反硝化聚磷菌定向富集篩選及代謝特征研究*

李 微 王 賀 侯云鶴 王宇琦 陳一鳴 高 原

(1.沈陽(yáng)建筑大學(xué)市政與環(huán)境工程學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng) 110168;2.沈陽(yáng)后勤集團(tuán)房地產(chǎn)開(kāi)發(fā)有限公司,遼寧 沈陽(yáng) 110117)

盡管對(duì)于反硝化除磷工藝參數(shù)及DPAO的研究已有相關(guān)報(bào)道,但反硝化除磷系統(tǒng)的啟動(dòng)時(shí)效及穩(wěn)定運(yùn)行狀態(tài)、優(yōu)勢(shì)菌群及高效菌種代謝過(guò)程對(duì)推動(dòng)反硝化除磷技術(shù)的應(yīng)用具有決定性影響,仍然是研究熱點(diǎn)[3]。本研究以活性污泥為基質(zhì),通過(guò)A2-序列間歇式活性污泥法(SBR)反硝化除磷脫氮系統(tǒng)(簡(jiǎn)稱(chēng)A2-SBR)富集并篩選高效的DPAO,采用高通量測(cè)序技術(shù)探究DPAO馴化過(guò)程中微生物種群特性及優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)變化,分析菌株生理生化及反硝化除磷性能,利用16S rDNA分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)高效菌種進(jìn)行鑒定,考察反應(yīng)過(guò)程中胞內(nèi)聚合物濃度變化,分析高效菌株代謝特征,以期為反硝化除磷技術(shù)實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)裝置

A2-SBR裝置由雙層有機(jī)玻璃制成,內(nèi)徑14 cm、高85 cm,有效工作容積為12 L,外層與水浴鍋相連,使系統(tǒng)處于最適溫度。裝置底部裝有微孔曝氣盤(pán),連接空氣泵對(duì)活性污泥進(jìn)行曝氣,頂部安裝電動(dòng)攪拌器使污泥處于懸浮狀態(tài)充分進(jìn)行反應(yīng),通過(guò)蠕動(dòng)泵向裝置投加KNO3溶液控制缺氧反應(yīng)條件。整個(gè)系統(tǒng)通過(guò)在線(xiàn)的pH監(jiān)測(cè)儀控制pH,超出設(shè)定pH范圍時(shí)pH監(jiān)測(cè)儀自動(dòng)通過(guò)蠕動(dòng)泵向裝置內(nèi)滴加酸堿緩沖溶液直至pH達(dá)到設(shè)定范圍。

反硝化除磷靜態(tài)試驗(yàn)裝置為有效容積3 L的廣口瓶,通入N2控制厭氧環(huán)境,通過(guò)蠕動(dòng)泵投加30 mg/L KNO3溶液作為電子受體控制缺氧反應(yīng)條件進(jìn)行反硝化除磷靜態(tài)試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)材料

污泥取自遼寧省撫順市某污水處理廠(chǎng)的二沉池,試驗(yàn)用水采用人工配制的模擬生活污水,水質(zhì)情況如下：以CH3COONa作為碳源,控制COD為160～220 mg/L;以KH2PO4作為磷源,控制總磷(TP)為9～12 mg/L;以NH4Cl作為氮源,控制氨氮為5～10 mg/L;添加MgSO4·7H2O、CaCl2及微量元素;用NaHCO3調(diào)節(jié)pH為7.2～7.8。

微量元素：FeCl31.5 g/L、H3BO30.15 g/L、CoCl3·7H2O 0.15 g/L、CuSO4·5H2O 0.03 g/L、MnCl2·4H2O 0.06 g/L、Na2MoO4·4H2O 0.06 g/L、ZnSO4·7H2O 0.12 g/L、KI 0.18 g/L、乙二胺四乙酸10 g/L。

反硝化培養(yǎng)基：Na3C6H5O7·2H2O 5 g/L、KNO31 g/L、KH2PO4·2H2O 1 g/L、K2HPO41 g/L、MgSO4·7H2O 0.20 g/L、瓊脂15 g/L、pH為7.2～7.4。

