血府逐瘀湯及其不同提取部位對高脂飲食誘導的非酒精性脂肪性肝病小鼠模型的影響

唐 浩，尹藝曉，劉 偉，方 怡，王 君，胡義揚，彭景華

1上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海 201203；2上海中醫(yī)藥大學肝病研究所，上海 201203；3教育部肝腎疾病重點實驗室（上海中醫(yī)藥大學），上海 201203；4上海市中醫(yī)臨床重點實驗室，上海 201203

非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）是代謝綜合征在肝臟的具體表現(xiàn)［1］，其疾病譜主要包括非酒精性單純性脂肪肝（NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）以及相關(guān)肝硬化和肝細胞癌［2］。NAFLD目前已成為最常見的慢性肝病，有研究［3］顯示我國有超過2.4億人患有NAFLD。NAFLD病理生理機制復雜，目前尚無批準用于治療的藥物，因此有必要在該領(lǐng)域開展進一步的研究。

血府逐瘀湯出自清代王清任的《醫(yī)林改錯》，由當歸、地黃、桃仁、紅花、甘草、枳殼、赤芍、柴胡、川芎、桔梗、川牛膝11味中藥組成，具有活血化瘀，行氣止痛之用。中醫(yī)認為，瘀是NAFLD的主要病理因素之一［4］，而血府逐瘀湯是“活血化瘀”治法的代表性方劑，與NAFLD的氣滯血瘀中醫(yī)病機相契合。臨床研究［5］表明血府逐瘀湯加減可以明顯改善NAFLD。奧貝膽酸被證實能夠顯著改善NASH患者肝臟炎癥及纖維化［6］。本研究擬采用高脂飲食誘導的NAFLD小鼠模型，以奧貝膽酸作為陽性對照藥物，評價血府逐瘀湯對NAFLD的作用，并探索血府逐瘀湯可能的有效部位。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 采用7周齡SPF級C57BL/6J健康雄性小鼠，SPF級環(huán)境飼養(yǎng)，溫度20℃～25℃，濕度（65±5）%，光照周期12 h/12 h明暗交替。

探究血府逐瘀湯對高脂飲食誘導的小鼠NAFLD的作用（實驗一）：小鼠購于上海靈暢實驗動物飼養(yǎng)公司，實驗動物合格證編號：20180003009457，實驗動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK（滬）2018－0003，實驗動物使用許可證編號：SYXK（滬）2017－0012，飼養(yǎng)于上海南方模式生物科技有限公司實驗動物中心。

探究血府逐瘀湯各提取部位對高脂飲食誘導的小鼠NAFLD的作用（實驗二）：小鼠購于上海吉輝實驗動物飼養(yǎng)公司，實驗動物合格證編號：20170012011445，實驗動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK（滬）2017－0012，實驗動物使用許可證編號：SYXK（滬）2020－0009，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心。

1.2 藥物及造模飼料 血府逐瘀湯由桃仁、紅花、當歸、地黃、川芎、赤芍、川牛膝、桔梗、柴胡、枳殼、甘草（上?？禈蛑兴庯嬈邢薰荆枺?00304、200302、200514、200520、200409、200519、191216、200313、200508、200428、200430）組成。對照飼料（10%熱量來源于脂肪，貨號：D12450B）、高脂飼料（60%熱量來源于脂肪，貨號：D12492i）購自Research Diets公司。

1.3 主要試劑 葡萄糖檢測試劑盒（BioAssay Systems公司，貨號：DIGL－100）；胰島素檢測試劑盒（Crystal Chem公司，貨號：＃90080）；TG試劑盒（浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司，貨號：A0－10017）；ALT試劑盒（Sigma－Aldrich公司，貨號：MAK052）；GGT試劑盒、HE染色試劑盒、油紅O染色試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號：C017－2－1、C0105、D027）；BCA蛋白定量試劑盒（Thermo公司，貨號：23225）；石油醚、吐溫80、羧甲基纖維素鈉（國藥集團化學試劑有限公司，貨號：800986590、30189828、30036328）。

