李嘉林，陳少明，黃銘鋒，劉永強，梁文康，孫傳濤

(廣州市番禺區(qū)中醫(yī)院，廣東 廣州 511400)

附睪炎是男性生殖系統(tǒng)非特異性感染的常見病，見于各年齡段的男性，但多為20～40歲的青壯年，占所有患者的70%[1-2]。分為急性附睪炎和慢性附睪炎兩種類型，又以慢性型更為常見。主要臨床表現(xiàn)為腹下腹股溝指征痛、陰囊腫大、站立或行走時疼痛加重等[3]。此外，體格檢查可發(fā)現(xiàn)結(jié)節(jié)、腫塊或變硬，伴有輕度或中度壓痛，病理方面也可發(fā)現(xiàn)輸精管擴張[4]。附睪炎病因復雜多樣，但發(fā)病機制不同，通常被認為是繼發(fā)于前列腺炎或尿路感染，該病可嚴重影響患者的心理健康和生活質(zhì)量[5]。同時，由于附睪內(nèi)不同程度的炎癥反應，還可能減少精子的產(chǎn)生和發(fā)育，導致精子畸形明顯增加[6]。目前，對附睪炎的確切治療還沒有定論，抗生素和抗炎藥仍是主要治療方法[7]。但對于復發(fā)性慢性附睪炎，由于結(jié)節(jié)的易感性，藥物不易起效[8-9]。

近年來，中醫(yī)藥在臨床試驗中得到了廣泛應用。研究表明，中藥在減輕附睪慢性疼痛、減輕陰囊腫脹、抗組織纖維化等方面具有明顯的療效。中藥中的一些特殊成分可以達到預期的外周鎮(zhèn)痛效果，主要是通過調(diào)節(jié)機體功能，促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)源性阿片肽的產(chǎn)生等[10]。此外，還可以通過增加炎性組織和血清中β-EP的水平發(fā)揮抗炎作用[11]。

金鈴子散首見于劉完素《素問病機氣宜保命集》，由川楝子和延胡索兩味藥物組成，方中川楝子行氣解郁、苦寒泄熱，為君藥；延胡索活血化瘀、辛溫散行，為臣藥。行氣以帥血，氣行則血活，二藥相配，共奏行氣活血、瀉熱止痛之效，是治療肝郁化火而致的胸脅、腹脘、疝氣痛、痛經(jīng)等痛癥的代表方劑[12-13]?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，金鈴子散水煎液具有明顯的鎮(zhèn)痛抗炎作用[14]，且復方制劑鎮(zhèn)痛效果優(yōu)于單藥[15],我院在多年臨證治療過程中，常用金鈴子散化裁方治療急慢性附睪炎，臨床效果顯著，但目前對于該方劑治療附睪炎的機理研究相對較少，整體性機制的研究有待提高，給該方劑的臨床推廣帶來了障礙。

網(wǎng)絡藥理學是一種綜合系統(tǒng)方法、計算方法和實驗方法來闡明藥物分子機制的研究方法[17]，可以多組分、多靶點地將藥物成分靶點網(wǎng)絡與生物靶點網(wǎng)絡相結(jié)合，更加系統(tǒng)全面地研究藥物的作用機制。因此，本研究運用網(wǎng)絡藥理學的方法對金鈴子散治療慢性附睪炎的成分及靶點進行歸納整理，通過藥物與疾病靶點的融合，進而篩選出核心靶點，探討其治療疾病的作用機制，為探索中藥方劑金鈴子散治療附睪炎的機制提供新的思路，為中醫(yī)療法治療疾病尋找新的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 金鈴子散活性成分篩選

通過計算系統(tǒng)生物學實驗室平臺(TCMSP)(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，分別檢索川楝子和延胡索的化學成分，其中川楝子33個、延胡索49個。本研究結(jié)合藥代動力學的吸收、分布、代謝、排泄(ADME)，以“口服吸收利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18”作為活性成分的篩選條件，并通過文獻檢索補充篩選條件之外的有效活性成分。