聚磷培養(yǎng)基：CH3COONa·3H2O 3.68 g/L、Na2HPO4·2H2O 28.73 mg/L、NH4Cl 57.27 mg/L、MgSO4·7H2O 131.82 mg/L、K2SO426.71 mg/L、CaCl2·2H2O 17.2 mg/L、瓊脂15 g/L、微量元素2 mL/L、pH=7.0。

采用A2-SBR穩(wěn)定運(yùn)行階段的反硝化聚磷污泥為種泥。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 A2-SBR的運(yùn)行方案

A2-SBR中,種泥與模擬生活污水混合(混合液懸浮固體質(zhì)量濃度(MLSS)為3 200 mg/L),運(yùn)行期間24 ℃、pH為7.2～7.8、污泥齡(SRT)為15 d。運(yùn)行方案分為3個(gè)階段：(1)第1階段(第1～15天),瞬時(shí)進(jìn)水→厭氧段2 h→好氧段2 h→沉淀30 min→排水30 min,每天運(yùn)行3個(gè)周期,此階段目的在于對(duì)系統(tǒng)中的傳統(tǒng)好氧聚磷菌進(jìn)行富集;(2)第2階段(第16～35天)采用厭氧/缺氧交替的方式運(yùn)行,在缺氧段投加35 mg/L KNO3溶液作為電子受體進(jìn)行DPAO的富集,運(yùn)行模式為瞬時(shí)進(jìn)水→厭氧段2 h→缺氧段2 h→沉淀30 min→排水30 min,每天運(yùn)行3個(gè)周期;(3)第3階段(第36～50天)與第2階段運(yùn)行模式相同,進(jìn)一步確保DPAO的優(yōu)勢(shì)菌地位,實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)高效的運(yùn)行穩(wěn)定性。

每天取進(jìn)水、厭氧出水、好氧/缺氧出水的3個(gè)平行樣,監(jiān)測(cè)COD、TP、硝酸鹽氮。

1.3.2 污泥染色試驗(yàn)

于穩(wěn)定運(yùn)行的A2-SBR厭氧、缺氧段取污泥樣品,分別進(jìn)行PHB、poly-P顆粒染色,步驟參照文獻(xiàn)[4],考察厭氧結(jié)束后PHB積累和缺氧結(jié)束后poly-P積累的情況。

1.3.3 菌株的分離、篩選與鑒定

利用反硝化、聚磷培養(yǎng)基,采用稀釋涂布法和平板劃線(xiàn)分離法對(duì)DPAO進(jìn)行初步分離和純化[5]。再對(duì)分離出來(lái)的純菌株進(jìn)行釋磷吸磷試驗(yàn),通過(guò)硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)篩選得到具有高效反硝化除磷脫氮功能的菌株。

對(duì)上述菌株進(jìn)行革蘭氏染色后在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察其形態(tài)及顏色。進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行生理生化特性試驗(yàn),包括接觸酶、氧化酶、葡萄糖氧化發(fā)酵、糖醇發(fā)酵、甲基紅、V-P、硝酸鹽還原、檸檬酸鹽利用、明膠液化、吲哚試驗(yàn)。

使用TaKaRa試劑盒將菌株的基因組脫氧核糖核酸(DNA)純化并提取,然后以總DNA為模板利用引物27F和1492R進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增。PCR采用50 μL反應(yīng)體系,反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s;55 ℃退火30 s;72 ℃延伸30 s,30個(gè)循環(huán);72 ℃補(bǔ)充延伸5 min;4 ℃終止保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢驗(yàn)后進(jìn)行16S rDNA測(cè)序。所得測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST序列的同源性比較,然后構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[6]。

1.3.4 反硝化除磷脫氮代謝特征試驗(yàn)

