田曉云， 袁兆偉， 郭芳， 熊秀琴， 任天和， 劉剛， 羅俊*

(貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室， 貴州 貴陽 550025)

目前，心血管疾病是影響人類健康的重要因素，加強(qiáng)心血管疾病的防治是當(dāng)前的重中之重[1]。血小板數(shù)目異常或功能紊亂可造成出血性疾病或血栓性疾病，其中血栓性疾病大部分是由血小板異?；罨饎?dòng)脈血栓所造成，給予抗血小板治療后其發(fā)生率顯著下降[2-3]。血小板是一種無核血細(xì)胞，由骨髓中成熟的巨核細(xì)胞分化而來，正常數(shù)量為(100～300)×109個(gè)/L，存活時(shí)間為7～9 d[4]。當(dāng)血管受損時(shí)，暴露的膠原和血管性血友病因子(von willebrand factor，vWF)使血小板在損傷部位發(fā)生聚集活化，經(jīng)“由內(nèi)向外”信號(hào)引起血小板表面整合素αⅡbβ3的構(gòu)型發(fā)生改變[5-7]。此時(shí)，整合素αⅡbβ3會(huì)與vWF結(jié)合，使血小板粘附于損傷部位[8]，通過整合素αⅡbβ3來介導(dǎo)“由外向內(nèi)”的信號(hào)，引起血小板擴(kuò)展和斑塊回縮，最終產(chǎn)生穩(wěn)定的血栓[9-10]。色胺酮的化學(xué)名為吲哚并(2,1-B)喹唑啉-6,12-二酮，呈弱堿性，屬于吲哚喹啉類生物堿，主要存在于馬藍(lán)(如南板藍(lán)根)、蓼藍(lán)(如何首烏)及菘藍(lán)(如北板藍(lán)根)等產(chǎn)藍(lán)植物中[11]。已有研究表明，色胺酮及其衍生物在抗菌、抗炎、抗過敏、抗腫瘤及抑制血管生成等方面有一定的作用[12-18]，但在抗血小板方面的研究尚未可知。因此，本研究旨在通過研究色胺酮對(duì)血小板擴(kuò)展、粘附及斑塊回縮的影響，為中藥的開發(fā)利用和抗血小板新藥的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠，體質(zhì)量18～24 g，雌雄各半，由學(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[SCXK(黔)2018-0001]，研究獲學(xué)校倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2000082)；實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，提供充足的食物和飲用水。

1.1.2主要試劑和儀器 色胺酮(純度97%；上海畢得醫(yī)藥)，膠原(美國(guó)Chrono-Log)，凝血酶、纖維蛋白原、前列腺素E1(prostaglandin E1，PGE1)、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)-鬼筆環(huán)肽(美國(guó)Sigma)；Model 700型號(hào)血小板聚集儀(美國(guó)Chrono-Log)，BC-5130全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀(深圳Mindray)，5810R高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf)，DM4000B熒光顯微鏡(美國(guó)Leica)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1洗滌血小板制備 0.4%戊巴比妥鈉麻醉小鼠(100 μL/10 g)，固定，使用含有1 ∶9(V/V)酸性檸檬酸葡萄糖(acid citrate dextrose，ACD)的注射器從小鼠下腔靜脈中抽血，以1 ∶1加Tyrode緩沖液，再加50 μg/L PGE1和10 U/L Apyrase，1 372 r/min離心10 min，棄下層部分；上清液2 567 r/min離心10 min，底部沉淀團(tuán)塊即為濃縮的血小板；沉淀的血小板用臺(tái)式緩沖液重懸，加50 μg/L PGE1、10 U/L Apyrase及1 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)，2 567 r/min離心10 min，重復(fù)上述操作1次，重懸于1×Tyrode緩沖液中，即獲洗滌血小板；采用全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀計(jì)數(shù)將獲得的血小板濃度調(diào)整為300×109個(gè)/L，實(shí)驗(yàn)過程均在室溫下進(jìn)行。

1.2.2血小板擴(kuò)展和粘附功能 玻片放入24孔板，加25 mg/L纖維蛋白原溶液或200 mg/L膠原溶液，4 ℃包被過夜，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌；5×109個(gè)/L洗滌血小板250 μL加入離心管，分為空白組(不做任何處理)、對(duì)照組(1‰ DMSO)、色胺酮組(10 μmol/L色胺酮)及陽性藥組(0.5 mg/L替羅非班)，37 ℃孵育10 min；除空白組外，取1 mmol/L CaCl22.5 μL和1 mmol/L MnCl22.5 μL加入各管中，混勻轉(zhuǎn)移至孔板，37 ℃ CO2培養(yǎng)箱內(nèi)擴(kuò)展60 min，棄上清，PBS洗滌；加4%多聚甲醛溶液，常溫靜置15 min，棄上清，PBS洗滌；加0.1%Triton，膜穿孔60 min，棄上清，PBS洗滌；避光加1 mg/L FITC-Phalloidin進(jìn)行染色，暗室靜置60 min，棄上清，PBS洗滌；固定于載玻片后，熒光顯微鏡下觀察血小板的擴(kuò)展或粘附情況，拍照保存；使用ImageJ軟件評(píng)估各組單個(gè)血小板的擴(kuò)散面積和粘附數(shù)目。

1.2.3血小板斑塊回縮實(shí)驗(yàn) 調(diào)整洗滌血小板數(shù)目為200×109個(gè)/L，聚集杯中加懸液500 μL，分為空白組(不做任何處理)、對(duì)照組(1‰ DMSO溶劑)、色胺酮低劑量組(5 μmol/L色胺酮)、色胺酮高劑量組(10 μmol/L 色胺酮)及陽性藥組(0.5 mg/L替羅非班)，37 ℃預(yù)孵育10 min；各管分別加1 mmol/L Ca2+和400 mg/L纖維蛋白原，上下顛倒混勻；除空白組外，每管各加200 U/L凝血酶5 μL，上下顛倒混勻，37 ℃觀察斑塊回縮，于30 min時(shí)進(jìn)行觀察和拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血小板擴(kuò)展功能

