歐陽辰昕王 城朱芮樟廖君左敬 鵬何文飛趙 丹*

(1.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院小兒外科,四川 南充 637000;2.川北醫(yī)學院肝膽胰腸研究所,四川 南充 637000)

先天性腎臟及尿路畸形( Congenital abnormalities of the kidney and urinary tract,CAKUT),是對一系列先天性泌尿系統(tǒng)畸形的統(tǒng)稱,約占全部先天性畸形的20%～30%[1],主要包括腎發(fā)育不良、先天性輸尿管積水、多囊腎、腎盂輸尿管連接部梗阻、重復腎/腎盂/輸尿管、輸尿管膀胱連接部梗阻、膀胱輸尿管反流以及后尿道瓣膜等,當前CAKUT 發(fā)生機制研究主要集中在經典遺傳學領域,如基因突變、基因拷貝數變異、染色體變異等[2-3],隨著表觀遺傳學理論的普及,宮內環(huán)境因素對子代CAKUT 的誘發(fā)機制,逐漸成為關注熱點,其中也包括妊娠期糖尿病( gestational diabetes mellitus,GDM)。

GDM 是孕婦在妊娠期間首次發(fā)現(xiàn)的糖耐量異常,是妊娠期常見的合并癥之一[4-5],其在發(fā)展中及發(fā)達國家的發(fā)病率均逐年上升[6-8],可對母親及子代產生長遠危害,其導致的畸形包括手足多指畸形、脊柱缺損、消化道畸形、神經系統(tǒng)畸形、先天性心臟病、先天性腎臟及尿路畸形等。國外meta 分析指出:GDM 母親子代患CAKUT 的風險較正常人增加39%[9]。 因此,探索建立穩(wěn)定有效的實驗動物模型成為研究GDM 導致子代CAKUT 的第一步,然而國外關于建立此類動物模型的研究報道不多,國內尚無報道,故本研究以此出發(fā),旨在探索并建立GDM 導致子代CAKUT 的穩(wěn)定SD 大鼠模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級10 周齡SD 大鼠,雌鼠36 只,雄鼠18只,體重240～260 g,均購自川北醫(yī)學院實驗動物中心[SCXK(川)2018-18],飼養(yǎng)于川北醫(yī)學院實驗動物中心[SYXK(川)2018-076],飼養(yǎng)環(huán)境:溫度20℃～25℃,濕度約50%,12 h 晝夜明暗交替。 飼料由動物中心統(tǒng)一供應(北京科澳協(xié)力)。 實驗經川北醫(yī)學院動物倫理審查委員批準(IACUC-2022-03),實驗過程中對動物遵循3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ,上海源葉);pH 4.5 檸檬酸鈉緩沖液(北京索萊寶);亞甲藍注射液(江蘇濟川);4%多聚甲醛(安徽白鯊)。 血糖儀及試紙(湖南三諾,安準型);體視顯微鏡(深圳奧斯微,T1-HD202);正置顯微鏡(日本尼康,Eclipse 55i);電子分析天平(上海良平,D1067428);石蠟包埋機及冷凍臺(江蘇普瑞斯星,PBM-A);石蠟切片機(德國萊卡,RM2245)。

1.3 實驗方法

1.3.1 GDM 母鼠模型的構建

于晚間20:00 將雌鼠與雄鼠1 ∶1 自然合籠,次日晨8:00 觀察陰栓情況,發(fā)現(xiàn)陰栓,則記為孕0.5 d(E 0.5)。 按照受孕被檢順序,選擇30 只孕鼠,根據隨機數字表法分到5 組中(STZ 30 mg/kg 組、STZ 35 mg/kg 組、STZ 40 mg/kg 組、溶劑對照組、空白對照組),每組n=6。 于E 0.5 晚予以禁食(不禁水),時長14～16 h,E 1.5 根據STZ 劑量分組情況,予孕鼠一次性腹腔內注射檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.5)配置的1% STZ 溶液(1 mL 檸檬酸鈉緩沖液溶入10 mg STZ),其中溶劑對照組注射等量檸檬酸鈉緩沖液,空白對照組不予注射任何液體。 注射后,5 組孕鼠均禁食4 h(不禁水),4 h 后予正常飲水、喂食。 E 1.5、E 3.5、E 6.5、E 9.5、E 12.5、E 15.5、E 18.5 孕鼠尾尖采血監(jiān)測隨機血糖并記錄孕鼠體重變化情況。 成模標準:孕期3 次隨機血糖≥16.7 mmol/L。 喂養(yǎng)期間若發(fā)現(xiàn)母鼠未孕,予以剔除出組并補充至n=6。

