葉立果，綦仰之，陳謙學，田道鋒

武漢大學人民醫(yī)院神經(jīng)外科，湖北武漢 430060

腦膠質瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)腫瘤，患者的中位生存期主要取決于腫瘤的組織學分級[1]。目前，手術切除仍是膠質瘤的主要治療手段，此外，放療聯(lián)合替莫唑胺化療為一線輔助治療策略，可將患者的生存時間延長2.5個月[2]，但患者獲得性耐藥和放化療抵抗的風險較高[3]。隨著分子生物學技術的發(fā)展，免疫治療已成為膠質瘤治療的一個快速發(fā)展的領域[4-5]，尤其是針對細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA4)、程序性死亡受體1(programmed cell death 1，PD-1)和細胞程序性死亡配體1(programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1)的免疫檢查點阻斷療法的成功，使腫瘤免疫治療取得了突破性進展[6-8]。作為腫瘤免疫治療的重要組成部分，治療性腫瘤疫苗被證實對多種實體癌有效，并引起了廣泛關注[9]。2015年Kübler等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，CV9103(一種mRNA腫瘤疫苗)可在大部分前列腺癌患者中保持良好的免疫原性和耐受性，增強患者的免疫應答，最終延長患者的總生存時間；2016年Hong等[11]發(fā)現(xiàn)，RNActive?疫苗CV9201可提高或延長部分非小細胞肺癌患者的特異性免疫應答率及生存時間。以上研究結果表明，采用mRNA腫瘤疫苗治療實體癌是一種可行且具有巨大潛力的治療策略。本文對新抗原mRNA腫瘤疫苗在腦膠質瘤治療中的研究進展進行綜述。

1 新抗原

在腫瘤癌變的過程中，遺傳不穩(wěn)定性引起的基因突變通常發(fā)生在非編碼區(qū)和編碼區(qū)，其中編碼區(qū)DNA的變化包括非同義突變或單核苷酸變異[12]、突變框架(插入/刪除)[13]、基因融合[14]、改變氨基酸序列的翻譯后修飾[15]及內含子保留[16]等，這些DNA變化引起的氨基酸序列改變可產(chǎn)生正常細胞中沒有的短肽(2～20個氨基酸殘基)，這些短肽被稱為新抗原(neo-antigen)。其中一些短肽被運送到內質網(wǎng)，裝載到主要組織相容性復合體Ⅰ(major histocompatibility complex class Ⅰ，MHC-Ⅰ)上[17]，這些載有多肽的MHC-Ⅰ分子通過高爾基體進入細胞膜，從而引起抗原呈現(xiàn)，并被CD8+T細胞上的受體識別，細胞毒性T細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)因此被激活并發(fā)揮腫瘤殺傷作用[18-21]。

腫瘤免疫治療通過刺激和加強人體的抗腫瘤免疫反應來消滅癌細胞[22]。腫瘤相關抗原(tumorassociated antigen，TAA)[23]是一種由未突變基因表達的蛋白質，在腫瘤細胞中顯著高表達，但在正常細胞中卻很少表達[24]，免疫細胞可識別這些過表達的蛋白，并激活免疫系統(tǒng)，從而起到殺傷腫瘤細胞的作用。但由于TAA是正常的宿主蛋白，同時受到中樞和外周免疫耐受機制的影響[18]，靶向TAA也可能導致自身免疫毒性[25]。相反，新抗原是腫瘤特異性抗原，包括整合到基因組中的腫瘤病毒產(chǎn)生的抗原和突變蛋白產(chǎn)生的抗原，這些抗原只在腫瘤細胞中大量表達，而不在正常細胞中表達，具有很強的免疫原性和異質性，且不受中樞耐受的影響[14,26]。此外，靶向新抗原不易誘導自身免疫[25]。因此，新抗原是治療性腫瘤疫苗和基于T細胞的免疫治療的理想靶點。利用新抗原的免疫活性，根據(jù)腫瘤細胞的突變情況可設計合成新抗原藥物，激活免疫系統(tǒng)，從而達到抗腫瘤的目的。

異檸檬酸脫氫酶1型(isocitrate dehydrogenase type 1，IDH1)是膠質瘤中的特異性分子標志物[27]，彌漫性2級和3級膠質瘤中發(fā)生的最常見的突變?yōu)镽132H型IDH1突變[27-28]。IDH1(R132H)被認為是世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)2級和3級彌漫性星形膠質瘤中潛在的特異性新抗原，可被免疫系統(tǒng)特異性識別，并誘導突變特異性CD4+T輔助細胞-1(CD4+T-helper 1，Th1)反應[29]。Platten等[30]的多中心臨床試驗發(fā)現(xiàn)，接種IDH1(R132H)肽類疫苗可明顯激活WHO 3、4級膠質瘤患者(與對照組比較)的T細胞抗腫瘤反應，最終改善預后。

