過敏性紫癜動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷膶Ρ确治黾敖Ｋ悸诽接?/h1>
2022-12-24 02:41:56段鳳陽徐閃閃丁婷宋純東張
中國比較醫(yī)學(xué)雜志 2022年10期
段鳳陽徐閃閃丁 櫻*郭 婷宋純東張 霞
(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,鄭州 450000;2.河南中醫(yī)藥大學(xué)兒科醫(yī)學(xué)院,鄭州 450000)
過敏性紫癜(Henoch-Sch?nlein purpura,HSP)是兒童時期常見的血管炎,紫癜性腎炎(HSPN)是過敏性紫癜最嚴(yán)重的并發(fā)癥,是兒童時期最常見的繼發(fā)性腎小球疾病,具有患病率逐漸升高,病程遷延,部分患兒可進(jìn)展為慢性腎衰竭等特點(diǎn),現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療尚無統(tǒng)一方案[1-4]。 目前關(guān)于HSP 或HSPN的報道多以臨床研究為主,鑒于醫(yī)學(xué)倫理等直接人體實(shí)驗(yàn)的局限性,有關(guān)本病病因探索,病機(jī)闡述,療效評價及新藥研發(fā)等方面受到極大限制,故構(gòu)建HSP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵饬x重大。 通過查閱國內(nèi)外文獻(xiàn),筆者發(fā)現(xiàn)當(dāng)前有關(guān)本病動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛嬖谖墨I(xiàn)報道少、構(gòu)建方法各異且存在學(xué)術(shù)爭鳴等特點(diǎn),下面將從國內(nèi)外建立HSP 動物模型的制備思路、理論依據(jù)、造模方法及優(yōu)缺點(diǎn)等方面進(jìn)行歸納分析,探討HSP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?gòu)思路,以供相關(guān)科研人員參考。
1 參照IgA 腎病實(shí)驗(yàn)動物模型法建立的HSP 實(shí)驗(yàn)動物模型
HSP 又稱IgA 相關(guān)性血管炎,HSPN 和IgA 腎病病理上均表現(xiàn)為腎小球系膜區(qū)以IgA 為主的免疫球蛋白沉積和系膜增生[5]。 Reamy 等[6]認(rèn)為二者本質(zhì)上是同一種疾病的全身系統(tǒng)受累或單獨(dú)腎受累的不同表現(xiàn)形式。 國內(nèi)韓冰虹等[7]參照IgA 腎病動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头ㄌ接懥薍SP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臉?gòu)建,即選用20 只KM 小鼠口服麥膠蛋白+尾靜脈注射印度墨水稀釋液。 實(shí)驗(yàn)前3 周模型組小鼠尾靜脈注射印度墨水,劑量為4 mg/100 g,每周1 次,共3 周,后予含麥膠蛋白的酸化飲用水灌胃,劑量為每只0.5 mL,隔日1 次,持續(xù)至14 周末,最后予尾靜脈注射麥膠蛋白液體,每天1 次,每只0.2 mL,連續(xù)3 d。該模型建成后有3 例小鼠出現(xiàn)了皮膚紫癜表現(xiàn),皮膚和腎組織形態(tài)學(xué)變化與人類HSP 基本一致。 沈銀紅等[8]、楊云等[9]等通過此種造模方法發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)小鼠24 h 尿蛋白定量、血清循環(huán)免疫復(fù)合物(circulating immune complex,CIC)水平、血清炎癥指標(biāo)、腎組織氧化應(yīng)激水平均出現(xiàn)了明顯改變;苗豐等[10]通過此種造模方法發(fā)現(xiàn),模型組小鼠血清尿素氮、肌酐、晚期氧化蛋白產(chǎn)物及CIC 水平明顯升高,腎病理顯示系膜區(qū)可見大量CIC 沉積,基質(zhì)大量增加,基底膜增厚。 最近的基礎(chǔ)研究表明,HSP 的發(fā)病機(jī)制與細(xì)胞免疫失衡有關(guān),主要表現(xiàn)為與Th17 細(xì)胞相關(guān)的RORγt 高表達(dá)和Treg 細(xì)胞相關(guān)的Foxp3表達(dá)顯著降低[11-12]。 貴琳等[13]在研究TLR4 單克隆抗體對HSP 小鼠的保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)中,通過qRTPCR 技術(shù)發(fā)現(xiàn),此種造模方式除腎損傷與HSP 相似外,RORγt 與Foxp3 在皮膚及腎的表達(dá)與HSP 相同。 盡管如此,此種造模方式以印度墨水封閉網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng),導(dǎo)致內(nèi)皮系統(tǒng)功能障礙,然后持續(xù)給予抗原刺激免疫系統(tǒng),促進(jìn)IgA 的產(chǎn)生及沉積,從而獲得與HSPN 相似的病理細(xì)胞因子學(xué)改變,但HSP 特征性皮疹的出現(xiàn)率卻偏低。