在無(wú)菌條件下將菌株活化并富集,將富集好的菌液離心(4 000 r/min,10 min)后,去除上清液,用無(wú)菌蒸餾水洗滌后再離心,重復(fù)清洗操作3次。將菌液投入反硝化除磷靜態(tài)試驗(yàn)裝置(反應(yīng)液為模擬生活污水),控制反應(yīng)液的600 nm處吸光度為0.3。運(yùn)行方案與第2階段相同,在厭氧段向裝置中通入N2控制厭氧條件使釋磷反應(yīng)充分進(jìn)行,在缺氧段投入一定量的KNO3溶液作為電子受體進(jìn)行反硝化除磷脫氮反應(yīng),定時(shí)取樣測(cè)定上清液中COD、硝酸鹽氮、TP、PHB、poly-P及糖原的濃度變化。

1.4 檢測(cè)方法

PHB采用氣相色譜法測(cè)量,將20 mL菌液冷凍干燥后倒入試管中,分別加入1 mg苯甲酸、1.5 mL鹽酸正丙醇溶液(25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))鹽酸)、1.5 mL氯仿,于100 ℃沸水浴中進(jìn)行酯化反應(yīng)2 h,待樣品冷卻后加入無(wú)菌蒸餾水至5 mL后離心,取有機(jī)相下層溶液進(jìn)行氣相色譜分析[7]。COD采用快速密閉催化消解法測(cè)定;TP采用鉬銻抗分光光度法測(cè)定;硝酸鹽氮采用紫外分光光度法測(cè)定;糖原采用硫酸-蒽酮法測(cè)定;poly-P采用過(guò)硫酸鉀-鉬銻抗分光光度法測(cè)定;MLSS采用濾紙稱(chēng)重法測(cè)定[8]。pH采用PHS-25型pH計(jì)檢測(cè)。

高通量測(cè)序：取不同階段的活性污泥反復(fù)清洗離心3次后置于-80 ℃中保存。采用十六烷基三甲基溴化銨法提取樣本基因組,利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度。取出適量的樣本DNA放入離心管中,利用無(wú)菌蒸餾水將樣本DNA稀釋至1 ng/μL,以稀釋后的基因組DNA為模板,采用引物341F與806R對(duì)16S rDNA V3～V4區(qū)序列進(jìn)行擴(kuò)增,用New England Biolabs公司的Phusion8 High-Fideity PCR MaterMix with GC Buffer和高效高保真酶進(jìn)行PCR,確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè),得到PCR擴(kuò)增凝膠電泳圖。使用TuSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫(kù)試劑盒構(gòu)建文庫(kù),經(jīng)過(guò)Qubit和定量PCR,待構(gòu)建好的文庫(kù)合格后使用NovaSeq 6000進(jìn)行上機(jī)測(cè)序[9]。

2 結(jié)果與討論

2.1 DPAO定向富集及系統(tǒng)運(yùn)行

系統(tǒng)中污泥馴化及穩(wěn)定運(yùn)行階段COD去除效果見(jiàn)圖1(a)。1～15 d系統(tǒng)進(jìn)行厭氧/好氧反應(yīng),污泥馴化1～3 d,進(jìn)水COD平均為217.94 mg/L,厭氧、缺氧出水COD平均為97.09、62.70 mg/L;系統(tǒng)馴化第8～11天,厭氧出水COD平均為66.41 mg/L,進(jìn)水中碳源量遠(yuǎn)超出聚磷菌新陳代謝所需的碳源量,厭氧結(jié)束剩余外碳源進(jìn)入好氧段會(huì)被其他異養(yǎng)菌消耗,COD去除效果不會(huì)受到影響,COD去除率曲線(xiàn)仍然呈上升趨勢(shì);第12天后,降低進(jìn)水外碳源量,進(jìn)水COD平均為180.06 mg/L,厭氧反應(yīng)結(jié)束剩余外碳源含量降低,有利于聚磷菌缺氧反硝化吸磷反應(yīng),COD去除效果逐漸穩(wěn)定,反應(yīng)結(jié)束好氧出水COD平均為22.27 mg/L,COD平均去除率為87.75%。第16～35天的厭氧/缺氧反應(yīng),COD去除率無(wú)明顯波動(dòng),COD平均去除率為87.47%。隨后系統(tǒng)繼續(xù)在厭氧/缺氧條件下穩(wěn)定運(yùn)行至第50天,COD平均去除率為89.16%。由此可見(jiàn),系統(tǒng)不同運(yùn)行模式對(duì)COD去除無(wú)明顯影響,活性污泥的生物降解性能良好。

