流感病毒株rFlu-OX40L 在MDCK 細(xì)胞上72 h 達(dá)到病毒復(fù)制高峰；MTS 法與傳統(tǒng)的MTT 法相比，具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、節(jié)省時(shí)間的優(yōu)勢(shì)，因此選用MTS 法檢測(cè)重組溶瘤流感病毒株rFlu-OX40L 對(duì)細(xì)胞活力的影響，結(jié)果表明rFlu-OX40L 對(duì)正常的肝細(xì)胞沒有影響，但可顯著抑制肝癌細(xì)胞活力；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果與MTS 法檢測(cè)一致，表明重組溶瘤流感病毒株rFlu-OX40L 可選擇性殺傷肝癌細(xì)胞，而對(duì)正常細(xì)胞無明顯影響，且3MOI時(shí)效果更加顯著；肝癌荷瘤小鼠模型瘤內(nèi)注射重組溶瘤流感病毒株rFlu-OX40L 后，小鼠腫瘤體積明顯比PR8組、PBS組增長(zhǎng)緩慢；重組溶瘤流感病毒株rFlu-OX40L 組中小鼠腫瘤組織病毒載量明顯高于其他組織；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)重組溶瘤流感病毒株rFlu-OX40L組小鼠脾組織中CD4+CD69+T、CD8+CD69+T 細(xì)胞明顯高于PR8、PBS 組，推測(cè)重組病毒rFlu-OX40L 可通過激活機(jī)體T 細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，靶向殺傷腫瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用。

本研究仍存在諸多不足，如重組溶瘤病毒rFlu-OX40L 在體內(nèi)的安全性評(píng)價(jià)（急性毒性、過敏、熱源、長(zhǎng)期毒性等），對(duì)其他實(shí)體腫瘤（肺癌、乳腺癌等）是否具有廣譜殺傷效果，以及如何確定最佳給藥劑量、給藥間隔、給藥途徑等以達(dá)到最佳的抗腫瘤效果等問題，仍需后續(xù)深入研究不斷完善。

綜上所述，本研究基于流感病毒RG技術(shù)，成功構(gòu)建、拯救了攜帶OX40L 外源基因的重組溶瘤流感病毒株rFlu-OX40L，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其靶向殺傷肝癌細(xì)胞的效果，有望為腫瘤的免疫治療提供理論依據(jù)。那么，攜帶OX40L 的重組流感病毒rFlu-OX40L 能否與其他免疫治療藥物聯(lián)合應(yīng)用發(fā)揮協(xié)同作用？攜帶多種靶基因的重組流感病毒能否起到更強(qiáng)的抗腫瘤免疫效果？這些研究工作還有待后續(xù)進(jìn)一步探索。

4 結(jié) 論

本研究利用基因工程技術(shù)成功構(gòu)建了嵌合OX40L的重組NS質(zhì)粒，并成功拯救了表達(dá)OX40L的重組溶瘤流感病毒，經(jīng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其靶向殺傷肝癌細(xì)胞的能力。