李霄鶴 趙晨靜 李蓮 寧文

器官纖維化是由多種急慢性病變引起的器官內(nèi)纖維結(jié)締組織增多和實質(zhì)細胞減少的病理性變化,是多種慢性疾病的共同病理特征。纖維化持續(xù)進展可導(dǎo)致器官結(jié)構(gòu)破壞和功能減退，實質(zhì)臟器纖維化(如肝臟、肺臟、腎臟、皮膚、心臟等)導(dǎo)致的器官功能衰竭是患者致殘、死亡的主要原因，死亡人數(shù)約占全球死亡總?cè)藬?shù)的1/3[1]。器官纖維化的發(fā)病機制尚未完全闡明，近年來的研究表明，組織修復(fù)過程中肌成纖維細胞過度增殖、膠原等胞外基質(zhì)大量合成沉積是纖維化形成的生物學(xué)基礎(chǔ)[2]。多種類型細胞參與器官纖維化發(fā)病過程，雖然肌成纖維細胞被認為是纖維化的效應(yīng)細胞，但血管內(nèi)皮細胞對纖維化發(fā)生發(fā)展的貢獻也越來越得到關(guān)注[3]。已有研究表明，血管內(nèi)皮細胞可通過多種機制促進器官纖維化的發(fā)生發(fā)展，包括直接作用(如通過內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化充當肌成纖維細胞來源)或通過間接作用(如驅(qū)動炎癥反應(yīng)、分泌外泌體、參與調(diào)控毛細血管稀疏和血管衰老等)。本文主要對血管內(nèi)皮細胞參與調(diào)控器官纖維化進展的不同作用機制進行綜述。

一、血管內(nèi)皮細胞簡介

人體的脈管系統(tǒng)是由心血管系和淋巴系組成的一系列密閉、分布于全身的管道系統(tǒng)，負責提供養(yǎng)分和氧氣并清除全身的廢棄代謝物，在維持組織穩(wěn)態(tài)方面起著至關(guān)重要的作用。血管內(nèi)皮細胞也稱為內(nèi)皮細胞，通常指襯于心、血管和淋巴管內(nèi)表面的單層扁平上皮，形成血管的內(nèi)壁并參與血液循環(huán)[4]。在健康狀態(tài)下，內(nèi)皮細胞通常處于靜止狀態(tài)，而當機體存在缺血或組織損傷時，內(nèi)皮細胞可大量活化增殖并促進血管生成，同時活化的內(nèi)皮細胞還可協(xié)助驅(qū)動炎癥反應(yīng)[5]。

二、血管內(nèi)皮細胞對器官纖維化的直接作用

在器官纖維化進程中，肌成纖維細胞是組織重塑和纖維化的主要效應(yīng)細胞之一，在組織損傷期間，肌成纖維細胞數(shù)量增加，在修復(fù)和重建過程中產(chǎn)生大量膠原蛋白和其他細胞外基質(zhì)成分。肌成纖維細胞的來源主要是原位靜止成纖維細胞的分化，同時也不排除少量其他類型細胞的轉(zhuǎn)分化，如內(nèi)皮細胞向間充質(zhì)細胞的表型轉(zhuǎn)變(EndoMT)[6]。在EndoMT這一轉(zhuǎn)分化的過程中，內(nèi)皮細胞脫離原有組織的內(nèi)皮層并遷移到實質(zhì)，失去內(nèi)皮細胞特有的極性、形態(tài)和標記物，同時獲得間充質(zhì)細胞樣的表征并表達間充質(zhì)細胞標記物[7]。

盡管已有諸多EndoMT在纖維化中的作用機制研究，但EndoMT對纖維化過程中肌成纖維細胞群的貢獻仍廣受爭議。這是因為迄今為止仍未有廣泛認可的EndoMT特異性標記物和標記手段。EndoMT的體外研究通常是利用轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β處理不同來源的內(nèi)皮細胞，在有無外界化學(xué)或物理刺激的情況下利用蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western blot)評估內(nèi)皮細胞與間充質(zhì)/成纖維細胞特異性標記物表達情況。在體水平的研究主要通過免疫染色方法檢測內(nèi)皮和(或)間充質(zhì)標記物的共定位。以上檢測手段的準確度依賴于內(nèi)皮和間充質(zhì)標記物的特異程度及熒光顯微鏡的掃描精度[8]。

