◎ 朱晶晶，焦 劼

（上海諾德生物實業(yè)有限公司，上海 200030）

失眠是目前社會上普遍的睡眠障礙，其中，我國有1/3 以上的成年人存在睡眠障礙[1]。L-茶氨酸（N-乙基L-谷氨酰胺）是由日本科學家酒戶彌二郎于1950年第一次從玉露茶中分離提取[2]，是一種具有呈鮮味作用的非蛋白氨基酸。國家衛(wèi)生和計劃生育委員會發(fā)布《關(guān)于批準茶葉茶氨酸為新食品原料等的公告（2014年第15號）》，正式批準茶葉茶氨酸為新食品原料。已有研究表明，L-茶氨酸具有改善睡眠的作用[3-7]。茶氨酸改善睡眠的作用機理可能與抑制神經(jīng)性興奮、促進腦電波α 波釋放，以及與戊巴比妥類催眠藥物有協(xié)同作用相關(guān)[8]。

酸棗仁（又被稱為“東方睡果”）為傳統(tǒng)的藥食同源類物質(zhì)，具有養(yǎng)心補肝、寧心安神的功效，多用于緩解虛煩不眠、驚悸多夢、體虛多汗、津傷口渴[9]。臨床研究結(jié)果表明，酸棗仁有寧靜安神、助眠等功效[10-12]。現(xiàn)代藥理學研究結(jié)果也表明，酸棗仁具有鎮(zhèn)靜催眠[13-15]、保護心血管[16-18]、降血壓和降血脂[19-21]等作用。

模式生物斑馬魚已經(jīng)成為最受重視的脊椎動物發(fā)育生物學模式之一。它具有兩個鮮明的特點和優(yōu)勢。①斑馬魚的胚胎是透明的?？茖W家們很容易能夠觀察到藥物或功能性物料對其體內(nèi)器官的影響。②斑馬魚基因與人類基因的相似度達到87%。這表明，藥物或功能物料在斑馬魚上獲得的實驗結(jié)果在多數(shù)情況下也適用于人體。同時，與傳統(tǒng)的免疫學模式生物——小鼠相比，模式生物斑馬魚還具有體型小、子代數(shù)量多、培育要求低、易于養(yǎng)殖及飼養(yǎng)成本低等優(yōu)勢。因此，利用模式生物斑馬魚進行藥物或功能物料的生理學功能的驗證和評價，越來越受到歡迎。

目前，關(guān)于L-茶氨酸和酸棗仁對改善睡眠的研究很多，但將酸棗仁水提物與天然來源的茶葉茶氨酸聯(lián)合使用的研究較少。據(jù)此，本研究基于戊四唑誘導建立的斑馬魚失眠模型，以奧沙西泮對陽性對照藥物，分別研究了茶葉茶氨酸和酸棗仁水提物的改善睡眠的作用，同時，也進一步將茶葉茶氨酸和酸棗仁水提物聯(lián)用，研究了酸棗仁茶葉茶氨酸復合物的改善睡眠的作用。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

茶葉茶氨酸（批號：19111503，上海諾德生物實業(yè)有限公司）；酸棗仁水提物（批號：191218，上海諾德生物實業(yè)有限公司）；酸棗仁茶葉茶氨酸復合物（批號：191219，茶葉茶氨酸﹕酸棗仁水提物=1﹕1，上海諾德生物實業(yè)有限公司）；戊四唑[PTZ，批號：404-520-2，阿拉丁試劑（上海）有限公司]；奧沙西泮（批號：20180703，北京益民藥業(yè)有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，批號：D9912280，Sigma-Aldrich）。

1.2 實驗動物

選用正常野生型AB 品系斑馬魚，年齡為5 dpf，共870 尾。斑馬魚飼養(yǎng)條件：養(yǎng)魚用水的溫度為28 ℃，速溶海鹽的添加量為200 mg·L-1（模擬斑馬魚生活的水環(huán)境，并補充斑馬魚正常生活所需的鈉、鈣和鎂等多種礦物質(zhì)營養(yǎng)元素），其電導率為480～510 μS·cm-1；硬度為53.7～71.6 mg·L-1CaCO3，pH 為6.9～7.2。