2013 年黃華等[14]借鑒IgA 腎病造模方法,采用牛清白蛋白(BSA)+脂多糖(LPS)+四氯化碳(CCl4)進(jìn)行HSPN 造模,實(shí)驗(yàn)動物為KM 雌性小鼠,首先予10%免疫原BSA 1200 mg/kg 灌胃,隔日1 次,持續(xù)6 周;后予蓖麻油0.5 mL+CCl40.1 mL 皮下注射,每周1 次,持續(xù)6 周;再以0.9%氯化鈉溶液配制0.025% LPS 每只小鼠尾靜脈注射0.05 mg,在第3、5 周注射,每周1 次。 造模結(jié)束后有10 只模型組小鼠死亡,尿蛋白陽性率為90%。此種造模方式以血尿、蛋白尿檢查均陽性作為造模成功標(biāo)志,但應(yīng)用藥物種類多,操作復(fù)雜,動物死亡率高。
近年來,隨著中醫(yī)中藥治療HSP 的發(fā)展,中西醫(yī)結(jié)合構(gòu)造HSP 動物模型的研究逐漸深入。 其造模思路主要是在IgA 腎病實(shí)驗(yàn)動物模型法的基礎(chǔ)上側(cè)重發(fā)揮中醫(yī)思想,首先以中醫(yī)熱性藥物灌胃造就動物血熱的偏頗體質(zhì)模型,然后參照應(yīng)用麥膠蛋白作為飲食抗原復(fù)感外邪,加以印度墨水封閉網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的經(jīng)典IgA 腎病造模方法,建立HSP實(shí)驗(yàn)動物模型,在造模前中后期分別對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行一般狀況、血尿免疫檢測及皮膚腎病理改變觀察監(jiān)測。 張奕星等[15]參考了黃華等關(guān)于HSPN 動物模型的研制思路,綜合模擬中醫(yī)瘀熱證與IgA 腎病動物模型,對紫癜性腎炎實(shí)驗(yàn)動物模型進(jìn)行了中醫(yī)病證結(jié)合的深入探索,首先運(yùn)用BSA 聯(lián)合LPS 及CCl4方法造就IgA 腎病SD 大鼠模型,即于室溫30℃下以蒸餾水配制10%免疫原BSA,隔天灌胃持續(xù)8 周(400 mg/kg),皮下注射蓖麻油0.3 mL+ CCl40.1 mL,每周1 次,共9 周,于6、8、10、12 周每只小鼠尾靜脈注射0.025% LPS 0.2 mL,并于第9 周開始隔天灌服10 mg/kg 的25%干姜水復(fù)合中醫(yī)瘀熱型動物模型。 結(jié)束后模型組6 只大鼠出現(xiàn)了肉眼血尿,2 只出現(xiàn)皮膚瘀斑,尿蛋白及紅細(xì)胞計(jì)數(shù)升高,腎病理符合HSPN 變化,并以此模型探討了丹芍顆粒Ⅲ對HSPN 大鼠血尿蛋白尿和腎組織部分蛋白的影響[16]。 這種方式創(chuàng)新了HSP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷脑炷７椒?為中醫(yī)藥治療HSP 的機(jī)理研究提供了思路。
上述HSP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臉?gòu)建理論依據(jù)來源于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為IgA 腎病和HSPN 的病理表現(xiàn)相似,HSPN 可理解為伴有皮膚紫癜等腎外表現(xiàn)的IgA腎病。 故造模成功后多偏重于腎損傷的同質(zhì)性,對于皮損癥狀出現(xiàn)的關(guān)注度偏低。 麥角蛋白聯(lián)合印度墨水法存在造模時間長,血尿出現(xiàn)率低、皮膚紫癜出現(xiàn)例數(shù)少等不足,牛清白蛋白+脂多糖+四氯化碳法雖造模時間短,但造模藥物多,操作復(fù)雜,費(fèi)用及動物死亡率高,存在造模藥物誘發(fā)動物模型臟器損傷的風(fēng)險。 盡管如此,在此種造模思路的影響下,亦出現(xiàn)了運(yùn)用中醫(yī)證型聯(lián)合IgA 腎病動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷牟∽C結(jié)合模型,推動了中醫(yī)中藥對HSP 的研究。
2 依據(jù)Ⅲ型超敏反應(yīng)原理構(gòu)建HSP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/h2>
目前世界公認(rèn)的過敏性紫癜的發(fā)病誘因主要?dú)w結(jié)于感染原和過敏原,由過敏原介導(dǎo)的Ⅲ型過敏反應(yīng),又稱免疫復(fù)合物型過敏反應(yīng)[17-18]。 潘仕紅等[19]采用卵清蛋白(OVA)作為抗原,誘導(dǎo)并激發(fā)Ⅲ型變態(tài)反應(yīng),構(gòu)建了HSP 大鼠模型,具體操作如下:取10 只SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周,然后給予10 mg/kg OVA 乳化溶液干預(yù),包括OVA 溶液(20 mg/mL)和弗氏完全佐劑以1 ∶1 混合,腹腔注射,每周1 次,共3 周。 3 周后再予10 mg/mL OVA 生理鹽水溶液尾靜脈注射,同時給予0.3% OVA 生理鹽水溶液皮內(nèi)注射,分5 個注射點(diǎn),每個點(diǎn)0.2 mL。此種造模方式80% SD 大鼠的腹部和尾部出現(xiàn)散在皮膚紫癜,血清炎癥因子明顯升高,腎病理顯示系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生,免疫熒光IgA 免疫復(fù)合物顆粒狀沉積(+++)。 