趙永龍， 郭瑋鈺， 龍昌蘭， 陸定艷， 陳帥帥， 李勇軍， 劉亭**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心， 貴州 貴陽 550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 & 省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽 550004)

細(xì)胞色素P450(cytochrome P450, CYP450)是生物體內(nèi)主要的代謝酶之一，在內(nèi)外源性有毒物質(zhì)的代謝中發(fā)揮重要作用[1-3]，CYP包括CYP1、CYP2和CYP3家族。細(xì)胞色素P450家族2亞家族E成員1(cytochrome P450 family 2 subfamily E member 1，CYP2E1)是CYP2家族成員之一，其基因位于人類的10號(hào)染色體，含有9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子，共有11 413個(gè)堿基對(duì)[4-8]。CYP2E1主要分布在肝臟，占肝臟CYP總量的7%，其代謝底物多達(dá)90余種，其中大部分為藥物、工業(yè)毒物和前致癌物等小分子化合物[9]，是肝臟的重要代謝酶之一[9-12]。研究表明，CYP2E1基因介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)與肝癌侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)[13-15]，對(duì)CYP2E1酶的研究可為闡明其與底物的相互作用、疾病的預(yù)防治療及臨床合理用藥提供重要依據(jù)。體外構(gòu)建高表達(dá)CYP2E1的基因模型，可用來進(jìn)行細(xì)胞毒性的篩選，是研究CYP2E1的重要工具。鑒于此，本研究擬利用Lipofectamine?2000轉(zhuǎn)染試劑將pcDNA5-CYP2E1重組質(zhì)粒與pOG44輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至Flp-InTMCHO細(xì)胞，采用潮霉素B篩選穩(wěn)定細(xì)胞株[17]，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)檢測(cè)目的基因CYP2E1的插入情況，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)和蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)細(xì)胞中CYP2E1 mRNA和蛋白表達(dá)水平，并檢測(cè) CYP2E1酶對(duì)對(duì)乙酰氨基酚(paracetamol, APAP)的毒性敏感性，從而確定模型是否成功建立，為體外研究CYP2E1提供工具。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1細(xì)胞與載體 Flp-InTMCHO細(xì)胞株、pcDNA5/FRT載體由浙江大學(xué)陳樞青教授贈(zèng)送，輔助質(zhì)粒pOG44、重組表達(dá)載體pcDNA5/FRT-CYP2E1由北京博邁德基因技術(shù)有限公司合成。

1.1.2主要試劑與儀器 F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國gibco公司，胎牛血清(FBS)購自武漢Procell公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)、甘氨酸(Glycine)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、牛血清白蛋白(BSA)、Tris-base和APAP均購自北京索萊寶科技有限公司，MTS 購自promega公司，Ezup柱狀動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自上海生工?sangon Biotech公司，PrimeScriptTMART Master Mix(Perfect Real Time)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、總RNA提取試劑盒購自日本TAKARA公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?2000、潮霉素B購自美國Invitrogen公司，苯甲基磺酰氟(PMSF)、蛋白裂解液(RIPA)購自大連美倫生物科技有限公司，SDS-蛋白預(yù)染Maker購自上海愛必信生物科技有限公司，PVDF膜購自德國Millipore公司，甲醇購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，ECL顯影液購自上海碧云天生物科技公司，小鼠抗β肌動(dòng)蛋白(β-actin)單克隆抗體、兔抗CYP2E1 抗體購自英國Abcam公司。PCR引物由上海恒英公司合成，引物序列：CYP2E1上游為5′-GTGATGCACGGCTACAAGG-3′，下游為5′-GGGTGGTCAGGGAAAACCG -3′；GAPDH上游為5′-CATCATCTCCGCCCCTTCTG-3′，下游為5′-CATGGACCGTGGTCATGAGT-3′。； TS-2脫色搖床(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，JJ-CJ-2ND Ⅱ超凈工作臺(tái)(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)，fresco17冷凍高速離心機(jī)(美國Thermo公司)，N50核酸蛋白檢測(cè)儀(德國IMPLEN公司)，CFX96熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)，S1000 PCR擴(kuò)增儀(美國Thermo公司)，PowerPac Basic電泳儀(美國Bio-Rad公司)，Trans-Blot Turbo半干轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)，BLOCOL-02層析實(shí)驗(yàn)冷柜(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，TS100型熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)，GBOXChemiXL1.4凝膠成像系統(tǒng)(英國Syngene公司)，311型CO2飽和濕度培養(yǎng)箱(美國Thermo scientific 公司)、YXQ-LS-50S II高壓蒸汽滅菌鍋(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療儀器廠)。