1.3 儀器與設備

解剖顯微鏡（SZX7，奧林巴斯公司，日本）；與顯微鏡相連的相機（VertA1）；運動/行為分析記錄儀（V3.11，ViewPoint 生命科學公司，法國）；精密電子天平（CP214，奧豪斯公司，美國）；6 孔板和96 孔板（賽默飛世爾公司，中國）。

1.4 實驗方法

1.4.1 溶液配制

（1）戊四唑（690.85 μg·mL-1）的配制。精密稱取0.691 g戊四唑于燒杯中，養(yǎng)魚用水溶解并定容于100 mL容量瓶中，配制成6.91 mg·mL-1的戊四唑溶液。使用時，用養(yǎng)魚用水稀釋成690.85 μg·mL-1。

（2）奧沙西泮（40 μg·mL-1）的配制。精密稱取4.000 g 奧沙西泮于燒杯中，用30 mL 二甲亞砜（DMSO）溶液溶解并定容于100 mL 容量瓶中，配制成40 mg·mL-1的奧沙西泮溶液。使用時，用二甲亞砜溶液稀釋成40 μg·mL-1。

（3）酸棗仁水提物濃度梯度配制。精密稱取0.100 g的酸棗仁水提取物，用30 mL 蒸餾水溶解并定容于100 mL 容量瓶中，配制成1 mg·mL-1的酸棗仁水提物溶液。使用時，分別用蒸餾水稀釋成62.5 μg·mL-1、125.0 μg·mL-1、250.0 μg·mL-1和500.0 μg·mL-1。

（4）茶葉茶氨酸濃度梯度配制。精密稱取0.200 g的茶葉茶氨酸，用30 mL 蒸餾水溶解并定容于100 mL容量瓶中，配制成2 mg·mL-1的茶葉茶氨酸溶液。使用時，分別用蒸餾水稀釋成125 μg·mL-1、250 μg·mL-1、500 μg·mL-1和1 000 μg·mL-1。

（5）酸棗仁茶葉茶氨酸復合物濃度梯度配制。精密稱取0.200 g的酸棗仁茶葉茶氨酸復合物，用30 mL蒸餾水溶解并定容于100 mL 容量瓶中，配制成2 mg·mL-1的酸棗仁茶葉茶氨酸溶液。使用時，分別用蒸餾水稀釋成125 μg·mL-1、250 μg·mL-1、500 μg·mL-1和1 000 μg·mL-1。

1.4.2 實驗設置

（1）對照組。①正常對照組。選取30 尾正常斑馬魚，給予3 mL 養(yǎng)魚用水。②模型對照組。選取30 尾正常斑馬魚，給予3 mL 養(yǎng)魚用水。處理斑馬魚24 h 后，使用690.85 μg·mL-1戊四唑誘導1 h 建立斑馬魚失眠模型。③陽性對照組。選取30 尾正常斑馬魚，給予3 mL 的40 μg·mL-1的奧沙西泮溶液。