李彥紅等[20-21]根據(jù)HSP 發(fā)病病因與過敏及機(jī)體自身的遺傳因素有關(guān)等因素,通過構(gòu)建兔過敏性體質(zhì),再依據(jù)Ⅲ型超敏反應(yīng)原理構(gòu)建了HSP 兔模型,其建模方法分為3 部分:先構(gòu)建過敏體質(zhì),即以蓽撥、干姜、胡椒水1 ∶1 ∶1 混合口服給藥3 周,記錄動物活動量、體溫、日飲水量及血常規(guī);再連續(xù)抗原刺激致敏,即腹腔注射含卵圓蛋白與弗氏完全佐劑1 ∶1 混合乳化溶液(每只1 mL),每周1 次,連續(xù)3 周;然后抗原沖擊激發(fā)過敏反應(yīng),即耳緣靜脈注射卵圓蛋白生理鹽水(10 mg/mL)0.5 mL,背部剪毛,皮內(nèi)注射0.3% 卵圓蛋白生理鹽水共1 mL,分5 點(diǎn),每點(diǎn)0.2 mL。 抗原激發(fā)24 h 后測動物模型血尿等一般情況,2 周后解剖,取皮膚、腎等做病理及IgA、C3 免疫熒光檢測。 造模結(jié)束后發(fā)現(xiàn),此種造模法模型組動物皮膚瘀斑出現(xiàn)率明顯提高,血液中IgA 明顯升高,補(bǔ)體C3 降低,皮膚及腎病理改變符合HSPN 表現(xiàn),經(jīng)與HSP 患兒的血液學(xué)和免疫學(xué)特征比較,發(fā)現(xiàn)該HSP 模型可以模擬兒童HSP 特征[22-24]。 候兆玉等[25]運(yùn)用此種造模方式發(fā)現(xiàn)并證實(shí),模型組家兔血清IgA 含量明顯升高,與臨床HSPN 患者相關(guān)血清學(xué)檢測具有一致性。
采用Ⅲ型超敏反應(yīng)原理HSP 實(shí)驗(yàn)動物模型,具有造模時間短,操作簡單,能很好地模擬HSP 皮膚瘀斑等優(yōu)點(diǎn),有助于研究HSP 組織炎癥和損傷相關(guān)的分子機(jī)制。 但模型組動物皮膚瘀斑僅出現(xiàn)在局部注射部位,與HSP 自發(fā)性皮膚瘀斑不同,對過敏反應(yīng)和上游免疫機(jī)制的研究有限等不足。
3 針對HSP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷膶W(xué)術(shù)爭鳴
盡管HSP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臉?gòu)建研究已經(jīng)持續(xù)了數(shù)十年,且實(shí)驗(yàn)物種由小鼠,豐富至大鼠、兔等,但是現(xiàn)有模型是否真正的代表HSP,并滿足臨床研究需要,國內(nèi)外專家意見并不一致。 部分學(xué)者認(rèn)為HSP 是一種以IgA 為主的免疫復(fù)合物介導(dǎo)的白細(xì)胞破裂性血管炎,主要累及皮膚、胃腸道、關(guān)節(jié)及腎,上述動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛢H檢測了皮膚或腎的IgA 或C3沉積,對于其他免疫球蛋白IgG、IgM 是否沉積或是否以IgA 沉積為主關(guān)注不足;另外現(xiàn)有動物模型的皮損改變是局部刺激引起,并非HSP 自發(fā)性出現(xiàn),且大多數(shù)實(shí)驗(yàn)動物物種不表達(dá)IgA 受體FcαR1,這就忽略了中性粒細(xì)胞通過FcαR1 激活的影響[26-27]。因此,這些模型是否具有HSP 發(fā)病機(jī)制的代表性尚不清楚。 對此,Li 等[28]提出了不同意見,由于HSP的主要特征是IgA 免疫復(fù)合物的沉積,C3 是該病的主要病理因素,所以實(shí)驗(yàn)主要是基于IgA 沉積和C3檢測,此結(jié)果與國外文獻(xiàn)報道一致[29-30],且其在實(shí)驗(yàn)初期檢測了IgG 及IgM 水平,但僅存在部分模型和少數(shù)對照組中;其次,臨床中HSP 自發(fā)性皮膚紫癜一定程度上屬于血管過敏反應(yīng)的外在表現(xiàn),IgA和FcαR1 之間的相互作用可能在IgA 血管炎(IgAV)的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用,但也可能屬于一種新的發(fā)病機(jī)制,與探討IgA 免疫復(fù)合物通過激活補(bǔ)體途徑引起HSP 的免疫機(jī)制并不沖突。
4 HSP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷默F(xiàn)狀述評及思路探討
4.1 HSP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷默F(xiàn)狀及不足
目前國內(nèi)外關(guān)于HSP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷奶剿髦饕l(fā)生于2000 年以后,且以國內(nèi)學(xué)者為主[31]。 就造模方法而言,主要分為基于借鑒IgA 腎病模型的麥膠蛋白+印度墨水法、牛清白蛋白+脂多糖+四氯化碳法、卵清蛋白+和弗氏完全佐劑法和參照中醫(yī)血熱理論的“病證結(jié)合”模型;就實(shí)驗(yàn)動物而言,主要包括麥膠蛋白聯(lián)合印度墨水的昆明雌性小鼠,清白蛋白+脂多糖+四氯化碳SD 雄性大鼠以及卵蛋白法選擇大耳白兔或SD 雄性大鼠,中西醫(yī)結(jié)合的“病證結(jié)合”模型多選擇SD 雄性大鼠和大耳白兔;就造模時間而言,多在3～15 周不等;就造模觀察指標(biāo)而言,主要涵蓋皮損、血、尿等實(shí)驗(yàn)室檢查、HSP 細(xì)胞因子檢測以及皮膚和腎病理形態(tài)及免疫復(fù)合物沉積。 現(xiàn)就造模時間、造模方法、優(yōu)缺點(diǎn)梳理如下。詳見表1。