1.4 統(tǒng)計學方法

1.3.2 子鼠泌尿系統(tǒng)形態(tài)學觀察

子鼠出生當天,計算子鼠存活率(活仔數/產仔數),頸椎脫臼法處死,體視顯微鏡下操作,子鼠仰臥位,1 mL 針頭固定四肢,行下腹正中切口進入腹腔,切口向上延伸至胸骨下緣,棉簽將腹腔內肝、胃腸道等臟器上撥,修剪兩側腹壁及多余組織,暴露后腹膜及泌尿系統(tǒng),記錄畸形種類、數量,亞甲藍染色30 s,Image view 軟件拍照。

1.3.3 子鼠腎、輸尿管HE 染色及觀察

子鼠泌尿系統(tǒng)連同軀干用4%多聚甲醛溶液固定,常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅染色(HE 染色),顯微鏡觀察,NIS-Elements 軟件采集圖像。

1.3.4 子鼠腎皮質厚度測量

采用SPSS 23 對數據進行統(tǒng)計分析,計量資料以平均數±標準差(±s)描述,多樣本計量資料采用單因素方差分析,對不滿足正態(tài)性、方差齊性者,采用非參數檢驗;計數資料率的統(tǒng)計采用卡方檢驗,對超1/4 單元格樣本量不足5 的,采用Fisher確切概率法。

2 結果

2.1 各組孕鼠孕期體重變化

隨孕期進展,各組孕鼠體重均逐漸上升,且STZ 30、35、40 mg/kg 3 組均有不同程度“多飲、多食、多尿”癥狀。 STZ 40 mg/kg 組2 只孕鼠在孕中晚期流產,變化不納入統(tǒng)計。 各時間點組間孕鼠體重無統(tǒng)計學差異(P>0.05),見表1。

表1 各組孕鼠不同時間點體重情況(±s,g)Table 1 Weight of pregnant rats in each group at different periods

表1 各組孕鼠不同時間點體重情況(±s,g)Table 1 Weight of pregnant rats in each group at different periods

組別Groups總只數(n)Total number孕1.5 d E 1.5孕3.5 d E 3.5孕6.5 d E 6.5孕9.5 d E 9.5孕12.5 d E 12.5孕15.5 d E 15.5孕18.5 d E 18.5 STZ 30 mg/kg 組30 mg/kg STZ group 6 241.67±11.69 251.67±16.02 251.67±7.53 261.67±7.53 273.33±5.16 295.00±18.71 336.67±12.11 STZ 35 mg/kg 組35 mg/kg STZ group 6 240.00±15.49 246.67±17.51 260.00±23.66 278.33±18.35 280.00±20.98 293.33±19.66 338.33±23.17 STZ 40 mg/kg 組40 mg/kg STZ group 4 240.00±8.16 247.50±5.00 252.50±5.00 258.75±6.29 270.00±8.16 292.5±9.57 322.50±5.00溶劑對照組Solvent control group 6 243.33±5.16 251.67±7.53 258.33±7.53 268.33±7.53 276.67±5.16 301.67±7.53 346.67±16.33空白對照組Blank control group 6 238.33±4.08 246.67±5.16 253.33±5.16 265.00±8.37 270.00±6.32 293.33±5.16 340.00±10.95

2.2 孕鼠血糖值對比

按等距原則隨機抽取子鼠腎門橫截面HE 切片,每組3 張,每張測量一側腎,每個腎取點3 處,如圖1,用環(huán)狀虛線標記腎皮髓質交界,腎乳頭方向記為0°,順時針90°、180°、270°定位3 處,從定位點向各自對應腎被膜作垂直線段,線段長度即為腎皮質厚度,NIS-Elements 軟件測量。

圖1 腎皮質厚度測量方式圖解Note. Outside the circular red line, Renal cortex.Figure 1 Illustration of renal cortical thickness measurement modality