2 新抗原的識別及預測

新抗原是高度個體特異性的，通常不涉及已知的癌基因[20]。識別新抗原對mRNA腫瘤疫苗的制備至關重要。測序深度、腫瘤組織的質量、測序材料的來源、單核苷酸變異的算法及其他因素都可能影響新抗原的鑒定[31-32]。新抗原識別的第一步通常是使用高通量測序技術對腫瘤細胞和正常細胞的DNA序列進行快速比較。但由于腫瘤細胞的突變比較復雜，包括非編碼突變和無義突變，篩選出能表達突變蛋白的DNA突變序列具有一定的難度[33]。隨著測序技術和生物信息學算法的發(fā)展，新抗原預測及識別的準確性和可靠性有所提高，全外顯子測序技術具有識別效率高、覆蓋面廣、假陰性率低等優(yōu)點[34]，目前大多數(shù)新抗原是通過全外顯子測序技術鑒定的。

突變能否形成新抗原取決于以下因素：(1)突變序列能否轉化為蛋白質；(2)突變蛋白能否加工成肽并被抗原提呈細胞(antigen presenting cell，APC)所識別；(3)突變肽與患者MHC分子的親和力；(4)突變肽-MHC復合物與T細胞受體的親和力[35]。因此，新抗原的預測不僅需要識別可表達的基因組突變，還需要關注患者腫瘤MHC類型相關的分子信息。

3 新抗原mRNA腫瘤疫苗的優(yōu)勢

與普通的預防性疫苗不同，腫瘤疫苗是用于惡性腫瘤患者并輔以適當?shù)淖魟约せ罨颊叩淖陨砻庖叻磻⑺滥[瘤細胞[36]。腫瘤細胞的基因突變改變了蛋白質的氨基酸序列，這些氨基酸序列隨后被翻譯并加工成為新抗原(一種短肽)。作為非自身抗原，新抗原接觸到MHC分子，隨后觸發(fā)機體的抗腫瘤免疫反應[20]。腫瘤疫苗的治療效果通常取決于腫瘤細胞與正常細胞之間靶抗原表達的差異。新抗原作為外源抗原，不僅能增強抗腫瘤免疫反應，而且能降低自身免疫的風險[37]。Schumacher等[29]觀察到，IDH1單等位基因點突變的積累在彌漫性星形細胞瘤的發(fā)展過程中是一個早期和決定性的事件，可導致致癌代謝物2-羥基戊二酸的產(chǎn)生，使細胞內遺傳不穩(wěn)定性增加，基因組高甲基化，以及蛋白突變，最終引起細胞惡性轉化。該研究將IDH1突變產(chǎn)生的短肽作為新抗原用于小鼠腫瘤疫苗接種，觸發(fā)了小鼠體內有效的MHC-Ⅱ型抗腫瘤免疫應答反應[29]。

由于測序技術的快速發(fā)展和生物信息學算法的不斷優(yōu)化，目前研究者能夠準確地識別新抗原，并預測其MHC親和力及免疫原性，從而開發(fā)出個體化的治療策略。目前，研究者設計了多種形式的腫瘤疫苗，包括腫瘤細胞疫苗[38]、長肽疫苗或蛋白疫苗[39-40]、基因組疫苗(以mRNA或DNA為主)[41]和樹突狀細胞疫苗[42]等。與其他類型疫苗相比，mRNA腫瘤疫苗應用于臨床治療具有明顯優(yōu)勢：(1)mRNA序列很容易修改，以編碼需要的蛋白質[43]；(2)傳統(tǒng)的肽疫苗需要對腫瘤進行全基因組分析，成本較高，而mRNA疫苗則不需要[44]；(3)為了確保安全性，mRNA的半衰期可通過RNA序列修飾或傳遞系統(tǒng)進行調節(jié)[45]；(4)mRNA可防止基因缺失和插入突變，DNA類型的抗原經(jīng)常發(fā)生不相關序列排除和基因整合，而mRNA抗原不存在這樣的風險[46]；(5)mRNA疫苗的佐劑特性可提高其體內免疫原性，誘導強烈和持久的免疫反應[47]。已有研究證實了mRNA腫瘤疫苗在臨床試驗中的有效性[10-11]。