圖1 COD、TP和硝酸鹽氮去除效果Fig.1 Removal of COD,TP and nitrate nitrogen

在厭氧/好氧條件下對(duì)系統(tǒng)中污泥進(jìn)行活化使其具有高效的好氧除磷能力,為后續(xù)DPAO富集做好準(zhǔn)備。污泥馴化及系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行過(guò)程中TP的變化見(jiàn)圖1(b)。污泥馴化初期,磷的去除效果并不明顯,富集第2天由于自動(dòng)控制系統(tǒng)(PLC)故障,厭氧段電動(dòng)攪拌器沒(méi)有啟動(dòng),泥水混合不夠均勻,導(dǎo)致聚磷菌厭氧釋磷反應(yīng)不充分,釋磷量最低僅為4.77 mg/L,自PLC調(diào)整后污泥釋磷效果有一定增強(qiáng),TP去除率先逐漸上升后又趨于平緩,這與進(jìn)水中碳源量遠(yuǎn)超出聚磷菌新陳代謝所需的碳源量,厭氧結(jié)束剩余外碳源進(jìn)入缺氧段也會(huì)被其他異養(yǎng)菌所利用,進(jìn)而影響到聚磷菌優(yōu)勢(shì)菌群地位的研究結(jié)果相一致;富集進(jìn)行到第12～15天,厭氧釋磷量和缺氧吸磷量均有明顯提高,TP去除率呈階梯狀上升且除磷效果穩(wěn)定,系統(tǒng)內(nèi)最大釋磷量達(dá)到29.74 mg/L,吸磷率由44.92%提高至97.09%,好氧出水TP平均為0.33 mg/L,達(dá)到《城鎮(zhèn)污水處理廠(chǎng)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB 18918-2002)一級(jí)A標(biāo)準(zhǔn)(≤0.5 mg/L),此時(shí)系統(tǒng)具有穩(wěn)定除磷效果,聚磷菌已成為系統(tǒng)內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌種。在1～15 d污泥馴化過(guò)程中,污泥絮體量增加且顏色呈黃褐色,此時(shí)認(rèn)定傳統(tǒng)聚磷菌富集成功,可進(jìn)行DPAO富集階段。第16天開(kāi)始厭氧/缺氧模式,由于高濃度硝酸鹽溶液的沖擊,TP去除率驟然降低至62.05%。第16～22天系統(tǒng)TP去除率略微上升,平均去除率為64.38%。

缺氧出水硝酸鹽氮變化趨勢(shì)與TP不一致,16～19 d硝酸鹽氮去除率相對(duì)較低,20～22 d明顯提升(見(jiàn)圖1(c)),分析認(rèn)為：厭氧/缺氧反應(yīng)開(kāi)始時(shí)系統(tǒng)中DPAO數(shù)量較少,仍然有常規(guī)反硝化菌利用硝酸鹽氮進(jìn)行反硝化反應(yīng)。隨著系統(tǒng)連續(xù)運(yùn)行,污泥慢慢適應(yīng)高濃度硝酸鹽氮,23～50 d脫氮除磷效果先持續(xù)提高后長(zhǎng)期保持穩(wěn)定狀態(tài),第23天缺氧出水TP和硝酸鹽氮去除率分別穩(wěn)定在95%、91%左右,由此可推測(cè)系統(tǒng)脫氮除磷除活性污泥吸附和同化型氮、磷物質(zhì)吸收轉(zhuǎn)化為細(xì)胞物質(zhì)貢獻(xiàn)少量去除率,主要發(fā)生聚磷菌的反硝化吸磷反應(yīng),可確認(rèn)第23天DPAO富集成功且處理效果穩(wěn)定,A2-SBR啟動(dòng)成功。