表1 HSP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆?gòu)建情況歸納表Table 1 Summary table of HSP animal experiment model construction
無論是參照IgA 腎病實(shí)驗(yàn)動物模型法,還是依據(jù)Ⅲ型超敏反應(yīng)原理構(gòu)建法,雖然最終獲得了不同程度的皮膚改變及腎損傷,并經(jīng)歷了從單純復(fù)制IgA 腎病病理狀態(tài)到逐步豐富和發(fā)展到遵循HSP 發(fā)生發(fā)展規(guī)律,病癥結(jié)合的模擬人類HSPN 臨床表現(xiàn)及病理特點(diǎn)的過程。 但就目前HSP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臉?gòu)建而言,仍然存在以下問題:第一,充分參照IgA 腎病模型的造模方法不僅難以實(shí)現(xiàn)皮膚紫癜的腎外表現(xiàn),而且HSPN 和IgA 腎病畢竟存在發(fā)病年齡和預(yù)后的差異[34],因此該造模法難以完全模擬HSPN 疾病發(fā)展變化;第二,采用Ⅲ型超敏反應(yīng)原理下構(gòu)建模型,雖然更接近與HSP 的臨床及病理特征,但是難以全面解釋HSP 的發(fā)病機(jī)制及免疫損傷機(jī)制[35]。
4.2 HSP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臉?gòu)建思路與展望
結(jié)合文獻(xiàn)復(fù)習(xí),筆者認(rèn)為HSP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕㈨毦邆湟韵聝蓚€原則:一是高度的相似性原則,即紫癜性腎炎動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒荒軉渭冏穼てつw或腎病理改變的相似性,更應(yīng)復(fù)合其自身發(fā)病規(guī)律,即不僅僅包含皮膚紫癜,更應(yīng)側(cè)重于本病發(fā)病原因、機(jī)體免疫學(xué)變化等因素,因此李彥紅等[23]依據(jù)Ⅲ型超敏反應(yīng)原理構(gòu)建的HSP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c臨床的契合度更高;二是穩(wěn)定的可重復(fù)性原則,任何經(jīng)典模型的建立都要經(jīng)歷千萬次實(shí)驗(yàn)的重復(fù),而基于重復(fù)實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性是我們更好的研究該病的發(fā)病機(jī)理和研發(fā)治療新藥的重要保證。 基于以上問題,筆者認(rèn)為在目前國內(nèi)外尚缺乏成熟的HSP 實(shí)驗(yàn)動物模型的情況下,對于HSP(尤其是HSPN)的研究,通過細(xì)胞培養(yǎng)體外實(shí)驗(yàn)交互驗(yàn)證的方式探索HSP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂赡苁翘岣逪SP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ统墒煨缘姆椒ㄖ弧?/p>
任何一種動物模型的構(gòu)建都是一項(xiàng)艱巨和復(fù)雜的工作,它需要伴隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,不斷地探索創(chuàng)新和完善。 HSP 病因復(fù)雜,發(fā)病機(jī)制尚未明確,單純皮損及腎病理的改變并不能完全反映其發(fā)病本質(zhì)。未來的研究不僅需要更大的動物隊(duì)列樣本進(jìn)一步闡明病因,更需要集中在相關(guān)免疫學(xué)指標(biāo)及細(xì)胞因子水平、基因及遺傳水平等方面進(jìn)行深入探討。
猜你喜歡
肥胖中醫(yī)證候動物模型研究進(jìn)展世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化(2022年9期)2023-01-17 07:31:10 胃癌前病變動物模型復(fù)制實(shí)驗(yàn)進(jìn)展世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化(2021年5期)2021-11-05 06:54:30 腎陽虛證動物模型建立方法及評定標(biāo)準(zhǔn)研究進(jìn)展江西中醫(yī)藥(2021年8期)2021-08-10 03:04:30 脾腎陽虛型骨質(zhì)疏松癥動物模型造模方法及模型評價世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化(2021年12期)2021-04-19 12:30:32 濕熱證動物模型造模方法及評價研究世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化(2021年12期)2021-04-19 12:30:16 潰瘍性結(jié)腸炎動物模型研究進(jìn)展世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化(2020年2期)2020-07-25 02:06:22 說說過敏性紫癜家庭醫(yī)學(xué)(下半月)(2020年4期)2020-05-30 12:42:42 蒙藥治療干燥綜合征伴血小板減少性紫癜1例中國民族醫(yī)藥雜志(2016年4期)2016-05-09 07:41:00 糖尿病性視網(wǎng)膜病變動物模型研究進(jìn)展中國中醫(yī)眼科雜志(2015年1期)2015-12-28 12:07:04 激素在過敏性紫癜的應(yīng)用西藏科技(2015年11期)2015-09-26 12:11:36