4 新抗原mRNA腫瘤疫苗應用面臨的挑戰(zhàn)

Sahin等[48]對13例Ⅲ/Ⅳ期黑色素瘤患者進行新抗原mRNA疫苗臨床試驗發(fā)現(xiàn)，8例(治療前影像學排除腫瘤存在)在腫瘤疫苗接種12～23個月的隨訪期間沒有復發(fā)；5例在接受治療時已發(fā)生腫瘤轉移，其中2例在治療后產(chǎn)生了客觀存在的免疫反應，3例接受新抗原mRNA腫瘤疫苗聯(lián)合PD-1阻斷劑治療后產(chǎn)生了明顯的免疫反應。免疫監(jiān)測顯示，所有患者都對疫苗中包含的新抗原及表位產(chǎn)生了T細胞相關反應。最近，Ali等[49]用編碼新抗原的mRNA轉染單核細胞來源的樹突狀細胞，以刺激健康供體的自體幼稚CD8+T細胞，該程序可使T細胞的激活不受腫瘤宿主免疫抑制環(huán)境的影響，結果顯示，聯(lián)合腫瘤疫苗和免疫檢查點抑制治療較單一治療更有效[50-51]。Curran等[52]對黑色素細胞瘤小鼠模型進行研究發(fā)現(xiàn)，新抗原疫苗結合PD-1和CTLA-4阻斷治療能有效延長小鼠的生存期，并增加小鼠腫瘤微環(huán)境中效應T細胞與調節(jié)T細胞的比例。在Ott等[53]的臨床研究中，6例接受手術切除的黑色素瘤患者注射了新抗原mRNA疫苗，其中2例治療效果較差，但通過聯(lián)合抗PD-1治療獲得了完全的抗腫瘤免疫應答。此外，新抗原疫苗與適應性T細胞療法的組合在其他腫瘤的免疫治療中也已取得成功[54]。

截至目前，免疫療法對神經(jīng)膠質瘤(特別是膠質母細胞瘤)的治療效果十分有限，有研究認為這可能是由于部分膠質瘤中新抗原數(shù)量不足導致的[55]。在部分膠質瘤進展過程中，可能存在的少量新抗原是否真正被免疫系統(tǒng)識別尚不明確。Nejo等[56]對25例不同WHO分級的膠質瘤組織樣本進行外顯子及轉錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)膠質瘤組織中新抗原數(shù)目和表達水平、腫瘤突變負荷及免疫學特征隨時間而發(fā)生變化，表明由于免疫監(jiān)視的存在，新抗原的數(shù)量和表達均會隨著時間的推移而減少，而新抗原表達減少有助于腫瘤細胞的免疫逃逸。

腫瘤細胞的免疫逃逸是阻礙腫瘤疫苗有效應用的關鍵。Tran等[57]的研究發(fā)現(xiàn)，人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)位點雜合性的缺失可影響靶向新抗原或過繼性T細胞治療的腫瘤疫苗的臨床應答。除了抗原丟失外，腫瘤細胞還具有多種復雜的免疫逃逸機制，如PD-1和CTLA-4等免疫檢查點相關的腫瘤逃逸機制，腫瘤微環(huán)境中各種細胞的免疫抑制作用[58]，以及腫瘤細胞壞死后釋放的離子或蛋白等影響T細胞對新抗原的識別和激活[59]等。另外，腫瘤細胞本身固有的特性，如突變景觀、干擾素信號通路的功能、抗原呈遞分子的表達及免疫逃避致癌信號通路等均可影響T細胞在腫瘤微環(huán)境中的啟動、激活和招募[60]，最終影響免疫治療的效果。

免疫抑制微環(huán)境是膠質瘤的重要特征[61-62]，骨髓源性抑制細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSCs)和調節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Tregs)可特異性抑制效應T細胞的活性及功能[63]。因此，膠質瘤的免疫抑制特性很可能會抑制患者免疫系統(tǒng)介導的抗腫瘤反應，并影響腫瘤疫苗的治療效果，尤其是膠質母細胞瘤。膠質母細胞瘤是具有高度固有和適應性免疫抵抗的高級別膠質瘤，研究發(fā)現(xiàn)，在特異性表達表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的膠質母細胞瘤患者中，對免疫治療有反應者不到10%[55]，且由于膠質母細胞瘤微環(huán)境中存在較強的獲得性免疫抵抗，導致免疫治療產(chǎn)生的反應極為短暫，對治療效果無法產(chǎn)生實質性的影響[64]。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)由于其獨特的免疫微環(huán)境，在基線水平，大腦處于免疫性靜止的狀態(tài)，另外，由于血腦屏障的存在，大多數(shù)外周免疫細胞無法穿透血腦屏障進入大腦[65]。然而，當檢測到危險信號時，在干擾素誘導的趨化因子的幫助下，外周免疫細胞容易通過血腦屏障，引起強烈的炎癥反應，這可能為腦腫瘤的免疫治療提供了必要的條件[66]。

