羅非魚骨發(fā)酵制備膠原蛋白肽工藝的響應(yīng)面優(yōu)化

◎ 韋倩妮

（北海職業(yè)學(xué)院，廣西 北海 536000）

我國羅非魚養(yǎng)殖量居世界前列，銷售和加工量大。在加工過程中，產(chǎn)生魚骨、魚片、魚鱗等大量下腳料，約占魚體的54%，其中魚頭、魚骨約占43%，占比最多[1]。我國水產(chǎn)品加工和副產(chǎn)物綜合利用的水平較低，若這些下腳料沒有得到有效利用，會造成資源浪費，甚至污染環(huán)境。隨著漁業(yè)的發(fā)展，魚類下腳料的高值化利用逐漸引起人們的重視，不少學(xué)者開展了研究。魚皮、魚頭、魚骨等部位常用于制備活化鈣，提取明膠、蛋白多肽和硫酸軟骨素等活性物質(zhì)，也可制成即食魚排等各類休閑食品[2]。

制備蛋白肽常用酶解法和發(fā)酵法，通過微生物發(fā)酵法提取多肽，可充分發(fā)揮微生物胞外酶對蛋白質(zhì)水解的作用，還可以利用其發(fā)酵過程產(chǎn)生的各種酶來分解脂肪和腥味物質(zhì)[3]。枯草芽孢桿菌是一種傳統(tǒng)食品用菌，具有良好的產(chǎn)酶能力。本文以羅非魚骨、魚頭制備魚骨漿原料，用枯草芽孢桿菌發(fā)酵，制備膠原蛋白肽。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅非魚，市售。枯草芽孢桿菌，北海職業(yè)學(xué)院食品檢驗檢測團(tuán)隊選育；牛肉膏、蛋白胨，北京奧星生物技術(shù)有限公司；牛血清蛋白、福林酚酚試劑，北京索萊寶科技有限公司；酒石酸鉀鈉、無水硫酸銅、氫氧化鈉、碳酸鈉和磷酸氫二鉀，廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心；三氯乙酸，福晨天津化學(xué)試劑有限公司。培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，調(diào)節(jié)pH 值至7.4～7.5，用于種子液制備。

1.2 儀器與設(shè)備

HWS-12 恒溫水浴鍋，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；250B 振蕩培養(yǎng)箱，金壇市宏華儀器廠；UV1000紫外分光光度計，上海翱藝儀器有限公司；TD-4Z 離心機(jī)，四川蜀科儀器有限公司；YXQ-LS-50S Ⅱ高壓滅菌鍋、SW-CJ-2FD 超凈工作臺，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 種子液的制備

將枯草芽孢桿菌活化，接種于種子液培養(yǎng)基中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中，振蕩培養(yǎng)24 h。

1.3.2 魚骨膠原蛋白肽水解液的制備

羅非魚去鱗、去皮、去肉，清除內(nèi)臟，將魚體清洗干凈，魚頭、魚骨下腳料絞碎，得到魚骨漿。分別稱取一定質(zhì)量的魚骨漿和水于三角瓶中，用高壓滅菌鍋121 ℃滅菌20 min，得到發(fā)酵培養(yǎng)基。冷卻后，將枯草芽孢桿菌種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于一定溫度的培養(yǎng)箱，振蕩培養(yǎng)一定時間。將發(fā)酵液8 500 r·min-1離心10 min，收集上清，于98 ℃水浴5 min，滅酶，得到水解液。

1.3.3 單因素試驗

分別考察種子液接種量（3%、5%、7%、9%和11%）、發(fā)酵溫度（25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃和45 ℃）、魚骨漿添加量（8%、10%、12%、14%和16%）、發(fā)酵時間（18 h、24 h、30 h、36 h 和42 h）等4 個因素對水解度的影響。按照1.3.2 方法制備水解液，取上清，測定水解度。

1.3.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取接種量、發(fā)酵溫度、魚骨漿添加量3 個因素進(jìn)行優(yōu)化，因素和水平見表1。

表1 響應(yīng)面實驗因素水平表

1.3.5 測定方法

魚骨漿總蛋白的測定采用凱氏定氮法（GB/T 5009.5—2016）。蛋白肽含量的測定采用福林-酚法測定，水解度采用TCA 法[4]。

幼兒園一日活動始于晨間鍛煉，幼兒園的孩子非?；顫姾脛?，對各種體育活動都有著濃厚的興趣，若是晨間鍛煉的體育活動沒有充分調(diào)動幼兒的積極性，使其參與到晨間鍛煉當(dāng)中，就會影響一日活動的整體效果。

式中：N0為魚骨漿總蛋白的含量，g/100 g；N1為水解前可溶性多肽的含量，g/100 g；N2為水解后可溶性多肽的含量，g/100 g。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種量對水解度的影響

由圖1可知，接種量為7%時，水解度最大。當(dāng)接種量較小時，菌量不足，發(fā)酵水平不高；隨著接種量增大，胞外酶分泌量增多，發(fā)酵周期短[3]，但接種量過多，代謝廢物亦隨之增多，不利于發(fā)酵，導(dǎo)致水解度低[5]。