段鳳陽徐閃閃丁 櫻*郭 婷宋純東張 霞
(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,鄭州 450000;2.河南中醫(yī)藥大學(xué)兒科醫(yī)學(xué)院,鄭州 450000)
過敏性紫癜(Henoch-Sch?nlein purpura,HSP)是兒童時期常見的血管炎,紫癜性腎炎(HSPN)是過敏性紫癜最嚴(yán)重的并發(fā)癥,是兒童時期最常見的繼發(fā)性腎小球疾病,具有患病率逐漸升高,病程遷延,部分患兒可進(jìn)展為慢性腎衰竭等特點(diǎn),現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療尚無統(tǒng)一方案[1-4]。 目前關(guān)于HSP 或HSPN的報道多以臨床研究為主,鑒于醫(yī)學(xué)倫理等直接人體實(shí)驗(yàn)的局限性,有關(guān)本病病因探索,病機(jī)闡述,療效評價及新藥研發(fā)等方面受到極大限制,故構(gòu)建HSP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵饬x重大。 通過查閱國內(nèi)外文獻(xiàn),筆者發(fā)現(xiàn)當(dāng)前有關(guān)本病動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ痛嬖谖墨I(xiàn)報道少、構(gòu)建方法各異且存在學(xué)術(shù)爭鳴等特點(diǎn),下面將從國內(nèi)外建立HSP 動物模型的制備思路、理論依據(jù)、造模方法及優(yōu)缺點(diǎn)等方面進(jìn)行歸納分析,探討HSP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕?gòu)思路,以供相關(guān)科研人員參考。
1 參照IgA 腎病實(shí)驗(yàn)動物模型法建立的HSP 實(shí)驗(yàn)動物模型
HSP 又稱IgA 相關(guān)性血管炎,HSPN 和IgA 腎病病理上均表現(xiàn)為腎小球系膜區(qū)以IgA 為主的免疫球蛋白沉積和系膜增生[5]。 Reamy 等[6]認(rèn)為二者本質(zhì)上是同一種疾病的全身系統(tǒng)受累或單獨(dú)腎受累的不同表現(xiàn)形式。 國內(nèi)韓冰虹等[7]參照IgA 腎病動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头ㄌ接懥薍SP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臉?gòu)建,即選用20 只KM 小鼠口服麥膠蛋白+尾靜脈注射印度墨水稀釋液。 實(shí)驗(yàn)前3 周模型組小鼠尾靜脈注射印度墨水,劑量為4 mg/100 g,每周1 次,共3 周,后予含麥膠蛋白的酸化飲用水灌胃,劑量為每只0.5 mL,隔日1 次,持續(xù)至14 周末,最后予尾靜脈注射麥膠蛋白液體,每天1 次,每只0.2 mL,連續(xù)3 d。該模型建成后有3 例小鼠出現(xiàn)了皮膚紫癜表現(xiàn),皮膚和腎組織形態(tài)學(xué)變化與人類HSP 基本一致。 沈銀紅等[8]、楊云等[9]等通過此種造模方法發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)小鼠24 h 尿蛋白定量、血清循環(huán)免疫復(fù)合物(circulating immune complex,CIC)水平、血清炎癥指標(biāo)、腎組織氧化應(yīng)激水平均出現(xiàn)了明顯改變;苗豐等[10]通過此種造模方法發(fā)現(xiàn),模型組小鼠血清尿素氮、肌酐、晚期氧化蛋白產(chǎn)物及CIC 水平明顯升高,腎病理顯示系膜區(qū)可見大量CIC 沉積,基質(zhì)大量增加,基底膜增厚。 最近的基礎(chǔ)研究表明,HSP 的發(fā)病機(jī)制與細(xì)胞免疫失衡有關(guān),主要表現(xiàn)為與Th17 細(xì)胞相關(guān)的RORγt 高表達(dá)和Treg 細(xì)胞相關(guān)的Foxp3表達(dá)顯著降低[11-12]。 貴琳等[13]在研究TLR4 單克隆抗體對HSP 小鼠的保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)中,通過qRTPCR 技術(shù)發(fā)現(xiàn),此種造模方式除腎損傷與HSP 相似外,RORγt 與Foxp3 在皮膚及腎的表達(dá)與HSP 相同。 盡管如此,此種造模方式以印度墨水封閉網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng),導(dǎo)致內(nèi)皮系統(tǒng)功能障礙,然后持續(xù)給予抗原刺激免疫系統(tǒng),促進(jìn)IgA 的產(chǎn)生及沉積,從而獲得與HSPN 相似的病理細(xì)胞因子學(xué)改變,但HSP 特征性皮疹的出現(xiàn)率卻偏低。