在體內(nèi)研究中判定EndoMT存在的最有效方法是譜系追蹤，即使用內(nèi)皮特異性Cre-LoxP譜系追蹤小鼠，在內(nèi)皮特異性基因的空間和(或)時間控制下激活Cre重組酶用于驅(qū)動報告蛋白的表達，可標記所有內(nèi)皮來源的細胞[9]，但該方法也存在一定局限性，即所選內(nèi)皮細胞標記物的特異性。在心臟纖維化中，Zeisberg等[10]使用Tie1 Cre-LoxP內(nèi)皮譜系追蹤系統(tǒng)追蹤內(nèi)皮起源細胞，并使用成纖維細胞特異性蛋白1(FSP1)作為成纖維細胞標記物，該研究證明心臟纖維化中EndoMT來源的肌成纖維細胞占心臟肌成纖維細胞總數(shù)的27%～35%。然而，這種組成型Tie1-Cre也可標記源自胚胎心內(nèi)膜EndoMT的間充質(zhì)細胞，同時，巨噬細胞和內(nèi)皮細胞也可表達成纖維細胞標記物FSP1[11]，因此在該研究中，并非所有源自Tie1+細胞的FSP1+細胞都是成纖維細胞，也可能是FSP1+內(nèi)皮細胞。在另一項研究中，Moore-Morris等[12]使用多個Cre小鼠品系和心臟成纖維細胞特異性Col1a1-GFP標記來追蹤小鼠壓力超負荷模型中心臟成纖維細胞的起源，發(fā)現(xiàn)促纖維化的心臟成纖維細胞均來自心外膜和間質(zhì)的常駐成纖維細胞，而并非來自EndoMT。在腎纖維化中，Zeisberg等[13]使用譜系追蹤發(fā)現(xiàn)EndoMT來源的肌成纖維細胞比例為30%～50%，而LeBleu等[14]的譜系追蹤研究結(jié)果表明該比例為10%。在肺纖維化中，Hashimoto等[15]發(fā)現(xiàn)博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型中EndoMT來源的肌成纖維細胞比例約為16%。

總而言之，上述研究引發(fā)了關(guān)于EndoMT對纖維化真正貢獻的爭議，已有研究顯示，EndoMT來源的肌成纖維細胞對總肌成纖維細胞群的貢獻比例并不高[10,12-15]，因此針對該類表型轉(zhuǎn)變的深入研究可能并不具備較高的科學(xué)意義。

三、血管內(nèi)皮細胞對器官纖維化的間接作用

1.內(nèi)皮細胞活化

健康機體中的血管內(nèi)皮細胞在正常狀態(tài)下通常處于靜止/非活化狀態(tài)，并在調(diào)控血流、調(diào)節(jié)血管壁通透性方面發(fā)揮重要作用[16]。在纖維化狀態(tài)下，非活化內(nèi)皮細胞可維持血管穩(wěn)態(tài)，并可通過調(diào)控細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1和2(ERK1/2)、轉(zhuǎn)錄因子Nanog等發(fā)揮抗纖維化作用[17-18]。內(nèi)皮細胞活化的概念最早于上世紀60年代由Willms-Kretschmer等[19]提出，經(jīng)過研究的深入，Hunt等[20]提出了更全面的定義，即內(nèi)皮細胞的活化是細胞對環(huán)境刺激發(fā)生的細胞表型和功能的變化，包括5個核心特征，即血管完整性降低、白細胞粘附分子表達上調(diào)、細胞因子分泌增加、人類白細胞抗原表達增加及凝血功能增強。活化的內(nèi)皮細胞通常起到促纖維化作用，以下分別從5個不同角度詳細介紹活化的內(nèi)皮細胞參與促纖維化調(diào)控的作用機制。