1.2 活性成分靶點預測

基于所篩選的化學成分，通過以下2種方式預測相關(guān)靶點：①通過TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢靶點蛋白名稱；②從PubChem數(shù)據(jù)庫檢索成分相關(guān)Canonical SMILES，從SwissTargetPrediction預測相關(guān)靶點。作為一個在線網(wǎng)絡工具，SwissTargetPrediction基于相似原理，通過反向篩選預測小分子最可能的蛋白質(zhì)靶標。最后通過Uniport數(shù)據(jù)庫將成分所對應的蛋白名稱轉(zhuǎn)化為基因名，限定物種為“human”，從而獲取成分相應靶點。

1.3 附睪炎疾病靶點整理

以附睪炎(Epididymitis)為關(guān)鍵詞，從DisGeNET和GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索疾病相關(guān)的靶點。DisGeNET是一個綜合性的發(fā)現(xiàn)平臺，其包含超過380 000個基因和13 000種疾病之間的關(guān)聯(lián)，旨在解決與人類疾病的遺傳基礎有關(guān)的各種問題。此外，該平臺涵蓋孟德爾和復雜疾病的信息，并包含來自動物疾病模型的數(shù)據(jù)。它的特點是基于支持性證據(jù)的評分，以確定基因與疾病關(guān)聯(lián)的優(yōu)先順序。GeneCards數(shù)據(jù)庫作為一個開放的網(wǎng)絡資源，它提供的信息旨在深入了解有關(guān)基因的現(xiàn)有知識，包括關(guān)注其在健康和疾病中的功能，包括了SWISS-PROT、OMIM、Genatlas和GDB數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)，使用GeneCards數(shù)據(jù)庫可以快速獲取有關(guān)基因集功能的信息。最后將靶點基因?qū)險niProt數(shù)據(jù)庫進行基因標準化后整理歸納。

1.4 潛在作用靶點篩選和蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡分析

應用Cytoscape 3.2.1軟件將成分和疾病靶點進行映射，取其交集部分作為金鈴子散治療附睪炎的潛在治療靶點。為了更好了解這些潛在靶點的治療效果，應用STRING數(shù)據(jù)庫對潛在靶點之間的相互關(guān)系進行研究，獲得蛋白與蛋白之間的相互作用關(guān)系(Protein-protein interaction，PPI)。STRING數(shù)據(jù)庫旨在為盡可能對已知和預測的關(guān)聯(lián)進行評分和整合，形成覆蓋超過1 100個生物體的綜合蛋白質(zhì)網(wǎng)絡。

1.5 網(wǎng)絡構(gòu)建和分析

網(wǎng)絡是各種連接節(jié)點和邊的計算良好的數(shù)學模型。網(wǎng)絡藥理學的一個重要組成部分是網(wǎng)絡分析，主要包括屬性分析、拓撲分析、網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)與穩(wěn)定性分析。網(wǎng)絡分析通常測量模塊、介數(shù)、關(guān)鍵節(jié)點、邊、最短路徑和關(guān)鍵節(jié)點的自由度。本研究中網(wǎng)絡圖均應用Cytoscape 3.2.1軟件，對生物網(wǎng)絡進行可視化探索和分析。并應用Cytoscape構(gòu)建：①中藥-成分-靶點網(wǎng)絡圖；②中藥-成分-交集靶點-疾病網(wǎng)絡圖；③核心靶點PPI網(wǎng)絡圖；④中藥-成分-靶點-通路-疾病網(wǎng)絡圖。此外，利用Cytoscape 3.2.1中“Network Analyzer”功能對網(wǎng)絡進行分析，以獲得自由度(Degree)等網(wǎng)絡拓撲參數(shù)，并分析網(wǎng)絡節(jié)點的重要性。

