劉利華 張楠楠 戈寧寧 董海新

作者單位：272007 山東濟(jì)寧，濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科（劉利華、戈寧寧、董海新），呼吸與重癥醫(yī)學(xué)科（張楠楠）

近年來(lái)，我國(guó)布氏桿菌?。ú疾。┑陌l(fā)病率不斷上升，疫情形勢(shì)嚴(yán)峻［1-2］。布氏桿菌感染患者的臨床表現(xiàn)多樣，該菌可經(jīng)消化道、呼吸道、生殖器官以及皮膚損傷等多種途徑感染［1］。其中羊是主要傳染源，其次是牛和豬［3］。布病患者大多有病畜接觸史，可由飲食被污染的奶制品或未熟的牛、羊肉引起［4］。由于布氏桿菌培養(yǎng)的遲緩期較長(zhǎng)，生長(zhǎng)期較短，且布氏桿菌病的臨床表現(xiàn)多樣，由于臨床醫(yī)師對(duì)該病的認(rèn)識(shí)不足而容易造成誤診及漏診，導(dǎo)致臨床治療效果較差［5］，因此探索快速有效鑒定布氏桿菌的方法是重要的研究任務(wù)。有文獻(xiàn)報(bào)道，檢測(cè)布氏桿菌使用骨髓標(biāo)本優(yōu)于血標(biāo)本，但臨床抽取患者骨髓時(shí)細(xì)胞量過(guò)少，且給患者帶來(lái)痛苦，因此骨髓培養(yǎng)不宜作為篩查布氏桿菌的常規(guī)方法，臨床通常使用血液標(biāo)本篩查。本研究主要探討血培養(yǎng)布氏桿菌陽(yáng)性患者的臨床診斷及感染特征，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 收集本院2019 年1—12 月送檢的13 455 份血培養(yǎng)和骨髓培養(yǎng)標(biāo)本，患者平均年齡為（44.21±12.24）歲，分布科室為呼吸內(nèi)科、血液科、感染性疾病科、重癥醫(yī)學(xué)科、急診科、風(fēng)濕免疫科等。

1.2 儀器與試劑 Bact/Alert3 D全自動(dòng)培養(yǎng)儀、全自動(dòng)微生物鑒定儀及原裝配套血培養(yǎng)瓶均購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃公司。質(zhì)量控制（質(zhì)控）菌株為大腸埃希菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923。

1.3 樣本采集 疑似患者可只采集需氧瓶2 套，成人每瓶采集靜脈血8～10 mL 注入中和抗菌藥物的需氧瓶，經(jīng)儀器掃描識(shí)別后，直接放入培養(yǎng)儀自動(dòng)檢測(cè)。

1.4 疑似布病患者血培養(yǎng)處理流程

1.4.1 陽(yáng)性培養(yǎng)瓶的處理 將全自動(dòng)血培養(yǎng)系統(tǒng)陽(yáng)性報(bào)警的培養(yǎng)瓶采用平板劃線法轉(zhuǎn)種于血平板，置于35 ℃、5%～10% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～48 h 后觀察，對(duì)疑似布氏桿菌生長(zhǎng)的菌落直接進(jìn)行涂片革蘭染色鏡檢，鏡下可見(jiàn)革蘭陰性（Gram negative，G-）短小球桿菌呈沙灘細(xì)沙樣排列。布氏桿菌為苛養(yǎng)菌，對(duì)所需營(yíng)養(yǎng)要求高，轉(zhuǎn)接種血平板培養(yǎng)24 h 后肉眼可見(jiàn)劃線第一區(qū)有小片濕潤(rùn)的薄菌苔?？焖倌蛎冈囼?yàn)5 min 內(nèi)可見(jiàn)尿素水解試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性，這時(shí)應(yīng)高度懷疑為是布氏桿菌，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后，菌落呈微小針尖狀，96 h 后可見(jiàn)透明、濕潤(rùn)、細(xì)小、無(wú)色、不溶于血的菌落生長(zhǎng)。挑取單個(gè)菌落涂片染色，鏡檢為G-短小球狀菌，同時(shí)經(jīng)全自動(dòng)微生物鑒定儀鑒定為馬耳他布魯菌，發(fā)出陽(yáng)性報(bào)告同時(shí)上報(bào)疫情。但如果對(duì)儀器顯示陽(yáng)性的培養(yǎng)瓶進(jìn)行涂片和革蘭染色鏡檢未見(jiàn)病原菌，需要觀察細(xì)菌生長(zhǎng)曲線特點(diǎn)，如果遲緩期較長(zhǎng)，生長(zhǎng)期較短，生長(zhǎng)期對(duì)應(yīng)的縱軸較短，穩(wěn)定期平緩，則高度懷疑布氏桿菌，繼續(xù)培養(yǎng)，隔日觀察，延長(zhǎng)至1 個(gè)月未見(jiàn)生長(zhǎng)的則判斷為陰性，發(fā)出陰性報(bào)告。