PHB和poly-P顆粒染色結(jié)果見(jiàn)圖2。厭氧活性污泥中明顯可見(jiàn)PHB顆粒,PHB在聚磷菌細(xì)胞質(zhì)內(nèi)屬于類(lèi)脂性質(zhì)的碳源類(lèi)貯藏物,PHB好氧分解產(chǎn)生質(zhì)子移動(dòng)力,進(jìn)而吸收磷酸鹽合成poly-P和三磷酸腺苷(ATP)。缺氧段發(fā)生了poly-P積累,證明發(fā)生了缺氧吸磷反應(yīng),進(jìn)一步確定A2-SBR內(nèi)有大量反硝化聚磷菌。

圖2 PHB和poly-P顆粒染色Fig.2 Stained PHB and poly-P particles

2.2 微生物菌群結(jié)構(gòu)分析

為研究污泥馴化及穩(wěn)定運(yùn)行過(guò)程中系統(tǒng)微生物群落的變化,分別在第1、12、42天從系統(tǒng)中取污泥樣品進(jìn)行高通量測(cè)序,樣品編號(hào)分別為S1、S2、S3,利用序列分類(lèi)全局比對(duì)從綱水平對(duì)富集過(guò)程中污泥樣品進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析,闡述污泥馴化過(guò)程中微生物菌群結(jié)構(gòu)。污泥樣品中α-變形菌綱(Proteobacteria)、β-變形菌綱、γ-變形菌綱、σ-變形菌綱和δ-變形菌綱相對(duì)豐度占比較大,其中S3中β-變形菌綱占比最大(相對(duì)豐度為15.34%),γ-變形菌綱相對(duì)豐度由S1中的9.45%升到S3中的15.09%,兩者是反硝化除磷污泥系統(tǒng)中主要菌綱;α-變形菌綱、σ-變形菌綱、δ-變形菌綱相對(duì)豐度分別由S1中8.67%、11.92%、8.86%降低到S3中的3.22%、7.31%、3.87%。JOHWAN等[10]利用變性梯度凝膠電泳技術(shù)分析電子受體對(duì)DPAO菌群結(jié)構(gòu)影響時(shí)發(fā)現(xiàn),以硝酸鹽氮作為電子受體時(shí)DPAO屬于優(yōu)勢(shì)菌種,且這些菌種屬于β-變形菌綱和γ-變形菌綱。ZHANG等[11]在A(yíng)2O系統(tǒng)強(qiáng)化反硝化除磷及菌群結(jié)構(gòu)分析中得到相同的結(jié)論,由此進(jìn)一步證實(shí),本系統(tǒng)中DPAO逐漸被富集成為優(yōu)勢(shì)菌種,而S3中變形菌綱相對(duì)豐度為44.47%并不占絕對(duì)優(yōu)勢(shì),系統(tǒng)缺氧出水TP和硝酸鹽氮去除率均穩(wěn)定在90%左右,由此推測(cè)系統(tǒng)中會(huì)存在其他反硝化除磷菌綱。3個(gè)污泥樣品其他共同主導(dǎo)綱包括嗜熱菌綱(Ignavibacteria)、放線(xiàn)菌綱(Actinobacteria)、厭氧繩菌綱(Anaerolineae)、擬桿菌綱(Bacteroidia)、浮霉菌綱(Planctomycetia)、疣微菌綱(Verrucomicrobiae)、黃桿菌綱(Flavobacteriia)(見(jiàn)圖3)。污水處理膜生物反應(yīng)器厭氧菌群馴化中發(fā)現(xiàn),嗜熱菌綱逐漸成為系統(tǒng)的主要菌綱,其占比由初始不到1%逐漸上升為54%[12]。美國(guó)舊金山一污水處理廠(chǎng)利用微藻生長(zhǎng)離岸薄膜系統(tǒng)培育藻類(lèi),污水中含有高濃度有機(jī)物且其微生物菌綱以纖維黏網(wǎng)菌綱、黃桿菌綱和鞘脂桿菌綱為主。SBR菌群結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn),溶解氧較低的厭氧層中具有反硝化功能的厭氧繩菌綱和擬桿菌綱的比例逐漸提高[13]。