2.活化內(nèi)皮細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與器官纖維化

活化的內(nèi)皮細胞可驅(qū)動和促進炎癥反應(yīng)，間接激活成纖維細胞和促進胞外基質(zhì)沉積，在器官纖維化的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[21-24]。在壓力誘導(dǎo)的心臟纖維化模型中，白細胞粘附分子如血管細胞粘附因子-1(VCAM-1)和細胞間黏附分子-1(ICAM-1)可在內(nèi)皮細胞中被誘導(dǎo)表達，通過調(diào)控內(nèi)皮細胞間隙來促進巨噬細胞募集到受損心臟組織中，進而促進纖維化[24]。與此同時，內(nèi)皮細胞可直接分泌多種細胞因子和趨化因子，如結(jié)締組織生長因子(CTGF)、纖溶酶原激活物抑制劑1(PAI-1)、骨橋蛋白(Osteopontin)、纖連蛋白(Fibronectin)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、IL-8、IL-33等促炎介質(zhì)招募巨噬細胞等炎癥細胞至組織損傷處，從而促進纖維化。MCP-1(又稱為CCL2)是參與內(nèi)皮細胞促纖維化作用的關(guān)鍵趨化因子，MCP-1信號通路在內(nèi)皮細胞中缺失可減少免疫細胞募集和內(nèi)皮滲漏，進而緩解肺纖維化[25]。IL-8(又稱為CXCL8)也可由內(nèi)皮細胞分泌產(chǎn)生，可介導(dǎo)纖維化過程中的中性粒細胞募集[26]，IL-8受體拮抗劑可顯著緩解博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化[27]。

3.內(nèi)皮細胞來源的外泌體與器官纖維化

外泌體是由細胞分泌到細胞外空間的直徑為40～100nm的納米囊泡，其可與靶細胞的質(zhì)膜融合，將內(nèi)容物[如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNA、微小RNA(miRNA,miR)和DNA等]釋放到靶細胞的細胞質(zhì)中，是介導(dǎo)細胞間通訊和大分子轉(zhuǎn)運過程中的關(guān)鍵介質(zhì)[28-29]。在器官纖維化過程中，活化的內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的外泌體可包含重要的促纖維化因子[30-31]。de Jong等[30]在缺氧損傷后的內(nèi)皮細胞外泌體中發(fā)現(xiàn)賴氨酰氧化酶樣2(LOXL2)高表達，該類外泌體可顯著增加膠原蛋白和彈性蛋白的交聯(lián)，增強纖維化組織的剛度，促進纖維化進展，而將LOXL2在內(nèi)皮細胞中敲除可顯著抑制外泌體的促纖維化活性。此外，在活化內(nèi)皮細胞來源的外泌體中也發(fā)現(xiàn)了Ⅰ型膠原蛋白和促纖維化因子結(jié)締組織生長因子(CTGF)的mRNA[32]。

在內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的外泌體中也同時存在具有調(diào)控纖維化功能的miRNAs。Wang等[33]研究發(fā)現(xiàn)抗纖維化介質(zhì)miR-107在肺纖維化患者肺組織及肺血管內(nèi)皮細胞衍生的外泌體中表達下調(diào)，miR-107在肺血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的外泌體中過表達后可通過調(diào)控HIF-1α/Notch1/PDGFRβ/YAP1/Twist1信號通路來抑制周細胞的促纖維化表型，進而緩解肺纖維化。

4.內(nèi)皮細胞介導(dǎo)的毛細血管稀疏與器官纖維化

毛細血管稀疏廣義上被定義為血管密度降低，是引起機體慢性缺血缺氧的重要原因，可在糖尿病[34]、心力衰竭[35]等疾病中發(fā)生。組織纖維化過程也伴隨著毛細血管稀疏的發(fā)生，但毛細血管稀疏是組織纖維化的觸發(fā)因素、促成因素還是結(jié)果仍存在爭議，已有研究發(fā)現(xiàn)血管稀疏先于纖維化，特別是在腎損傷模型中[36-37]。在肺纖維化過程中也存在血管稀疏現(xiàn)象，纖維化病灶內(nèi)的血管密度顯著減少，血管阻力增加進而導(dǎo)致肺動脈高壓(PH)，8%～15%的特發(fā)性肺纖維化(IPF)患者及高達60%的終末期IPF患者均存在PH，且與死亡率增加呈正相關(guān)[38]。