（2）實驗組。①斑馬魚最大耐受濃度測定實驗組。將450 尾斑馬魚置于6 孔板中，每孔30 尾。酸棗仁水提物實驗組分別水溶給予3 mL 的62.5 μg·mL-1、125.0 μg·mL-1、250.0 μg·mL-1、500.0 μg·mL-1和1 000.0 μg·mL-1濃度酸棗仁水提物；茶葉茶氨酸實驗組分別水溶給予3 mL 的125 μg·mL-1、250 μg·mL-1、500 μg·mL-1、1 000 μg·mL-1和2 000 μg·mL-1濃度的茶葉茶氨酸；酸棗仁茶葉茶氨酸復合物實驗組分別水溶給予3 mL 的125 μg·mL-1、250 μg·mL-1、500 μg·mL-1、1 000 μg·mL-1和2 000 μg·mL-1濃度的酸棗仁茶葉茶氨酸復合物。②改善睡眠作用評價實驗組。選取270 尾斑馬魚于6 孔板中，每孔30 尾。酸棗仁水提物實驗組分別水溶給予3 mL 的62.5 μg·mL-1、125.0 μg·mL-1和250.0 μg·mL-1濃度的酸棗仁水提物；茶葉茶氨酸實驗組分別水溶給予3 mL 的62.5 μg·mL-1、125.0 μg·mL-1和250.0 μg·mL-1濃度的茶葉茶氨酸；酸棗仁茶葉茶氨酸復合物實驗組分別水溶給予3 mL 的125 μg·mL-1、250 μg·mL-1和500 μg·mL-1濃度的酸棗仁茶葉茶氨酸復合物。

1.4.3 茶葉茶氨酸、酸棗仁水提物和酸棗仁茶葉茶氨酸復合物最大耐受濃度（MTC）測定

各實驗組、正常對照組和模型對照組處理24 h后和PTZ 共同處理1 h，觀察并記錄，實驗斑馬魚的毒性表型和死亡情況，確定茶葉茶氨酸、酸棗仁水提物和酸棗仁茶葉茶氨酸復合物對失眠模型斑馬魚的MTC。

1.4.4 基于總運動距離的茶葉茶氨酸、酸棗仁水提物和酸棗仁茶葉茶氨酸復合物改善睡眠作用的評價

各組處理24 h 后，將斑馬魚轉(zhuǎn)移至96 孔板中，每孔1 尾。除正常對照組外，其余實驗組用690.85 μg·mL-1的PTZ 誘導斑馬魚1 h 建立失眠模型。每組隨機選擇10 尾斑馬魚，采用行為分析儀測定的方法，測定實驗斑馬魚的總運動距離，以總運動距離評價茶葉茶氨酸、酸棗仁水提物和酸棗仁茶葉茶氨酸復合物對失眠斑馬魚的睡眠改善作用。

1.4.5 數(shù)據(jù)分析

茶葉茶氨酸、酸棗仁水提物和酸棗仁茶葉茶氨酸復合物對失眠癥斑馬魚的睡眠改善作用，其計算公式為

采用Graph 軟件對數(shù)據(jù)進行分析，統(tǒng)計學分析采用方差分析和Dunnett's T-檢驗，p＜0.05 表明具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶葉茶氨酸、酸棗仁水提物和酸棗仁茶葉茶氨酸復合物的最大耐受濃度（MTC）

由表1可知，在62.5～250.0 μg·mL-1酸棗仁水提物對斑馬魚未產(chǎn)生任何明顯的毒副作用，也未引起斑馬魚死亡；500.0 μg·mL-1濃度組誘發(fā)10%（3/30 尾）斑馬魚死亡；1 000.0 μg·mL-1濃度組誘發(fā)100%（30/30尾）斑馬魚死亡。因此，在該模型下，酸棗仁水提物的最大使用濃度為250.0 μg·mL-1（表1）。最終，選擇62.5 μg·mL-1、125.0 μg·mL-1和250.0 μg·mL-1的酸棗仁水提物用于后續(xù)實驗。

在125.0～1 000.0 μg·mL-1茶葉茶氨酸對斑馬魚未產(chǎn)生任何明顯的毒副作用，也未引起斑馬魚死亡；2 000 μg·mL-1濃度組誘發(fā)3.33%（1/30 尾）斑馬魚死亡和8 尾脊椎彎曲。因此，在該模型下，茶葉茶氨酸的最大使用濃度為1 000 μg·mL-1。為了保證后續(xù)的功能驗證實驗中茶葉茶氨酸樣品濃度和酸棗仁樣品濃度一致，最終選擇62.5 μg·mL-1、125.0 μg·mL-1和250.0 μg·mL-1的茶葉茶氨酸用于后續(xù)實驗。