圖3 綱水平相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundance at class level

2.3 菌株篩選與鑒定

2.3.1 菌株篩選與形態(tài)特征

于穩(wěn)定運(yùn)行的A2-SBR污泥中分離得到20株菌株,通過(guò)脫氮除磷率試驗(yàn)、硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)優(yōu)選出一株兼具反硝化和除磷功能的高效菌株P(guān)D1。PD1的TP和硝酸鹽氮的去除率分別達(dá)到91.24%和92.83%,且硝酸鹽還原產(chǎn)氣結(jié)果為陽(yáng)性,可見(jiàn)PD1具有明顯的反硝化除磷脫氮能力。培養(yǎng)48 h后觀(guān)察單個(gè)菌落，PD1為橘紅色、不透明,表面濕潤(rùn)光滑微凸,質(zhì)地較軟,光學(xué)顯微鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn)PD1為革蘭氏陽(yáng)性菌,短桿狀,常呈“V”字形生長(zhǎng),無(wú)芽孢,無(wú)鞭毛,無(wú)運(yùn)動(dòng)性。生理生化特性研究結(jié)果顯示：葡萄糖氧化發(fā)酵結(jié)果為發(fā)酵型,硝酸鹽還原及亞硝酸鹽還原均為陽(yáng)性,即PD1能在缺氧條件下以硝酸鹽或亞硝酸鹽為電子受體,將其還原為N2,從而表現(xiàn)出反硝化功能;檸檬酸鈉利用為陽(yáng)性,表明PD1可利用檸檬酸鹽等有機(jī)化合物作為碳源;甲基紅、糖醇發(fā)酵、接觸酶、吲哚試驗(yàn)均為陽(yáng)性;V-P測(cè)定、氧化酶試驗(yàn)、明膠液化均為陰性。

2.3.2 菌株鑒定及發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

以PD1總DNA基因組為模板PCR擴(kuò)增獲得一段1 349 bp的16S rDNA基因序列,將PD1的16S rDNA基因序列提交到GenBank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov),得到GenBank登錄號(hào)KC905040。利用BIOEDIT和MEGA軟件,以鄰接法繪制16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。PD1與多株副球菌屬(Paracoccussp.)同源性均達(dá)到95%(見(jiàn)圖4),結(jié)合形態(tài)特征及生理生化特性,可將PD1最終鑒定為副球菌屬。DPAO多為氣單胞菌屬(Aeromonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)及假單胞菌屬(Pseudomonas)[14],而副球菌屬多用于處理石油廢水[15],本研究首次發(fā)現(xiàn)具有反硝化聚磷功能的副球菌屬。