圖1 不同接種量對水解度的影響圖

2.2 發(fā)酵溫度對水解度的影響

由圖2結(jié)果可知，溫度在35 ℃左右時，水解度最大。發(fā)酵溫度過高時，加劇了膠原蛋白肽鏈的斷裂，從而產(chǎn)生大量肽鏈片段[5]。

圖2 不同發(fā)酵溫度對水解度的影響圖

2.3 魚骨漿添加量對水解度的影響

由圖3結(jié)果可知，當(dāng)魚骨漿添加量為12%時，水解度最大。當(dāng)魚骨漿添加量少時，培養(yǎng)基所含水分較多，枯草芽孢桿菌所產(chǎn)生的胞外酶被稀釋，影響酶的作用效果，降低水解效果[3]。

圖3 魚骨漿添加量對水解度的影響圖

2.4 發(fā)酵時間對水解度的影響

由圖4結(jié)果可知，隨著發(fā)酵時間延長，水解度增大，當(dāng)發(fā)酵30 h 以后，水解度變化不大；發(fā)酵時間過長，發(fā)酵液會有異味。

圖4 不同發(fā)酵時間對水解度的影響圖

2.5 響應(yīng)面試驗優(yōu)化工藝條件

2.5.1 回歸模型建立與方差分析

在確定單個因素適宜的范圍后，選取接種量（A）、發(fā)酵溫度（B）和魚骨漿添加量（C）為試驗因素，水解度（Y）為評價指標(biāo)，用Design-Expert 11 進(jìn)行Box-Benhken 試驗設(shè)計和數(shù)據(jù)分析，結(jié)果見表2，顯著性檢驗和方差分析結(jié)果見表3。通過回歸分析，得到回歸方程Y=27.77+1.07A+1.04B+1.09C-0.367 5AB-0.482 5AC+1.32BC+1.32A2-1.60B2-0.948 5C。

表2 羅非魚骨發(fā)酵制備膠原蛋白肽藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果表

表3 回歸模型方差分析表

由表3可知，此模型的P＜0.01，說明此模型極顯著。失擬項P=0.380 9，大于0.05，失擬項不顯著，說明該模型的擬合程度比較好，與實際情況較吻合。同時模型的復(fù)決定系數(shù)R2=0.973 1，變異系數(shù)CV=1.87%，說明該模型的預(yù)測結(jié)果有較高的精密度及可靠性。由P值可知，除二次項C2、相互項AB、AC對水解度無顯著影響外，其他項A、B、C、A2、B2、BC對水解度有顯著影響。根據(jù)F值大小，水解度受各因素影響的順序為C（魚骨漿添加量）>A（接種量）>B（發(fā)酵溫度）。

2.5.2 響應(yīng)面圖形分析與最佳工藝確定

各個因素的交互作用響應(yīng)曲面圖如圖5所示。由圖5可知，當(dāng)接種量、發(fā)酵溫度、魚骨漿添加量取值較小時，效應(yīng)曲面較陡，對水解度影響比較顯著。各交互作用中，接種量（A）與發(fā)酵溫度（B），接種量（A）與魚骨漿添加量（C）的等高線接近圓形，交互作用不顯著，發(fā)酵溫度（B）與魚骨漿添加量（C）的等高線為橢圓，交互作用顯著。通過軟件分析，得到水解的最佳工藝條件為接種量7.80%、發(fā)酵溫度36.59 ℃、魚骨漿添加量13.28%，在此條件下水解度的預(yù)測值為28.57%。為驗證響應(yīng)面試驗預(yù)測結(jié)果的可靠性，并結(jié)合實際生產(chǎn)需要，將最優(yōu)工藝參數(shù)調(diào)整為接種量7.8%、發(fā)酵溫度36.6 ℃、魚骨漿添加量13.3%，發(fā)酵時間30 h。按優(yōu)化的條件進(jìn)行3 次重復(fù)試驗，水解度的平均值為28.52%，與模型的預(yù)測值接近，說明本試驗優(yōu)化的方法可行。

圖5 接種量、發(fā)酵溫度、魚骨漿添加量交互作用對水解度影響的響應(yīng)面圖

3 結(jié)論

羅非魚加工中產(chǎn)生的魚骨、魚頭等下腳料占比較大，如果僅作用于生產(chǎn)傳統(tǒng)飼料，利用價值較低。本研究以魚骨漿為原料、水解度為評價指標(biāo)，通過單因素試驗篩選，用響應(yīng)面試驗優(yōu)化水解的工藝條件，結(jié)果為接種量7.8%、發(fā)酵溫度36.6 ℃、魚骨漿添加量13.3%，發(fā)酵時間30 h。在此條件下，水解度可達(dá)28.52%。本試驗為水產(chǎn)品加工下腳料的高值化利用提供了參考，具有應(yīng)用價值。