1.6 潛在靶點功能富集分析與通路分析

為了進一步了解這些核心靶點的功能，通過DAVID數(shù)據(jù)庫對關(guān)鍵靶點進行基因本體論(Gene Ontology，GO)生物學功能富集分析，獲取生物過程(Biological process，BP)、細胞成分(Cellular component，CC)、分子功能(Molecular function，MF)等分析結(jié)果(P<0.05)；同時，也獲得KEGG信號通路(P<0.05)富集分析結(jié)果。基于GO分析和KEGG分析探討“金鈴子散”治療附睪炎的作用機制。

2 結(jié)果

2.1 金鈴子散活性成分篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)平臺，基于“ADME參數(shù)OB≥30%，DL≥0.18”條件初步篩選成分，得到金鈴子散中川楝子9個活性成分、延胡索49個活性成分。其中，共同的活性成分1個。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，川楝子中楝烷型三萜類化合物川楝素具有廣泛的生物學效應，對全身多系統(tǒng)功能具有良好的調(diào)節(jié)作用[16]，因此補充川楝素(toosendanin)作為活性成分。綜上所述，共得到金鈴子散中58個活性成分。見表1。

表1 金鈴子散活性成分信息

續(xù)表1

2.2 活性成分靶點預測

從TCMSP和SwissTargetPrediction預測得到成分相關(guān)靶點357個，其中Nimbolin D和melianone沒有相關(guān)靶點。通過Cytoscape 3.2.1軟件構(gòu)建“活性成分-靶點網(wǎng)絡”(圖1)。此網(wǎng)絡圖包括416個節(jié)點(2個單味藥節(jié)點、57個成分節(jié)點和357個靶點節(jié)點)、1 791條邊。通過網(wǎng)絡藥理學分析，槲皮素(quercetin)、豆甾醇(stigmasterol)和金黃紫堇堿((S)-Scoulerine)具有較高的自由度，自由度越大，參與的生物功能越多，在網(wǎng)絡中的重要性則越強。通過對以上成分的靶點進行分析可以發(fā)現(xiàn)，PTGS2和PTGS1的度值最高，這提示大多成分的靶點主要與炎癥反應相關(guān)，可以廣泛調(diào)控炎癥因子、趨化因子、黏附分子、血管生長因子等。因此，從成分-靶點網(wǎng)絡中可以看出，金鈴子散對附睪炎的治療作用可能主要集中在對炎癥反應的調(diào)控方面。

注:正方形代表成分；圓形代表靶點；菱形代表草藥。

2.3 疾病靶點收集和潛在作用靶點獲取

從DisGeNET和Gene Cards數(shù)據(jù)庫共搜集到955個靶點。利用Cytoscap 3.2.1中的Merged功能將成分靶點和疾病靶點進行融合，得到88個交集靶點作為金鈴子散治療附睪炎的潛在治療靶點。應用Cytoscape軟件構(gòu)建花椒-成分-候選靶點-疾病網(wǎng)絡圖(圖2)。從網(wǎng)絡圖中可以看出，川楝子與延胡索通過不同的成分作用于靶蛋白，進一步發(fā)揮治療效果。因此，療效的取得是通過成分與靶點的層級作用實現(xiàn)的。

注：菱形代表草藥；正方形代表成分；圓形代表靶點；三角形代表疾病。

2.4 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡分析

為了進一步深入了解這些潛在候選靶點之間的相互關(guān)系，應用STRING數(shù)據(jù)庫獲得蛋白與蛋白之間的相互關(guān)系。其中，88個潛在作用靶點有86個發(fā)生相互作用，將STRING數(shù)據(jù)導出，利用Cytoscape 3.2.1將蛋白之間的相互作用關(guān)系可視化(圖3)，此網(wǎng)絡圖包括86個節(jié)點、891條邊。通過對PPI網(wǎng)絡進行拓撲分析，IL6、TNF、TP53和CASP3等靶點具有較高的度值，提示這些靶點在疾病的治療過程中發(fā)揮著重要的作用。