2013 年黃華等[14]借鑒IgA 腎病造模方法,采用牛清白蛋白(BSA)+脂多糖(LPS)+四氯化碳(CCl4)進(jìn)行HSPN 造模,實(shí)驗(yàn)動物為KM 雌性小鼠,首先予10%免疫原BSA 1200 mg/kg 灌胃,隔日1 次,持續(xù)6 周;后予蓖麻油0.5 mL+CCl40.1 mL 皮下注射,每周1 次,持續(xù)6 周;再以0.9%氯化鈉溶液配制0.025% LPS 每只小鼠尾靜脈注射0.05 mg,在第3、5 周注射,每周1 次。 造模結(jié)束后有10 只模型組小鼠死亡,尿蛋白陽性率為90%。此種造模方式以血尿、蛋白尿檢查均陽性作為造模成功標(biāo)志,但應(yīng)用藥物種類多,操作復(fù)雜,動物死亡率高。
近年來,隨著中醫(yī)中藥治療HSP 的發(fā)展,中西醫(yī)結(jié)合構(gòu)造HSP 動物模型的研究逐漸深入。 其造模思路主要是在IgA 腎病實(shí)驗(yàn)動物模型法的基礎(chǔ)上側(cè)重發(fā)揮中醫(yī)思想,首先以中醫(yī)熱性藥物灌胃造就動物血熱的偏頗體質(zhì)模型,然后參照應(yīng)用麥膠蛋白作為飲食抗原復(fù)感外邪,加以印度墨水封閉網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的經(jīng)典IgA 腎病造模方法,建立HSP實(shí)驗(yàn)動物模型,在造模前中后期分別對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行一般狀況、血尿免疫檢測及皮膚腎病理改變觀察監(jiān)測。 張奕星等[15]參考了黃華等關(guān)于HSPN 動物模型的研制思路,綜合模擬中醫(yī)瘀熱證與IgA 腎病動物模型,對紫癜性腎炎實(shí)驗(yàn)動物模型進(jìn)行了中醫(yī)病證結(jié)合的深入探索,首先運(yùn)用BSA 聯(lián)合LPS 及CCl4方法造就IgA 腎病SD 大鼠模型,即于室溫30℃下以蒸餾水配制10%免疫原BSA,隔天灌胃持續(xù)8 周(400 mg/kg),皮下注射蓖麻油0.3 mL+ CCl40.1 mL,每周1 次,共9 周,于6、8、10、12 周每只小鼠尾靜脈注射0.025% LPS 0.2 mL,并于第9 周開始隔天灌服10 mg/kg 的25%干姜水復(fù)合中醫(yī)瘀熱型動物模型。 結(jié)束后模型組6 只大鼠出現(xiàn)了肉眼血尿,2 只出現(xiàn)皮膚瘀斑,尿蛋白及紅細(xì)胞計(jì)數(shù)升高,腎病理符合HSPN 變化,并以此模型探討了丹芍顆粒Ⅲ對HSPN 大鼠血尿蛋白尿和腎組織部分蛋白的影響[16]。 這種方式創(chuàng)新了HSP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷脑炷７椒?為中醫(yī)藥治療HSP 的機(jī)理研究提供了思路。
上述HSP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臉?gòu)建理論依據(jù)來源于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為IgA 腎病和HSPN 的病理表現(xiàn)相似,HSPN 可理解為伴有皮膚紫癜等腎外表現(xiàn)的IgA腎病。 故造模成功后多偏重于腎損傷的同質(zhì)性,對于皮損癥狀出現(xiàn)的關(guān)注度偏低。 麥角蛋白聯(lián)合印度墨水法存在造模時間長,血尿出現(xiàn)率低、皮膚紫癜出現(xiàn)例數(shù)少等不足,牛清白蛋白+脂多糖+四氯化碳法雖造模時間短,但造模藥物多,操作復(fù)雜,費(fèi)用及動物死亡率高,存在造模藥物誘發(fā)動物模型臟器損傷的風(fēng)險。 盡管如此,在此種造模思路的影響下,亦出現(xiàn)了運(yùn)用中醫(yī)證型聯(lián)合IgA 腎病動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷牟∽C結(jié)合模型,推動了中醫(yī)中藥對HSP 的研究。
2 依據(jù)Ⅲ型超敏反應(yīng)原理構(gòu)建HSP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/h2>
目前世界公認(rèn)的過敏性紫癜的發(fā)病誘因主要?dú)w結(jié)于感染原和過敏原,由過敏原介導(dǎo)的Ⅲ型過敏反應(yīng),又稱免疫復(fù)合物型過敏反應(yīng)[17-18]。 潘仕紅等[19]采用卵清蛋白(OVA)作為抗原,誘導(dǎo)并激發(fā)Ⅲ型變態(tài)反應(yīng),構(gòu)建了HSP 大鼠模型,具體操作如下:取10 只SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周,然后給予10 mg/kg OVA 乳化溶液干預(yù),包括OVA 溶液(20 mg/mL)和弗氏完全佐劑以1 ∶1 混合,腹腔注射,每周1 次,共3 周。 3 周后再予10 mg/mL OVA 生理鹽水溶液尾靜脈注射,同時給予0.3% OVA 生理鹽水溶液皮內(nèi)注射,分5 個注射點(diǎn),每個點(diǎn)0.2 mL。此種造模方式80% SD 大鼠的腹部和尾部出現(xiàn)散在皮膚紫癜,血清炎癥因子明顯升高,腎病理顯示系膜細(xì)胞及基質(zhì)增生,免疫熒光IgA 免疫復(fù)合物顆粒狀沉積(+++)。 