在125～500 μg·mL-1酸棗仁茶葉茶氨酸復合物對斑馬魚未產(chǎn)生任何明顯的毒副作用，也未引起斑馬魚死亡；1 000 μg·mL-1濃度組誘發(fā)30%（9/30 尾）斑馬魚死亡；2 000 μg·mL-1濃度組誘發(fā)100%（30/30 尾）斑馬魚死亡。因此，在該模型下，酸棗仁茶葉茶氨酸復合物的最大使用濃度為500 μg·mL-1（表1）。最終，選擇125 μg·mL-1、250 μg·mL-1和500 μg·mL-1的酸棗仁茶葉茶氨酸復合物用于后續(xù)實驗。

表1 茶葉茶氨酸、酸棗仁水提物和酸棗仁茶葉茶氨酸復合物處理后“濃度-致死性-毒性表型”結(jié)果表（n=30）

2.2 基于總運動距離的茶葉茶氨酸、酸棗仁水提物和酸棗仁茶葉茶氨酸復合物改善睡眠作用的評價

茶葉茶氨酸、酸棗仁水提物和酸棗仁茶葉茶氨酸復合物對斑馬魚改善睡眠作用定量數(shù)據(jù)如表2所示。模型對照組中，斑馬魚運動距離（9 236 mm）遠高于正常對照組（5 094 mm，p＜0.001），這表明模型建立成功；陽性對照組的運動距離為7 287 mm，低于模型對照組（p＜0.001），睡眠改善作用為47%。這表明，奧沙西泮對失眠斑馬魚的睡眠質(zhì)量具有明顯的改善作用。

62.5 μg·mL-1、125.0 μg·mL-1和250.0 μg·mL-1的酸棗仁水提物處理組的斑馬魚的運動距離分別為7 598 mm（p＜0.01）、5 539 mm（p＜0.001）和4 701 mm（p＜0.001），均低于模型對照組，睡眠改善作用分別達到40%、89%和109%。這表明，在125 μg·mL-1和250 μg·mL-1的實驗濃度下，酸棗仁水提物對失眠斑馬魚的睡眠質(zhì)量具有明顯的改善作用。

62.5 μg·mL-1、125.0 μg·mL-1和 250.0 μg·mL-1的茶葉茶氨酸處理組的斑馬魚的運動距離分別為7 986 mm（p>0.05）、6 646 mm（p＜0.001）和8 017 mm（p>0.05），均低于模型對照組，睡眠改善作用分別達到30%、63% 和29%（ 表2）。這表明，在125 μg·mL-1濃度條件下，茶葉茶氨酸對PTZ 誘導的失眠斑馬魚具有明顯的睡眠改善作用；62.5 μg·mL-1和250 μg·mL-1實驗濃度條件下，茶葉茶氨酸對失眠斑馬魚具有一定的睡眠改善作用。

125 μg·mL-1、250 μg·mL-1和500 μg·mL-1的酸棗仁茶葉茶氨酸復合物處理組的斑馬魚的運動距離分別為7 952 mm（p＜0.01）、5 920 mm（p＜0.001）和4 544 mm（p＜0.001），均低于模型對照組，睡眠改善作用分別達到31%、80%和113%（表2）。這表明，在250 μg·mL-1和500 μg·mL-1的濃度下，酸棗仁茶葉茶氨酸復合物對PTZ 誘導的失眠斑馬魚具有明顯的睡眠改善作用。

表2 茶葉茶氨酸、酸棗仁水提物和酸棗仁茶葉茶氨酸復合物對斑馬魚改善睡眠作用定量數(shù)據(jù)表（n=10）

3 結(jié)論

經(jīng)試驗驗證，茶葉茶氨酸、酸棗仁水提物和酸棗仁茶葉茶氨酸復合物都具有一定的改善睡眠的作用，可見利用具有傳統(tǒng)治療效用的草本植物及其天然提取物等原料在助眠功能性食品開發(fā)領域擁有較大的發(fā)展空間和潛力。