神經(jīng)膠質瘤的個體異質性很強[67]，每個腫瘤產(chǎn)生的新抗原幾乎只對同一腫瘤具有特異性，患者之間沒有共享，不同個體產(chǎn)生同一新抗原的概率極低[21]，必須根據(jù)某一類型的膠質瘤尋找新抗原。因此，腫瘤類型和個體之間的巨大差異可能會限制針對突變新抗原的mRNA腫瘤疫苗的應用。Hilf等[68]為15例HLA-A* 02:01或HLA-A* 24:02陽性的非復發(fā)膠質母細胞瘤患者制備并接種了兩種高度個性化的疫苗，結果顯示，疫苗均激活了患者體內的特異性T細胞，這些T細胞從外周血液遷移到大腦，改變了膠質母細胞瘤的免疫微環(huán)境，并且患者的中位總生存期延長至29.0個月。因此，新抗原腫瘤疫苗的制備必須強調個體特異性才能達到較可觀的治療效果。

膠質瘤微環(huán)境中內在的免疫抵抗阻止了免疫治療反應的產(chǎn)生，適應性抵抗阻止了腫瘤浸潤免疫細胞的抗腫瘤活動，獲得性抵抗能夠保護腫瘤細胞在免疫系統(tǒng)的攻擊下不被消除。這些免疫抵抗機制均嚴重影響新抗原mRNA腫瘤疫苗的治療效果。因此，開發(fā)同時針對這些機制的治療策略非常必要。聯(lián)合免疫檢查點抑制劑(如抗PD-1、PD-L1及CTLA-4)，在干擾素的介導下協(xié)助外周免疫細胞進入神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮免疫效應，是提高新抗原mRNA腫瘤疫苗治療效果的重要策略。另外，借助生物信息學或者機器學習算法，通過對不同類型及不同WHO分級的膠質瘤組織多組學數(shù)據(jù)進行聚類分析，從而識別出不同亞型的免疫微環(huán)境特征，以制定個性化的免疫治療方案非常關鍵。此外，雖然目前的測序技術已經(jīng)取得了長足的進步[33]，但新抗原的識別及驗證仍然是耗時和昂貴的，從組織樣本到制備疫苗的過程通常需要3～5個月[48]，嚴重限制了新抗原疫苗的臨床應用。實體腫瘤中新抗原的鑒定對腫瘤組織樣本量的需求較大，新抗原的預測算法工作量繁多，除了預測不同MHC分子與新抗原的結合外，還需要預測基因融合、插入和其他變化所產(chǎn)生的潛在新抗原[20]。這都需要耗費大量的時間和費用，可能是新抗原mRNA腫瘤疫苗在未來臨床應用中面臨的重要挑戰(zhàn)。

5 總結與展望

新抗原對個體具有高度特異性，靶向新抗原的mRNA腫瘤疫苗可在不殺死正常細胞的情況下有效地誘導患者體內腫瘤特異性T細胞發(fā)揮抗腫瘤效應，從而實現(xiàn)個體化的精準治療。作為一種新興的抗腫瘤免疫治療方法，新抗原疫苗在多項試驗中取得了預期的治療效果，在一定程度上延長了患者的生存期，且在多種類型的膠質瘤及其他腫瘤中顯示出較高的安全性和誘導能力。然而，由于膠質瘤的抑制性免疫微環(huán)境特征、免疫逃逸機制及不同的免疫抵抗機制，新抗原mRNA腫瘤疫苗在誘導特異性T細胞活化后可能無法使其繼續(xù)發(fā)揮預期的腫瘤殺傷作用，這是其應用于腦膠質瘤的主要挑戰(zhàn)。進一步深入了解腫瘤組織的免疫抑制和逃逸機制，有助于制定更有效的免疫治療策略。如何將mRNA新抗原疫苗療法與其他免疫治療策略結合起來，以克服腫瘤免疫逃逸及抵抗機制，提高膠質瘤患者的治療效果，需要不斷進行測試和完善。