李彥紅等[20-21]根據(jù)HSP 發(fā)病病因與過敏及機(jī)體自身的遺傳因素有關(guān)等因素,通過構(gòu)建兔過敏性體質(zhì),再依據(jù)Ⅲ型超敏反應(yīng)原理構(gòu)建了HSP 兔模型,其建模方法分為3 部分:先構(gòu)建過敏體質(zhì),即以蓽撥、干姜、胡椒水1 ∶1 ∶1 混合口服給藥3 周,記錄動物活動量、體溫、日飲水量及血常規(guī);再連續(xù)抗原刺激致敏,即腹腔注射含卵圓蛋白與弗氏完全佐劑1 ∶1 混合乳化溶液(每只1 mL),每周1 次,連續(xù)3 周;然后抗原沖擊激發(fā)過敏反應(yīng),即耳緣靜脈注射卵圓蛋白生理鹽水(10 mg/mL)0.5 mL,背部剪毛,皮內(nèi)注射0.3% 卵圓蛋白生理鹽水共1 mL,分5 點(diǎn),每點(diǎn)0.2 mL。 抗原激發(fā)24 h 后測動物模型血尿等一般情況,2 周后解剖,取皮膚、腎等做病理及IgA、C3 免疫熒光檢測。 造模結(jié)束后發(fā)現(xiàn),此種造模法模型組動物皮膚瘀斑出現(xiàn)率明顯提高,血液中IgA 明顯升高,補(bǔ)體C3 降低,皮膚及腎病理改變符合HSPN 表現(xiàn),經(jīng)與HSP 患兒的血液學(xué)和免疫學(xué)特征比較,發(fā)現(xiàn)該HSP 模型可以模擬兒童HSP 特征[22-24]。 候兆玉等[25]運(yùn)用此種造模方式發(fā)現(xiàn)并證實(shí),模型組家兔血清IgA 含量明顯升高,與臨床HSPN 患者相關(guān)血清學(xué)檢測具有一致性。
采用Ⅲ型超敏反應(yīng)原理HSP 實(shí)驗(yàn)動物模型,具有造模時間短,操作簡單,能很好地模擬HSP 皮膚瘀斑等優(yōu)點(diǎn),有助于研究HSP 組織炎癥和損傷相關(guān)的分子機(jī)制。 但模型組動物皮膚瘀斑僅出現(xiàn)在局部注射部位,與HSP 自發(fā)性皮膚瘀斑不同,對過敏反應(yīng)和上游免疫機(jī)制的研究有限等不足。
3 針對HSP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷膶W(xué)術(shù)爭鳴
盡管HSP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臉?gòu)建研究已經(jīng)持續(xù)了數(shù)十年,且實(shí)驗(yàn)物種由小鼠,豐富至大鼠、兔等,但是現(xiàn)有模型是否真正的代表HSP,并滿足臨床研究需要,國內(nèi)外專家意見并不一致。 部分學(xué)者認(rèn)為HSP 是一種以IgA 為主的免疫復(fù)合物介導(dǎo)的白細(xì)胞破裂性血管炎,主要累及皮膚、胃腸道、關(guān)節(jié)及腎,上述動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛢H檢測了皮膚或腎的IgA 或C3沉積,對于其他免疫球蛋白IgG、IgM 是否沉積或是否以IgA 沉積為主關(guān)注不足;另外現(xiàn)有動物模型的皮損改變是局部刺激引起,并非HSP 自發(fā)性出現(xiàn),且大多數(shù)實(shí)驗(yàn)動物物種不表達(dá)IgA 受體FcαR1,這就忽略了中性粒細(xì)胞通過FcαR1 激活的影響[26-27]。因此,這些模型是否具有HSP 發(fā)病機(jī)制的代表性尚不清楚。 對此,Li 等[28]提出了不同意見,由于HSP的主要特征是IgA 免疫復(fù)合物的沉積,C3 是該病的主要病理因素,所以實(shí)驗(yàn)主要是基于IgA 沉積和C3檢測,此結(jié)果與國外文獻(xiàn)報道一致[29-30],且其在實(shí)驗(yàn)初期檢測了IgG 及IgM 水平,但僅存在部分模型和少數(shù)對照組中;其次,臨床中HSP 自發(fā)性皮膚紫癜一定程度上屬于血管過敏反應(yīng)的外在表現(xiàn),IgA和FcαR1 之間的相互作用可能在IgA 血管炎(IgAV)的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用,但也可能屬于一種新的發(fā)病機(jī)制,與探討IgA 免疫復(fù)合物通過激活補(bǔ)體途徑引起HSP 的免疫機(jī)制并不沖突。
4 HSP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷默F(xiàn)狀述評及思路探討
4.1 HSP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷默F(xiàn)狀及不足
目前國內(nèi)外關(guān)于HSP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷奶剿髦饕l(fā)生于2000 年以后,且以國內(nèi)學(xué)者為主[31]。 就造模方法而言,主要分為基于借鑒IgA 腎病模型的麥膠蛋白+印度墨水法、牛清白蛋白+脂多糖+四氯化碳法、卵清蛋白+和弗氏完全佐劑法和參照中醫(yī)血熱理論的“病證結(jié)合”模型;就實(shí)驗(yàn)動物而言,主要包括麥膠蛋白聯(lián)合印度墨水的昆明雌性小鼠,清白蛋白+脂多糖+四氯化碳SD 雄性大鼠以及卵蛋白法選擇大耳白兔或SD 雄性大鼠,中西醫(yī)結(jié)合的“病證結(jié)合”模型多選擇SD 雄性大鼠和大耳白兔;就造模時間而言,多在3～15 周不等;就造模觀察指標(biāo)而言,主要涵蓋皮損、血、尿等實(shí)驗(yàn)室檢查、HSP 細(xì)胞因子檢測以及皮膚和腎病理形態(tài)及免疫復(fù)合物沉積。 現(xiàn)就造模時間、造模方法、優(yōu)缺點(diǎn)梳理如下。詳見表1。