STZ 30、35、40 mg/kg 3 組孕鼠血糖均符合建模濃度,且血糖均顯著高于空白對照組(P<0.05),其中40 mg/kg 組多次測血糖超血糖儀測定范圍(>33.3 mmol/L,表顯“H1”),并有2 只孕鼠在孕中晚期流產。 各組孕鼠隨機血糖變化情況見表2,溶劑對照組與空白對照組各時間點相比,無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。 STZ 30 mg/kg 組與35 mg/kg 組各時間點相比,無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。 STZ 40 mg/kg 組各時間點均顯著高于STZ 30 mg/kg 組(P<0.05)。STZ 35 mg/kg 組與40 mg/kg 組相比,在孕中晚期,有兩個時間點(E 12.5 和E 18.5)血糖值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),這與STZ 40 mg/kg 組孕鼠超出血糖儀檢測范圍的血糖值僅以33.3 mmol/L 統(tǒng)計有關,STZ 40 mg/kg 組孕期血糖值實際可能更高。

表2 各組孕鼠隨機血糖對比(mmol/L,n=6,±s)Table 2 Comparison of random blood glucose in each group of pregnant rats

表2 各組孕鼠隨機血糖對比(mmol/L,n=6,±s)Table 2 Comparison of random blood glucose in each group of pregnant rats

注:與空白對照組相比,*P<0.05;與STZ 30 mg/kg 組相比,△P<0.05。Note. Compared with the blank control group,*P<0.05. Compared with the 30 mg/kg STZ group,△P<0.05.

組別Groups孕1.5 d E 1.5孕3.5 d E 3.5孕6.5 d E 6.5孕9.5 d E 9.5孕12.5 d E 12.5孕15.5 d E 15.5孕18.5 d E 18.5 STZ 30 mg/kg 組30 mg/kg STZ group 2.82±0.88 19.77±1.23* 20.82±2.39* 20.87±2.51* 21.60±1.49* 22.48±3.15* 22.62±2.84*STZ 35 mg/kg 組35 mg/kg STZ group 3.83±1.00 22.68±2.17* 22.92±2.99* 22.58±1.17* 24.88±3.96* 22.63±3.37* 27.82±3.55*STZ 40 mg/kg 組40 mg/kg STZ group 3.23±1.45 29.63±2.90*△ 29.60±3.17*△ 32.30±1.75*△ 30.37±2.85*△ 30.02±2.81*△ 31.17±3.35*△溶劑對照組Solvent control group 3.17±0.87 5.67±0.71△ 5.88±0.38△ 6.17±0.71△ 5.90±0.65△ 5.57±0.81△ 5.37±0.59△空白對照組Blank control group 3.45±0.40 5.78±0.67△ 5.97±0.80△ 5.52±0.60△ 5.58±0.55△ 5.57±0.63△ 4.98±0.37△

2.3 孕鼠分娩情況

各組孕鼠分娩情況見表3、表4,STZ 40 mg/kg組2 只孕鼠于孕中晚期流產,流產率為33.3%,其余各組孕鼠流產率均為0。 STZ 30、35、40 mg/kg 3 組子鼠存活率均低于空白對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 STZ 30、35、40 mg/kg 3 組子鼠存活率無差異(χ2=0.659,P>0.05)。

表3 孕鼠流產情況(n=6)Table 3 Abortion of pregnant rats

表4 各組子鼠存活率Table 4 Survival rate of offspring rats in each group

2.4 子鼠泌尿系統(tǒng)畸形情況

體視顯微鏡下解剖活產子鼠,溶劑對照組及空白對照組輸尿管均呈正常形態(tài)(圖2A),STZ 30、35、40 mg/kg 3 組均觀察到輸尿管擴張積水(圖2B 為雙側,圖2C 為單側)。 表5 為輸尿管積水情況,STZ 30、35、40 mg/kg 3 組擴張積水總發(fā)生率均高于空白對照組(P<0.05)且均達70%以上;比較STZ 30、35、40 mg/kg 3 組間輸尿管積水構成比無差異(χ2=1.384,P>0.05),即3 組單側積水率無差異、雙側積水率無差異,且3 組的雙側輸尿管積水發(fā)生率均達單側的3 倍以上。