1.4.2 陰性培養(yǎng)瓶的處理 培養(yǎng)瓶經(jīng)儀器培養(yǎng)檢測(cè)5 d 顯示陰性者，進(jìn)行盲目轉(zhuǎn)種培養(yǎng)，轉(zhuǎn)種方法同陽(yáng)性培養(yǎng)瓶。如果培養(yǎng)結(jié)果為無(wú)菌生長(zhǎng)，同時(shí)涂片、革蘭染色鏡檢未找到病菌，繼續(xù)普通培養(yǎng)5 d，發(fā)出無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)報(bào)告。但如果盲種和涂片均發(fā)現(xiàn)病原菌生長(zhǎng)，則立即查看血培養(yǎng)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線，如果曲線遲緩期較長(zhǎng)，生長(zhǎng)期較短，生長(zhǎng)期對(duì)應(yīng)的縱軸較短，穩(wěn)定期平緩，則推定為布氏桿菌，進(jìn)一步鑒定后發(fā)出陽(yáng)性報(bào)告，同時(shí)上報(bào)疫情。

1.4.3 生化鑒定 血培養(yǎng)儀需氧瓶陽(yáng)性報(bào)警，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)曲線特點(diǎn)為遲緩期較長(zhǎng)，生長(zhǎng)期較短，生長(zhǎng)期對(duì)應(yīng)的縱軸較短，穩(wěn)定期平緩。尿素水解試驗(yàn)5 min 內(nèi)出現(xiàn)陽(yáng)性，可推定為布氏桿菌；氧化酶、觸酶、硝酸鹽試驗(yàn)均為陽(yáng)性，硫化氫、精氨酸和吲哚反應(yīng)試驗(yàn)為陰性，涂片可見(jiàn)G-球桿菌、染色很弱。這是可初步報(bào)告臨床高度懷疑是布氏桿菌，并結(jié)合臨床體征及病史采取生物預(yù)防措施。同時(shí)上報(bào)當(dāng)?shù)丶膊☆A(yù)防控制中心（Centers for Disease Control，CDC）實(shí)施最終確定試驗(yàn)。

1.5 倫理學(xué) 本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)：2022C219），所有檢測(cè)均獲得過(guò)患者或家屬知情同意。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)算單項(xiàng)試驗(yàn)和聯(lián)合檢測(cè)診斷真菌感染的敏感度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者臨床主要表現(xiàn) 抽取85 例可疑布氏桿菌感染患者，臨床表現(xiàn)主要為發(fā)熱、多汗、頭痛、乏力以及關(guān)節(jié)疼痛等。見(jiàn)表1。

表1 85 例疑似布氏桿菌感染患者的臨床主要表現(xiàn)

2.2 不同培養(yǎng)方法標(biāo)本陽(yáng)性報(bào)警時(shí)間比較 統(tǒng)計(jì)13 238 份血培養(yǎng)標(biāo)本和217 份骨髓培養(yǎng)標(biāo)本的陽(yáng)性率及陽(yáng)性例數(shù)報(bào)警時(shí)間，結(jié)果表明，全自動(dòng)血培養(yǎng)儀檢出68 例血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本報(bào)警時(shí)間明顯長(zhǎng)于骨髓培養(yǎng)標(biāo)本的陽(yáng)性報(bào)警時(shí)間，骨髓培養(yǎng)檢測(cè)布氏桿菌的陽(yáng)性率明顯高于血培養(yǎng)。見(jiàn)表2。