表1 HSP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆?gòu)建情況歸納表Table 1 Summary table of HSP animal experiment model construction
無論是參照IgA 腎病實(shí)驗(yàn)動物模型法,還是依據(jù)Ⅲ型超敏反應(yīng)原理構(gòu)建法,雖然最終獲得了不同程度的皮膚改變及腎損傷,并經(jīng)歷了從單純復(fù)制IgA 腎病病理狀態(tài)到逐步豐富和發(fā)展到遵循HSP 發(fā)生發(fā)展規(guī)律,病癥結(jié)合的模擬人類HSPN 臨床表現(xiàn)及病理特點(diǎn)的過程。 但就目前HSP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臉?gòu)建而言,仍然存在以下問題:第一,充分參照IgA 腎病模型的造模方法不僅難以實(shí)現(xiàn)皮膚紫癜的腎外表現(xiàn),而且HSPN 和IgA 腎病畢竟存在發(fā)病年齡和預(yù)后的差異[34],因此該造模法難以完全模擬HSPN 疾病發(fā)展變化;第二,采用Ⅲ型超敏反應(yīng)原理下構(gòu)建模型,雖然更接近與HSP 的臨床及病理特征,但是難以全面解釋HSP 的發(fā)病機(jī)制及免疫損傷機(jī)制[35]。
4.2 HSP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臉?gòu)建思路與展望
結(jié)合文獻(xiàn)復(fù)習(xí),筆者認(rèn)為HSP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕㈨毦邆湟韵聝蓚€原則:一是高度的相似性原則,即紫癜性腎炎動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒荒軉渭冏穼てつw或腎病理改變的相似性,更應(yīng)復(fù)合其自身發(fā)病規(guī)律,即不僅僅包含皮膚紫癜,更應(yīng)側(cè)重于本病發(fā)病原因、機(jī)體免疫學(xué)變化等因素,因此李彥紅等[23]依據(jù)Ⅲ型超敏反應(yīng)原理構(gòu)建的HSP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ团c臨床的契合度更高;二是穩(wěn)定的可重復(fù)性原則,任何經(jīng)典模型的建立都要經(jīng)歷千萬次實(shí)驗(yàn)的重復(fù),而基于重復(fù)實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性是我們更好的研究該病的發(fā)病機(jī)理和研發(fā)治療新藥的重要保證。 基于以上問題,筆者認(rèn)為在目前國內(nèi)外尚缺乏成熟的HSP 實(shí)驗(yàn)動物模型的情況下,對于HSP(尤其是HSPN)的研究,通過細(xì)胞培養(yǎng)體外實(shí)驗(yàn)交互驗(yàn)證的方式探索HSP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ涂赡苁翘岣逪SP 動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ统墒煨缘姆椒ㄖ弧?/p>
任何一種動物模型的構(gòu)建都是一項(xiàng)艱巨和復(fù)雜的工作,它需要伴隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,不斷地探索創(chuàng)新和完善。 HSP 病因復(fù)雜,發(fā)病機(jī)制尚未明確,單純皮損及腎病理的改變并不能完全反映其發(fā)病本質(zhì)。未來的研究不僅需要更大的動物隊(duì)列樣本進(jìn)一步闡明病因,更需要集中在相關(guān)免疫學(xué)指標(biāo)及細(xì)胞因子水平、基因及遺傳水平等方面進(jìn)行深入探討。
猜你喜歡
世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化(2022年9期)2023-01-17 07:31:10
世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化(2021年5期)2021-11-05 06:54:30
江西中醫(yī)藥(2021年8期)2021-08-10 03:04:30
世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化(2021年12期)2021-04-19 12:30:32
世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化(2021年12期)2021-04-19 12:30:16
世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化(2020年2期)2020-07-25 02:06:22
家庭醫(yī)學(xué)(下半月)(2020年4期)2020-05-30 12:42:42
中國民族醫(yī)藥雜志(2016年4期)2016-05-09 07:41:00
中國中醫(yī)眼科雜志(2015年1期)2015-12-28 12:07:04
西藏科技(2015年11期)2015-09-26 12:11:36