圖4 菌株發(fā)育樹(shù)Fig.4 Species phylogenetic tree

2.4 PD1在厭氧/缺氧條件下的代謝特征

2.4.1 PD1厭氧代謝特征

PD1厭氧/缺氧反應(yīng)中基質(zhì)變化曲線(xiàn)見(jiàn)圖5。厭氧混合液中COD降低108.24 mg/L,TP上升了18.01 mg/L,poly-P降低了82.13 mg/L,厭氧釋磷效果明顯。PHB上升了81.85 mg/L,由PHB的氧化反應(yīng)可計(jì)算出PHB與COD的換算比為1.674,即以COD計(jì)PHB變化量(ΔPHB)為137.01 mg/L;糖原下降了45.19 mg/L,由糖原的氧化反應(yīng)式可知糖原與COD的換算比為1.067,即以COD計(jì)糖原變化量(Δ糖原)為48.22 mg/L,此時(shí)Δ糖原/ΔPHB=0.352,表明35.2%的PHB是由糖原生成,因此將有88.79 mg/L PHB是由外碳源轉(zhuǎn)化(即ΔCOD有效),說(shuō)明有82%外碳源轉(zhuǎn)化為PHB貯存于細(xì)胞體內(nèi),而其余18%的外碳源用以維持細(xì)胞在厭氧段的基本代謝。這與文獻(xiàn)[16]的DPAO在厭氧條件下通過(guò)糖原酵解和胞內(nèi)poly-P水解獲取ATP并合成PHB儲(chǔ)存于體內(nèi)的代謝模式相同。厭氧120 min,TP變化量(ΔP)/ΔCOD有效=0.202,即每1 mg COD轉(zhuǎn)化為PHB時(shí)釋放0.202 mg磷,表現(xiàn)出較好的釋磷特性,這與王亞宜等[17]在研究碳源濃度對(duì)反硝化聚磷影響時(shí)的結(jié)果相似。在研究厭氧釋磷時(shí),COD的有效轉(zhuǎn)化量既影響磷的釋放又影響PHB的合成,而PHB的合成繼而影響后續(xù)缺氧反硝化除磷效果,因此需重點(diǎn)跟蹤ΔP/ΔCOD有效來(lái)判斷反硝化除磷效果。

圖5 PD1厭氧/缺氧反應(yīng)中基質(zhì)變化曲線(xiàn)Fig.5 Matrix change curve in anaerobic/anoxic reaction of PD1

2.4.2 PD1缺氧代謝特征

缺氧150 min(即270 min),TP下降了25.59 mg/L,poly-P升高了89.39 mg/L,磷的去除率為92.64%。PHB降低了85.68 mg/L(即ΔPHB=143.43 mg/L),硝酸鹽氮降低了27.84 mg/L,COD僅下降了19.86 mg/L,說(shuō)明缺氧段硝酸鹽氮的去除并非消耗外碳源而是消耗細(xì)菌胞內(nèi)PHB完成的。因此,DPAO在缺氧反硝化吸磷過(guò)程中對(duì)硝酸鹽氮的去除效果應(yīng)由硝酸鹽氮變化量(ΔN)/ΔPHB表征,而不是ΔN/COD變化量(ΔCOD)。并且缺氧反應(yīng)中糖原相比厭氧結(jié)束后增加了51.32 mg/L(即Δ糖原=54.76 mg/L),此時(shí)Δ糖原/ΔPHB=0.382,有88.67 mg/L糖原是由PHB轉(zhuǎn)化(即ΔPHB有效)。缺氧吸磷反應(yīng)過(guò)程中能提供電子供體的有效碳源為內(nèi)碳源PHB,反應(yīng)過(guò)程中PHB分解產(chǎn)生的ATP用于合成糖原及poly-P[18],所以研究反硝化聚磷效果時(shí)可用ΔP/ΔPHB有效考察缺氧吸磷效果。缺氧吸磷結(jié)果表明：缺氧段ΔP/ΔPHB有效(0.289,即每分解1 mg PHB時(shí)吸收0.289 mg磷)>厭氧段ΔP/ΔCOD有效(0.202),表明PD1可吸收過(guò)量磷以達(dá)到除磷的目的。

3 結(jié) 論

(1) 23 d A2-SBR啟動(dòng)成功,缺氧出水TP和硝酸鹽氮去除率分別穩(wěn)定在95%、91%左右和β-變形菌綱和γ-變形菌綱占主導(dǎo)地位。

(2) PD1與多株副球菌屬同源性均達(dá)到95%,結(jié)合形態(tài)特征及生理生化特性,可將PD1最終鑒定為副球菌屬。

(3) 在厭氧段PD1將每1 mg COD轉(zhuǎn)化為PHB時(shí)釋放0.202 mg磷,poly-P水解獲取ATP并合成PHB;在缺氧段每分解1 mg PHB時(shí)將吸收0.289 mg磷,分解PHB產(chǎn)生的ATP用于合成糖原及poly-P。