表2 不同培養(yǎng)方法標(biāo)本陽(yáng)性率及陽(yáng)性報(bào)警時(shí)間比較

2.3 不同培養(yǎng)方法陽(yáng)性標(biāo)本分布 本研究中69 例馬耳他布氏桿菌感染菌患者由血培養(yǎng)檢出68 例，臨床確診病例68 例，骨髓培養(yǎng)檢出16 例，臨床確診16 例。1 例患者血培養(yǎng)和骨髓培養(yǎng)培養(yǎng)均為陰性，但根據(jù)發(fā)熱、關(guān)節(jié)疼痛、有牧場(chǎng)接觸史等臨床特征，同時(shí)結(jié)合其他輔助檢查，按照布病診療方案治療成功。本研究檢出布氏桿菌經(jīng)當(dāng)?shù)谻DC 血清學(xué)分型鑒定，均為羊布氏桿菌。見(jiàn)表3。

表3 血培養(yǎng)和骨髓培養(yǎng)標(biāo)本布氏桿菌陽(yáng)性分布

2.4 感染科室分布 布氏桿菌檢出最多的科室為呼吸科、血液科、風(fēng)濕免疫科。見(jiàn)圖1。對(duì)相關(guān)科室的血培養(yǎng)結(jié)果要高度重視，對(duì)疑似布氏桿菌生長(zhǎng)曲線的標(biāo)本要及時(shí)傳種，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。本院低發(fā)科室兒科只檢出1 例布病患者。

圖1 85 例布氏桿菌感染患者的科室分布

3 討論

布病是由布氏桿菌引起的人畜共患急慢性傳染病，屬自然疫源性疾病之一，在我國(guó)主要流行于西北、東北、青藏高原地區(qū)及內(nèi)蒙古自治區(qū)［6］。布氏桿菌侵入人體后被吞噬細(xì)胞吞噬，但由于布氏桿菌具有莢膜，能有效抵抗吞噬細(xì)胞的吞噬作用，并在該細(xì)胞內(nèi)增殖，隨后進(jìn)入血液循環(huán)，導(dǎo)致患者反復(fù)出現(xiàn)菌血癥［7］。之后布氏桿菌再隨血流進(jìn)入患者脾臟、肝臟、骨髓細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)血液、淋巴管到達(dá)局部淋巴結(jié)，之后寄生其中。細(xì)菌在寄生細(xì)胞中繁殖到一定時(shí)期，又再次進(jìn)入血流，造成患者反復(fù)出現(xiàn)發(fā)熱、乏力等癥狀，因此該疾病也被稱為波浪熱［8-9］。反復(fù)發(fā)熱是布病的主要臨床特點(diǎn)，本研究抽取的85 例疑似布氏桿菌感染患者臨床表現(xiàn)多為長(zhǎng)期反復(fù)發(fā)熱、多汗、乏力、關(guān)節(jié)疼痛、肝脾及淋巴結(jié)腫大，部分患者伴有肝脾變大、白細(xì)胞和血小板計(jì)數(shù)降低。

布氏桿菌為專性需氧菌，對(duì)營(yíng)養(yǎng)和培養(yǎng)條件要求較高，因此在血培養(yǎng)平板上生長(zhǎng)和代謝緩慢。如果技術(shù)人員經(jīng)驗(yàn)不足，可能會(huì)出現(xiàn)將還未生長(zhǎng)出的布氏桿菌視為陰性丟棄的情況，造成假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果。上述存在人為因素的情況在臨床中應(yīng)盡量避免，在最大程度上降低假陰性和假陽(yáng)性結(jié)果的發(fā)生率。本研究中未出現(xiàn)假陽(yáng)性病例，但由于方法學(xué)存在局限性，臨床工作中應(yīng)高度重視可造成假陽(yáng)性結(jié)果的因素，如血培養(yǎng)瓶存放環(huán)境溫度超過(guò)28 ℃，血培養(yǎng)儀外界溫度過(guò)高，血培養(yǎng)儀電壓不穩(wěn)，厭氧菌存在等。血液病患者血細(xì)胞數(shù)量異常，血細(xì)胞本身的新陳代謝也會(huì)產(chǎn)生大量的CO2，如果采血量過(guò)多，或部分炎癥疾病患者體內(nèi)白細(xì)胞計(jì)數(shù)水平升高，都可能導(dǎo)致出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。