在纖維蛋白原表面上進(jìn)行擴(kuò)展后，與空白組相比，對(duì)照組小鼠血小板單個(gè)平均擴(kuò)展面積增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與對(duì)照組相比，色胺酮組和陽性藥組小鼠血小板單個(gè)平均擴(kuò)展面積減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01，圖1)。

注：A為血小板擴(kuò)展的FITC-鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果(1 000×)；B為血小板擴(kuò)展的定量結(jié)果；圖中紅色箭頭表示血小板完全擴(kuò)展?fàn)顟B(tài)，綠色熒光表示血小板細(xì)胞骨架；(1)與空白組相比，P<0.01；與對(duì)照組相比，(2)P<0.05，(3)P<0.01。圖1 各組小鼠血小板在固化纖維蛋白原表面的擴(kuò)展能力Fig.1 Spreading ability of the mouse platelets on the surface of solidified fibrinogen in each group

2.2 血小板粘附功能

在膠原表面上粘附后，與空白組相比，對(duì)照組和陽性藥組小鼠血小板的粘附數(shù)目增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與對(duì)照組相比，色胺酮組小鼠血小板的粘附數(shù)目減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

2.3 斑塊回縮

體外斑塊回縮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，色胺酮低、高劑量組小鼠血小板斑塊回縮程度被抑制，陽性藥組小鼠血小板未見斑塊回縮(圖3)。

3 討論

血栓形成和血栓栓塞均會(huì)引起血栓性疾病，血小板的異?；罨且鹧ㄋㄈ闹饕騕19]?，F(xiàn)有的抗血小板藥物(例如阿司匹林)具有不同程度的副作用(例如腸道出血)，嚴(yán)重時(shí)可造成死亡[3]。本研究探討了色胺酮對(duì)血小板粘附和擴(kuò)展功能及體外血栓形成的影響，結(jié)果表明色胺酮可抑制血小板在纖維蛋白原表面的單個(gè)擴(kuò)展面積、在膠原表面的粘附數(shù)目及體外血栓的形成。

注：A為血小板粘附的FITC-鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果(400×)；B為血小板粘附數(shù)目的定量結(jié)果；(1)與空白組相比，P<0.05；(2)與對(duì)照組相比， P<0.05。圖2 各組小鼠血小板在固化膠原表面的粘附能力Fig.2 Adhesion ability of mouse platelets on the surface of solidified collagen in each group

空白組 對(duì)照組 色胺酮低劑量組 色胺酮高劑量組 陽性藥組圖3 各組小鼠血小板的斑塊回縮實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Clot retraction test results of mouse platelet in each group

當(dāng)血小板與內(nèi)皮破損處接觸時(shí)，血小板胞質(zhì)內(nèi)的顆粒會(huì)迅速向中央聚集，胞膜向外伸出偽足，形成樹突型血小板，這個(gè)過程即為血小板的擴(kuò)展[20]。本研究通過觀察血小板在固化纖維蛋白原上的擴(kuò)展情況，從而探究色胺酮對(duì)血小板擴(kuò)展功能的影響。血小板的粘附功能是指血管內(nèi)皮受損后，血小板在血液循環(huán)中可粘附在血管內(nèi)皮上，或在體外可粘附于玻璃表面，從而起到局部止血的作用[21]。為進(jìn)一步研究色胺酮對(duì)血小板粘附功能的影響，檢測(cè)了血小板在固化膠原上的粘附實(shí)驗(yàn)。血小板的擴(kuò)展和粘附是動(dòng)脈血栓形成過程中的重要環(huán)節(jié)，當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損時(shí)，膠原和vWF等基底物暴露后，血小板可以通過其表面受體粘附到受損部位，同時(shí)，活化的血小板收縮后被纖維蛋白網(wǎng)羅，這是血栓形成和維持穩(wěn)定的基本步驟[22-23]。本研究結(jié)果顯示，色胺酮可以明顯抑制血小板在纖維蛋白原上的擴(kuò)展面積和在膠原上的粘附數(shù)目，表明色胺酮可能影響血栓的形成和穩(wěn)定性。

整合素αIIbβ3是血小板膜上最豐富的糖蛋白受體，在血小板“由內(nèi)向外”和“由外向內(nèi)”的雙向信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著介導(dǎo)作用[24]。在血小板止血和血栓形成過程中，同樣發(fā)揮著重要作用[25]?；罨恼纤嘏c纖維蛋白原結(jié)合后會(huì)觸發(fā)“由外向內(nèi)”的信號(hào)傳導(dǎo)，激活細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路以介導(dǎo)血小板發(fā)揮功能。斑塊回縮和血小板擴(kuò)展是反映血小板“由外向內(nèi)”信號(hào)傳導(dǎo)的2個(gè)基本特征，其中斑塊回縮也是表現(xiàn)血小板體外血栓形成的判斷依據(jù)[26]。有趣的是，與抑制血小板擴(kuò)展的結(jié)果一致，色胺酮也抑制了斑塊回縮現(xiàn)象。表明色胺酮會(huì)抑制血小板整合素介導(dǎo)的“由外向內(nèi)”的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

綜上，色胺酮是通過抑制整合素αIIbβ3介導(dǎo)的“由外向內(nèi)”的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而發(fā)揮抑制血栓的形成和穩(wěn)定性，但其作用機(jī)制和毒理性還有待進(jìn)一步研究。