表5 活產子鼠輸尿管積水情況Table 5 Ureteral effusion in surviving offspring rats

圖2 子鼠輸尿管示意圖Note. A, Normal ureter. B, Bilateral ureteral effusion. C, Unilateral ureteral effusion. →, Ureter.Figure 2 Illustration of the ureter of the offspring rats

2.5 子鼠腎及輸尿管HE 染色組織形態(tài)學觀察

2.5.1 鏡下子鼠腎、輸尿管異常

子鼠腎門部橫截面HE 染色全景圖見圖3A,STZ 30、35、40 mg/kg 3 組均觀察到輸尿管擴張積水,腎發(fā)育不良(圖3B)。

圖3 子鼠腎門部橫截面全景圖(HE 染色)Note. A, Normal kidney and ureter. B, Ureteral effusion and renal dysplasia.Figure 3 Cross-sectional panoramic view of the kidney hilum of the offspring rats (HE staining)

與溶劑對照組及空白對照組相比,STZ 30、35、40 mg/kg 3 組子鼠腎實質發(fā)育不良,皮質變薄(圖4A、圖4B),輸尿管結構異常,表現(xiàn)為管壁發(fā)育不良,細胞層數減少(圖4C、圖4D)。

圖4 子鼠腎、輸尿管橫截面(HE 染色)Note. A/B, Cross-sections of the kidney hilum. C/D, Cross-sections of the extra-renal ureter.Figure 4 Kidney and ureter cross-sections of offspring rats (HE staining)

2.5.2 子代腎皮質厚度測定

測量方式見本文1.3.4。 如圖5 所示,STZ 30、35、40 mg/kg 3 組腎皮質厚度兩兩比較均無差異(P>0.05);溶劑對照組及空白對照組皮質厚度無差異(P>0.05)。 STZ 30、35、40 mg/kg 3 組分別與空白對照組進行兩兩比較,腎皮質厚度均小于空白對照組(P<0.05),厚度減少量均在20%以上。

圖5 子鼠腎皮質厚度情況Note. Compared with the blank control group,*P<0.05.Figure 5 Renal cortical thickness in offspring rats

3 討論

由于倫理問題和孕檢的普及,無法獲取孕期高血糖的典型臨床病例,故想要深入研究此類問題,尋找微觀預警、干預手段,需依賴于實驗動物模型,而GDM 導致子代CAKUT 的動物模型,國內外報道不多,Tran 等[10]采用Hoxb7-Green 小鼠,在E 13 時腹腔一次性注射STZ,發(fā)現(xiàn)子代腎發(fā)育不良;Hokke等[11]采用C57BL/6J 小鼠,于E 6.5 開始,連續(xù)3 d腹腔注射STZ 建模,在胚胎E 14.5 和E 18.5 時剖宮產解剖子鼠,發(fā)現(xiàn)子鼠腎發(fā)育不良、輸尿管積水、雙輸尿管及雙集合管系統(tǒng),但上述報道均未詳述穩(wěn)定動物模型的建立。

本課題組結合前人經驗,選擇SD 大鼠腹腔注射STZ 建模,需決定注射時間、頻次及注射劑量。未選擇飲食誘導建模或基因動物模型,是因為飲食誘導是使動物產生肥胖、胰島素抵抗,在孕前引入了干擾因素,時間長、成本高;而基因敲除常為“全或無”,成本高。 STZ 為亞硝脲類抗生素,代謝快,對其他組織、器官毒副作用小,誘導成功率高,現(xiàn)已被廣泛用于糖尿病動物模型制備[12-13]。 STZ 的注射時間,需盡量早于大鼠泌尿系統(tǒng)發(fā)育時間,故于E 1.5 注射,注射后STZ 迅速代謝,降低了藥物本身對子鼠泌尿系統(tǒng)發(fā)育的影響。 STZ 的注射劑量,國內外尚無統(tǒng)一標準,注射濃度多介于20～80 mg/kg,注射頻次也分一次或多次[10-11,14],在預實驗中,STZ 25 mg/kg 及以下濃度的孕鼠,隨機血糖有轉陰可能;而STZ 45 mg/kg 及以上濃度孕鼠,隨機血糖更易超血糖儀測量范圍(>33.3 mmol/L),且孕鼠更易流產、子鼠更不易存活,故STZ 濃度定為30、35、40 mg/kg,一次性腹腔注射以減少對孕鼠的刺激。STZ 的溶劑為檸檬酸鹽緩沖液(pH 4.2～4.5),故設置溶劑對照組,該組在孕鼠體重、血糖,子鼠存活率、輸尿管積水率、腎皮質厚度等均與空白對照組無差異,排除了溶劑的可能干擾。