注：圓形代表靶點。

2.5 基因本體論分析

通過DAVID數(shù)據(jù)庫進行基因本體論(GO)分析，共獲得874個分析條目；其中分子功能71個、生物過程772個、細胞組分31個(P<0.05)。按照富集分析P值進行排序，分別列舉了排名前10位的富集分析結(jié)果(圖4)?；虮倔w論分析結(jié)果表明，在分子功能中，主要與類固醇激素受體(GO：0003707 steroid hormone receptor activity)、配體依賴性核受體活性(GO：0004879 ligand-dependent nuclear receptor activity)、脂質(zhì)結(jié)合(GO：0008289 lipid binding)和蛋白質(zhì)二聚體活性(GO：0046983 protein dimerization activity)等分子功能相關(guān)(圖5)；在生物過程中，主要涉及到細胞增殖的調(diào)節(jié)(GO：0042127 regulation of cell proliferation)、對有機物的反應(GO：0010033 response to organic substance)和凋亡(GO：0042981regulation of apoptosis)等生物過程(圖6)；在細胞組成中，主要涉及到細胞外空間(GO：0005615 extracellular space)、胞外區(qū)部分(GO：0044421 extracellula region part)和神經(jīng)元投射(GO：0043005 neuron projection)等功能。

圖4 分子功能富集分析

圖5 生物過程富集分析

圖6 細胞組成富集分析

2.6 KEGG富集分析

通過DAVID在線分析平臺對潛在治療靶點進行KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)在86個核心靶點中，有52個參與到15條通路中。利用Cytoscape構(gòu)建通路-靶點網(wǎng)絡圖(圖7)，此網(wǎng)絡圖包括66個節(jié)點和88條邊。對網(wǎng)絡圖進行拓撲分析，其中，TNF、IL6、IL2、IL10、MTOR和IL1B等靶點具有較有較高的度值，富集排名度值靠前的通路主要有細胞因子-細胞因子受體相互作用(hsa04060：Cytokine-cytokine cytokine receptor interaction)、鈣信號通路(hsa04020：Calcium signaling pathway)、Jak-STAT信號通路(hsa04630：Jak-STAT signaling pathway)和凋亡(hsa04210：Apoptosis)等信號通路。通路分析顯示信號通路及相關(guān)通路主要涉及到炎癥、凋亡等方面，故金鈴子散可能通過其有效活性成分作用于若干靶點，對多種信號通路產(chǎn)生進一步調(diào)控作用，從而發(fā)揮治療附睪炎的作用。

注：“V”形代表通路，圓形代表靶點。

3 討論

本研究通過多個數(shù)據(jù)庫收集得到附睪炎的相關(guān)疾病靶點，提示附睪炎的發(fā)生可能是由多個靶點共同作用的結(jié)果。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫平臺，基于藥代動力學ADME參數(shù)，以“OB≥30%，DL≥0.18”為篩選條件，選取川楝子和延胡索中生物活性較好的58種化學成分。此外，結(jié)合文獻檢索得到篩選條件之外的活性成分川楝子素。通過成分靶點預測和網(wǎng)絡構(gòu)建分析，篩選出86個潛在作用靶點用于進一步分析。利用DAVID數(shù)據(jù)平臺得到GO分析結(jié)果三類，包括分子功能、細胞組分和生物過程，就其生物過程而言，主要涉及凋亡和增殖。此外，KEGG通路富集分析結(jié)果提示，金鈴子散主要涉及到炎癥、凋亡等方面。

在泌尿生殖系統(tǒng)中，先天免疫系統(tǒng)和雄性生殖道之間的相互作用對于雄性生殖系統(tǒng)的發(fā)育和維持至關(guān)重要。附睪是精子成熟、保護和貯存過程中起關(guān)鍵作用的黏膜器官，附睪內(nèi)的免疫環(huán)境必須緊密協(xié)調(diào)，以便迅速減輕可能危害成熟精子的致病威脅。這種環(huán)境還必須保持一個耐受性環(huán)境，以避免宿主免疫系統(tǒng)破壞自身抗原性精子[17]。盡管這些免疫機制對維持附睪內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定至關(guān)重要，但它們在很大程度上仍具有一定的未知性。了解附睪是如何感覺到并對入侵的細菌產(chǎn)生防御反應的，這對臨床極為重要，因為細菌感染是附睪炎最常見的病因，而附睪炎是男性生殖系統(tǒng)常見的炎癥性疾病[18]。因此，抗炎就是治療附睪炎的首要方略。