由于布氏桿菌的生長(zhǎng)緩慢，會(huì)造成出現(xiàn)假陰性結(jié)果的概率較高，本研究檢出1 例假陰性樣本，但根據(jù)患者發(fā)熱、關(guān)節(jié)疼痛、有牧場(chǎng)接觸史等臨床特征，同時(shí)結(jié)合其他輔助檢查，按照布病診療方案治療成功。造成假陰性結(jié)果的原因有以下幾點(diǎn)：① 血培養(yǎng)瓶存放于冰箱中，取出后立刻進(jìn)行培養(yǎng)，溫度過(guò)低，抑制布氏桿菌的生長(zhǎng)；② 標(biāo)本采集量偏少，產(chǎn)生CO2的量不足以激發(fā)熒光系統(tǒng)，從而導(dǎo)致假陰性結(jié)果；③ 標(biāo)本采集時(shí)機(jī)不合適，未抓住菌血癥時(shí)期； ④ 血液標(biāo)本采集后，放于機(jī)外時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，布氏桿菌生長(zhǎng)已達(dá)到衰老期； ⑤ 患者在使用抗菌藥物后不久。

布病患者臨床癥狀往往不典型，容易造成漏診或誤診［10］，特別是在疾病的急性期，易與傷寒、副傷寒、風(fēng)濕病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、流行性感冒以及其他病毒性呼吸道感染混淆。因此在患者長(zhǎng)期發(fā)熱且對(duì)癥治療效果不佳的情況下，除常見(jiàn)外科疾病外，需考慮到細(xì)菌感染，如有牛羊接觸史的患者，注意罕見(jiàn)的人畜共患傳染病。另外，臨床治療效果不佳時(shí)，往往是由于布氏桿菌在網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)繁殖，單純使用一種藥物治療，藥效難以到達(dá)，因此療效不佳，且易復(fù)發(fā)［11］。布病亦是可防可治的，若治療及時(shí)，預(yù)后良好，大多可于3～6 個(gè)月內(nèi)康復(fù)，僅10%～13%的病例病程超過(guò)6 個(gè)月。未經(jīng)抗菌藥物治療的病死率為2%～3%［12］。世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）推薦的首選治療方法為多西環(huán)素和利福平聯(lián)合用藥，6 周為1 個(gè)療程［11，13］，足量療程用藥，預(yù)后良好［14］。

另外，本研究統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，骨髓標(biāo)本檢測(cè)布氏桿菌的陽(yáng)性率明顯高于血標(biāo)本，骨髓培養(yǎng)陽(yáng)性報(bào)警時(shí)間早于血培養(yǎng)，但臨床抽取患者的骨髓細(xì)胞量過(guò)少而且給患者帶來(lái)痛苦，因此骨髓培養(yǎng)不宜作為常規(guī)檢測(cè)方法篩查布氏桿菌，臨床通常使用血標(biāo)本篩查布氏桿菌，不能納入常規(guī)送檢，故采用血培養(yǎng)聯(lián)合生長(zhǎng)曲線特點(diǎn)有助于快速推定布氏桿菌感染，布氏桿菌陽(yáng)性標(biāo)本細(xì)菌生長(zhǎng)遲緩期較長(zhǎng)，生長(zhǎng)期較短，生長(zhǎng)期對(duì)應(yīng)的縱軸較短，穩(wěn)定期平緩，因此血培養(yǎng)聯(lián)合生長(zhǎng)曲線對(duì)診斷布病有重要的臨床價(jià)值。

綜上所述，布病的診斷應(yīng)結(jié)合流行病學(xué)資料、臨床表現(xiàn)和特異性實(shí)驗(yàn)室檢查確診［5，15］。臨床醫(yī)師和實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)人員要加強(qiáng)血培養(yǎng)對(duì)布氏桿菌檢驗(yàn)的重要性，做到及時(shí)診斷和治療。布氏桿菌的初步快速鑒定不僅對(duì)臨床診斷的價(jià)值大，而且對(duì)公眾健康和實(shí)驗(yàn)室安全也有重大意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突