1.2 研究方法

1.2.1Flp-InTMCHO細(xì)胞的培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的F12培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～5 h，觀察細(xì)胞貼壁情況并換液。待細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，用胰蛋白酶消化后按比例1 ∶3進(jìn)行傳代。

1.2.2Flp-InTMCHO-CYP2E1細(xì)胞株的構(gòu)建 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Flp-InTMCHO細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，按照每孔2 mL的體積，以1.5×108個(gè)/L的密度將Flp-InTMCHO細(xì)胞接種于6孔板，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用pcDNA5/FRT-CYP2E1質(zhì)粒(0.25 μg)及輔助質(zhì)粒pOG44 (2.25 μg)與Lipofectamine 2000 (8 μL)混合液轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h，用濃度為500 mg/L的潮霉素B進(jìn)行穩(wěn)定株篩選，每隔48 h換液1次。篩選14 d，以pcDNA5/FRT空質(zhì)粒細(xì)胞作為陰性對(duì)照，對(duì)篩選出來的克隆進(jìn)行基因組、mRNA和蛋白質(zhì)層面的驗(yàn)證。

1.2.3CYP2E1基因組PCR檢測(cè) 參照Ezup柱狀動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒的方法，提取“1.2.2”項(xiàng)方法構(gòu)建的未轉(zhuǎn)染的Flp-InTMCHO空白細(xì)胞、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的Flp-InTMCHO空質(zhì)粒細(xì)胞、轉(zhuǎn)染CYP2E1的Flp-InTMCHO細(xì)胞(Flp-InTMCHO-CYP2E1)的gDNA (genomic DNA，基因組DNA)。以Flp-In、GAPDH、CYP2E1的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系： TaKaRa Ex Taq 0.25 μL、10×Ex Taq Buffer 5 μL、dNTP Mixture 4 μL，gDNA450 ng，CYP2E1上下游引物各1.5 μL，最后加入無核酸酶水至50 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，94 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸(FLP-In引物3 min、CYP2E1引物30 s、GAP引物30 s， 40個(gè)循環(huán))。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，電泳電壓70 V，時(shí)間60 min。

1.2.4CYP2E1 mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 參照總RNA提取試劑盒說明書提取各組細(xì)胞的總RNA，利用PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)體系： cDNA 2 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL， TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ 12.5 μL，加無核酸酶水至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min， 95 ℃變性5 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s， 40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，通過2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.5CYP2E1蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用RIPA裂解液提取各組細(xì)胞的總蛋白，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，每組取變性后蛋白20 μg進(jìn)行SDS-PAGE；恒壓25 V轉(zhuǎn)膜30 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，BSA封閉3 h，加入一抗(兔抗CYP2E1多克隆抗體，稀釋度1 ∶1 000；小鼠抗GAPDH單克隆抗體，稀釋度1 ∶5 000)，4 ℃孵育過夜；1× TBST洗膜5次，每次5 min，加入二抗(稀釋度1 ∶2 000)室溫孵育2 h；1 ×TBST洗膜5次，每次5 min；再將ECL Plus超敏發(fā)光液均勻滴加在PVDF膜上，凝膠成像儀顯影曝光，用Image Lab軟件分析灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6APAP細(xì)胞毒性檢測(cè) 培養(yǎng)細(xì)胞至90%匯合，以1×108個(gè)/L接種于96孔板，每孔100 μL。培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞分為空白組和實(shí)驗(yàn)組?？瞻捉M加入0.1%(體積分?jǐn)?shù))DMSO的完全培養(yǎng)基，各實(shí)驗(yàn)組分別給予APAP(100、200、400、800 及1 000 μmol/L)處理24 h，棄掉原培養(yǎng)基，加入含5%(體積分?jǐn)?shù))MTS的F12培養(yǎng)基100 μL孵育2 h，在490 nm處的測(cè)定吸光度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞存活率[存活率(%)=(A實(shí)驗(yàn)-A培養(yǎng)基/A空白-A培養(yǎng)基)×100%]，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測(cè)細(xì)胞中CYP2E1的插入情況