炎癥細胞因子與人體免疫系統(tǒng)抗炎成分之間存在著動態(tài)的、不斷變化的平衡。這些細胞因子和細胞因子抑制劑對炎癥的調(diào)節(jié)機制比較復雜，因為免疫系統(tǒng)有多余的途徑，而多個元素具有相似的生理效應。此外，除了白細胞介素1受體拮抗劑(il-1ra)之外，所有的抗炎細胞因子至少都具有一些促炎特性。任何細胞因子的凈效應取決于細胞因子釋放的時間、作用的局部環(huán)境、競爭或協(xié)同元素的存在、細胞因子受體密度，以及組織對每種細胞因子的反應等[19]。基因、環(huán)境或微生物因素對細胞因子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡的干擾可能會產(chǎn)生非常有害的后果[20]。主要的抗炎細胞因子在附睪炎的治療過程中可能發(fā)揮著舉足輕重的作用。在通路-靶點網(wǎng)絡圖中，TNF、IL6、IL2、IL10和IL1B等炎癥因子的度值較高，意味著這些炎癥因子在疾病的治療中發(fā)揮著重要的作用。在全反式維甲酸(atRA)減輕附睪炎急性炎癥的機制研究中，通過構(gòu)建小鼠附睪炎模型，連續(xù)5天腹腔注射全反式維甲酸。結(jié)果表明，atRA通過降低促炎細胞因子的表達，增加TGFβ1、Ⅱ-10等抗炎因子的表達，減輕了小鼠附睪炎的炎癥反應。

此外，據(jù)研究報道，JAK激酶信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK-STAT)信號通路與類風濕關(guān)節(jié)炎、銀屑和炎癥性腸病等炎癥性和自身免疫性疾病的發(fā)病有關(guān)。許多參與自身免疫和炎癥性疾病發(fā)病機制的細胞因子使用JAKs和STATs來傳遞細胞內(nèi)信號。本研究通過網(wǎng)絡藥理學數(shù)據(jù)挖掘和整合分析發(fā)現(xiàn)，JAK2/3和STAT1具有較高的度值，表明JAK-STAT信號通路在附睪炎的治療中也發(fā)揮著重要作用，不過由于相關(guān)研究較少，此項結(jié)果有待進一步實驗證實。

MTOR是一種磷酸肌醇-3-激酶相關(guān)蛋白激酶，作為一種變阻器在哺乳動物體內(nèi)發(fā)揮作用，能夠以營養(yǎng)素、能量和生長因子的形式整合各種環(huán)境信號，以調(diào)節(jié)組織過程和內(nèi)穩(wěn)。此外，TP53作為一個凋亡相關(guān)的基因，本研究發(fā)現(xiàn)MTOR和TP53同樣作為治療靶點(圖8)，在金鈴子散治療附睪炎的過程中發(fā)揮著作用。然而，這些靶點與附睪炎的關(guān)系還需要深入研究。

圖8 金鈴子散治療附睪炎的作用機制

本研究通過數(shù)據(jù)挖掘，在大量計算機運算法則的基礎上，應用網(wǎng)絡藥理學對金鈴子散的作用機制進行了預測，結(jié)果表明，其治療附睪炎具有多成分、多靶點、多通路的作用特點。通過多種數(shù)據(jù)分析，網(wǎng)絡藥理學作為一種新的研究方法，可以極大提高工作效率，為未來中醫(yī)藥機制方面的研究提供了重要參考。