孕鼠與子鼠變化情況:(1)孕鼠:STZ 30、35、40 mg/kg 3 組孕鼠“三多”癥狀在孕早中期開始,至孕晚期尤為明顯,但同時間點5 組孕鼠體重無差異,并無“一少”的出現(xiàn),這與現(xiàn)有報道相互印證[15],可能原因為高血糖帶來的消耗由多飲多食來代償,使體重的減少并無統(tǒng)計學意義。 對于孕鼠的隨機血糖,STZ 30 mg/kg 組低于40 mg/kg 組,35 mg/kg 組與40 mg/kg 組在孕中晚期無統(tǒng)計學差異(E 12.5和E 18.5 時,P>0.05),因此30 mg/kg 更加安全,且能夠滿足建模濃度16.7 mmol/L 并保證子代穩(wěn)定畸形發(fā)生。 實驗中40 mg/kg 組部分孕鼠流產,說明較高劑量STZ 升高了流產率。 此外,預實驗發(fā)現(xiàn),雌鼠孕前體重240 g 以上,可為孕期提供充足體質儲備以應對孕期高糖的影響,不易流產。 (2)子鼠:在STZ 30、35、40 mg/kg 3 組子鼠中觀察到輸尿管積水(雙側或單側)及腎發(fā)育不良,體現(xiàn)了GDM 對子代泌尿系統(tǒng)的致畸作用,STZ 3 劑量組的子鼠存活率降低,再次說明母體妊娠期高血糖的危害巨大。STZ 3 劑量組子鼠輸尿管積水構成比、腎皮質厚度無差異,說明實驗設置的STZ 濃度梯度在致畸效果上無明顯差異,3 組的輸尿管擴張積水總發(fā)生率均超70%,遠高于Hokke 等[11]報道的子鼠腎和尿路畸形率26%,故本模型具有較高的致畸穩(wěn)定性,但子鼠中未發(fā)現(xiàn)其報道的重復集合系統(tǒng)、重復輸尿管等畸形,可能為樣本量不足或建模條件不同所致,因此,探索新的CAKUT 子病種模型或為后續(xù)實驗的方向之一。 輸尿管及腎的畸形由鏡下微觀結構改變引起,進而將研究思路引向機制,目前該領域機制研究涉及活性氧機制[16]、NF-κB 通路、Pax2 基因[17]、SHH 通路等[18],但研究仍不多,期待后續(xù)實驗予以探索。

本模型的意義及展望:本實驗從GDM 孕鼠模型建立方法、母鼠孕期及分娩情況、子鼠泌尿系統(tǒng)畸形情況等方面進行了研究,雖然在子鼠中僅觀察到CAKUT 子病種中的輸尿管擴張積水及腎發(fā)育不良,但該模型操作簡便、周期適中、可重復性強,可為此領域研究奠定基礎。 在后續(xù)的研究中,本課題組將摸索使子代產生重復腎/輸尿管、多囊腎等CAKUT 其他子病種的條件,建立新的穩(wěn)定動物模型;同時根據現(xiàn)有模型,從RNA、蛋白、通路等方面進行機制研究;有序地提前子鼠解剖時間,從新生鼠提前到E 18.5、E 15.5、E 12.5 的胎鼠,進一步探究母體GDM 導致子代CAKUT 的發(fā)生機制,力爭從微觀領域對GDM 導致子代CAKUT 的預警、干預提供新思路。

綜上,SD 大鼠孕1.5 d 一次性腹腔注射STZ 30 mg/kg 建模方案,既能使子鼠產生穩(wěn)定輸尿管積水和腎發(fā)育不良,又能保證孕期較安全的血糖及較低的流產率,可作為優(yōu)選建模方案。 該模型或可為此類疾病的深入研究提供新思路。