結(jié)果如圖1所示，GAPDH引物擴(kuò)增的Flp-InTMCHO空白細(xì)胞、Flp-InTMCHO空質(zhì)粒細(xì)胞和Flp-InTMCHO-CYP2E1細(xì)胞的條帶亮度基本一致，說明提取的總DNA幾乎無降解，F(xiàn)lp-In引物和CYP2E1引物擴(kuò)增的Flp-InTMCHO-CYP2E1細(xì)胞分別在2 000 bp、200 bp左右有明顯條帶，提示CYP2E1基因已成功轉(zhuǎn)入Flp-inTM-CHO細(xì)胞。

注：1為Marker，2、5、8為Flp-InTM CHO空白組，3、6、9為Flp-InTM CHO空質(zhì)粒組，4、7、10為Flp-InTM CHO-CYP2E1組。圖1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products

2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA完整性

如圖2所示，所提取的RNA條帶不存在拖尾現(xiàn)象，28 s條帶的亮度明顯是18 s條帶的2倍左右，說明提取的總RNA幾乎無降解，RNA的完整性符合本研究的要求。

注：A為Flp-InTM CHO組，B為 Flp-InTM CHO空質(zhì)粒組，C為Flp-InTM CHO-CYP2E1組。圖2 RNA完整性檢測(cè)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.2 Results of RNA integrity electrophoresis

2.3 核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)RNA濃度

從表1可以看出，本研究RNA樣品的濃度均>200 mg/L， OD260/OD280平均比值在1.8～2.2，說明所提取的RNA純度滿足本研究的實(shí)驗(yàn)要求。

表1 RNA的濃度及OD260/OD280比值Tab.1 RNA concentration and OD260/OD280 ratio

2.4 細(xì)胞中CYP2E1 mRNA和蛋白表達(dá)水平

如圖3所示，與Flp-InTMCHO空質(zhì)粒組比較，F(xiàn)lp-InTMCHO-CYP2E1組CYP2E1的mRNA表達(dá)水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；相對(duì)應(yīng)的CYP2E1蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，與Flp-InTMCHO空質(zhì)粒組比較，F(xiàn)lp-InTMCHO-CYP2E1組CYP2E1蛋白表達(dá)水平也明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

注：A為CYP2E1 mRNA水平的定量結(jié)果，B、C分別為CYP2E1蛋白表達(dá)及定量結(jié)果；(1)與Flp-InTM CHO空質(zhì)粒組相比，P<0.01。圖3 細(xì)胞中CYP2E1 mRNA和蛋白表達(dá)水平Fig.3 Expression level of CYP2E1 mRNA and protein in the cells

2.5 APAP細(xì)胞毒性檢測(cè)

如圖4所示，F(xiàn)lp-InTMCHO細(xì)胞和Flp-InTMCHO-空質(zhì)粒細(xì)胞的給藥組與0 μmol/L 組比較，不同濃度的APAP對(duì)細(xì)胞存活率沒有明顯影響。當(dāng)Flp-InTMCHO-CYP2E1細(xì)胞與不同濃度的APAP共孵育后，其細(xì)胞的存活率呈濃度依賴性降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或<0.01)。