血管稀疏的誘導(dǎo)因素存在多種機制，包括內(nèi)皮細胞凋亡與氧化應(yīng)激[39]、內(nèi)皮細胞抗體引起微血管損傷[40]、循環(huán)內(nèi)皮祖細胞減少及血管生成/抑制因子的失衡[41]等。在IPF成纖維細胞病灶中，血管抑制因子[如色素上皮衍生因子(PEDF)]過表達，而血管生成因子[如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)]在病灶內(nèi)的表達極少[42]。血管生成素(Ang)也是一類血管生長因子，其中Ang-1可與內(nèi)皮細胞膜上特異性酪氨酸激酶受體Tie2結(jié)合，抑制內(nèi)皮細胞凋亡[43]。有研究顯示，Ang-1在腎纖維化過程中表達下調(diào)，Ang-1缺失可顯著降低血管密度，進而促進纖維化標志物表達增加，使腎纖維化程度加重[44]。

5.內(nèi)皮細胞介導(dǎo)的血管衰老與器官纖維化

目前血管衰老作為抗衰老治療的潛在靶標被廣泛關(guān)注。衰老細胞是一類增殖停滯的細胞，可高表達衰老相關(guān)標志物(如細胞周期抑制因子p16INK4A、p21、p53)，并具有炎癥性衰老相關(guān)分泌表型(SASP)，可分泌IL-1、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子(TNF)-α和TGF-β[45]。慢性衰老的細胞可促進多種病理進程，包括肺臟和腎臟纖維化[46]。衰老人群的內(nèi)皮細胞亦可表達高水平的p16INK4A、p21、p53，且血管功能性降低，血管生成存在缺陷[47]。Ramadhiani等[48]利用內(nèi)皮細胞特異性早衰小鼠揭示了內(nèi)皮細胞衰老可使肺纖維化程度加重，且可通過內(nèi)皮細胞-SASP促進肺內(nèi)常駐成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)變，并可加速EndoMT轉(zhuǎn)分化進程，促進纖維化進展。已有研究發(fā)現(xiàn)清除慢性衰老的內(nèi)皮細胞可改善血管功能[49]，并具有抗纖維化作用[50]。

6.內(nèi)皮細胞參與的上皮細胞再生微環(huán)境與器官纖維化

肺臟和肝臟器官在正常情況下都具有再生功能，但纖維化狀態(tài)下的肺臟/肝臟器官再生能力會受損[51-52]。實質(zhì)干細胞移植到纖維化器官可能會有助于恢復(fù)其再生能力，但研究表明干細胞植入后的再生能力受到纖維化微環(huán)境的抑制[53-54]。纖維化器官中活化的血管內(nèi)皮細胞和血管周圍成纖維細胞參與了纖維化微環(huán)境的調(diào)控。Cao等[55]發(fā)現(xiàn)正常損傷修復(fù)過程中的血管內(nèi)皮細胞表達的肝細胞生長因子(HGF)可防止肺臟和肝臟損傷后血管周圍成纖維細胞中NADPH氧化酶4(NOX4)的異常激活，從而促進再生過程，表明在纖維化器官中誘導(dǎo)活化血管內(nèi)皮細胞表達HGF和抑制血管成纖維細胞表達NOX4可促進實質(zhì)干細胞發(fā)揮再生能力。因此，靶向纖維化器官中活化的血管內(nèi)皮細胞可能使微環(huán)境由抑制再生轉(zhuǎn)變?yōu)檎T導(dǎo)再生，從而促進實質(zhì)干細胞的定植并發(fā)揮其干性修復(fù)作用，進而緩解纖維化。

三、總結(jié)

盡管目前對纖維化的發(fā)病機制已有一定程度的認知，但現(xiàn)有治療方法仍無法滿足臨床需求，因此更全面地了解纖維化發(fā)病機制可促進有效治療策略的開發(fā)。迄今為止，抗纖維化的治療靶標主要針對促纖維化核心效應(yīng)細胞(如肌成纖維細胞)及核心調(diào)控通路(如TGF-β信號通路)。本文主要總結(jié)內(nèi)皮細胞介導(dǎo)纖維化進展的多個關(guān)鍵機制，包括EndoMT、促炎作用、外泌體、血管稀疏、衰老表型及上皮再生微環(huán)境等，以期為纖維化有效治療手段的研發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。