注：與0 μmol/L APAP組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。圖4 不同濃度APAP對(duì)細(xì)胞存活率的影響Fig.4 Effects of APAP at different concentrations on cell survival

3 討論

CYP家族廣泛參與生物體內(nèi)的代謝過程，主要在肝臟細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，是肝臟中進(jìn)行藥物代謝的關(guān)鍵酶之一。其中CYP2E1參與了90多種外源性藥物、內(nèi)源性脂肪酸[18]和內(nèi)源性毒物的代謝，包括硬脂酸、乙醇、四氯化碳[19]、月桂酸等[20]。

CHO細(xì)胞為中國倉鼠卵巢細(xì)胞，該細(xì)胞本身不含人源CYP酶，因此，在轉(zhuǎn)入CYP基因進(jìn)行表達(dá)時(shí)，可以排除其他CYP酶的影響。Flp-InTMCHO細(xì)胞基因組是通過引入Flp重組酶的作用靶點(diǎn)(FRT)，讓目的基因在重組酶的介導(dǎo)下發(fā)生定點(diǎn)整合，使得目的基因整合到特定FPT位點(diǎn)，從而使轉(zhuǎn)染的目的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯[19]。該細(xì)胞株構(gòu)建細(xì)胞系具有目的蛋白表達(dá)均一穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)[21-22]。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染方法分為病毒法和非病毒法，其中病毒法的實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求較高，且后續(xù)需要進(jìn)行單克隆篩選，步驟繁瑣且耗時(shí)長(zhǎng)[22]。而非病毒法中最常用的有磷酸鈣沉淀法、電穿孔法以及脂質(zhì)體介導(dǎo)法，通過抗生素篩選即可得到穩(wěn)定細(xì)胞系，具有耗時(shí)短、工作量少等特點(diǎn)[23]。其中磷酸鈣沉淀法容易受pH的影響；電穿孔法會(huì)損傷細(xì)胞膜，且貼壁細(xì)胞較難操作；脂質(zhì)體法是利用脂質(zhì)體試劑在水相中與DNA形成DNA-陽離子脂質(zhì)體復(fù)合物，導(dǎo)入至Flp-InTMCHO細(xì)胞，該轉(zhuǎn)染方法具有操作方便、重現(xiàn)性好和高效穩(wěn)定的特點(diǎn)[24-25]。因此，本研究選擇非病毒法中的脂質(zhì)體法介導(dǎo)轉(zhuǎn)染pcDNA5/FRT-CYP2E1質(zhì)粒至Flp-InTMCHO細(xì)胞，構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達(dá)CYP2E1酶的Flp-InTMCHO-CYP2E1細(xì)胞株模型。

本研究首先采用潮霉素B篩選穩(wěn)定的Flp-InTMCHO-CYP2E1細(xì)胞株[17]，然后PCR檢測(cè)目的基因CYP2E1的插入情況，結(jié)果顯示Flp-InTMCHO-CYP2E1細(xì)胞分別在2 000 bp、200 bp左右有CYP2E1酶目的基因的明顯條帶。另外，進(jìn)一步用qRT-PCR和 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中CYP2E1 mRNA和蛋白表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)Flp-InTMCHO-CYP2E1細(xì)胞的CYP2E1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯增加(P<0.001)。最后，采用APAP檢測(cè)CYP2E1酶對(duì)APAP的毒性敏感性，結(jié)果也表明能夠穩(wěn)定表達(dá)CYP2E1酶的Flp-InTMCHO細(xì)胞對(duì)APAP的毒性敏感性也顯著增強(qiáng)。

綜上所述，本研究成功建立了Flp-InTMCHO-CYP2E1細(xì)胞模型，該細(xì)胞能夠穩(wěn)定表達(dá)CYP2E1酶，這將為后續(xù)研究CYP2E1與底物及疾病間的相互作用提供有力工具。課題組目前正在使用該細(xì)胞模型，來篩選能被CYP2E1代謝活化產(chǎn)生細(xì)胞毒性的藥物, 但目前還尚未篩選到相應(yīng)藥物。