1.4 儀器 N－1300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、OSB－2200油浴鍋（上海愛朗儀器有限公司）；V－850真空控制器、V－700真空泵（BUCHI Labortechnik AG公司）；SCN400型Aperio AT Turbo數(shù)字化病理掃片機、ASP300組織脫水機、EG1160石蠟包埋機、RM2035切片機（LEICA公司）；Power Wave XS微孔板掃描分光光度計（BioTek公司）。

1.5 藥物制備 血府逐瘀湯制劑制備：本研究采用《方劑學》教材［7］中“血府逐瘀湯”所記述的藥物劑量配比，桃仁12 g，紅花9 g，當歸9 g，地黃9 g，川芎5 g，赤芍6 g，川牛膝9 g，桔梗5 g，柴胡3 g，枳殼6 g，甘草3 g。小鼠等效劑量按60 kg體質(zhì)量成人用量的16倍換算，即血府逐瘀湯低劑量制劑（含生藥1.01 g/mL，20 mL/kg鼠質(zhì)量灌胃）。加入8倍藥材質(zhì)量的水，浸泡0.5 h，煎煮2次（各1.5 h）后合并濃縮，得到血府逐瘀湯高劑量制劑（含生藥2.03 g/mL），低劑量由高劑量倍比稀釋獲得（含生藥1.01 g/mL）。實驗二中血府逐瘀湯制劑為實驗一中血府逐瘀湯低劑量（含生藥1.01 g/mL）。血府逐瘀湯各提取部位制備如下。

（1）提取部位1：血府逐瘀湯制劑中加入9倍體積的95%乙醇，常溫靜置48 h后，取出上清液，剩余沉淀物蒸干得到浸膏，即為血府逐瘀湯提取部位1（合生藥含量1.01 g/mL），使用時溶于雙蒸水中。

（2）提取部位2：利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（45℃，80 kPa）回收上清液中乙醇，剩余溶液加入雙蒸水和石油醚混勻，靜置分上下層，下層部分蒸干水分得到血府逐瘀湯提取部位2（合生藥含量1.01 g/mL），使用時溶于雙蒸水中。

（3）提取部位3：利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（40℃，120 kPa）回收上層部分的石油醚，剩余部分即為血府逐瘀湯提取部位3（合生藥含量1.01 g/mL），使用時溶于2%吐溫80中。

奧貝膽酸制備：奧貝膽酸參考文獻［8］劑量為每天10 mg/kg，按20 mL/kg鼠質(zhì)量灌胃，將其溶于雙蒸水制備成濃度為0.5 mg/mL的混懸液。

1.6 模型制備、分組給藥與取材 實驗一：將50只小鼠隨機分為正常組、模型組、血府逐瘀湯高劑量組和低劑量組、奧貝膽酸對照組，每組10只。正常組小鼠予對照飼料，其余各組均予高脂飼料，所有小鼠自由進食和飲水16周。造模第13周開始灌胃給藥，血府逐瘀湯高、低劑量組小鼠分別予血府逐瘀湯高、低劑量（分別含生藥2.03 g/mL、1.01 g/mL，20 mL/kg鼠質(zhì)量），奧貝膽酸對照組小鼠予奧貝膽酸（10 mg/kg），正常組和模型組給予等量滅菌飲用水，至16周末所有小鼠12 h禁食后眼眶取血，室溫靜置4 h后離心（4℃，3500 r/min，15 min）取上清，－80℃凍存?zhèn)溆?。小鼠脫頸椎處死后打開腹腔取肝臟，PBS清洗血跡后，取兩塊肝大葉中部約1 cm×1 cm大小肝組織分別置于10%福爾馬林溶液固定和OCT膠包裹后液氮速凍，剩余肝組織切碎分裝，－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

實驗二：將54只小鼠隨機分為正常組，模型組，血府逐瘀湯提取部位1、2、3組，血府逐瘀湯對照組，每組9只。正常組小鼠予對照飼料，其余各組均予高脂飼料，所有小鼠自由進食和飲水16周。造模第13周開始灌胃給藥，血府逐瘀湯提取部位1、2、3組小鼠分別予血府逐瘀湯提取部位1、2、3制劑（均合生藥1.01 g/mL，20 mL/kg鼠質(zhì)量），血府逐瘀湯對照組小鼠予血府逐瘀湯低劑量制劑（含生藥1.01 g/mL，20 mL/kg鼠質(zhì)量），正常組和模型組給予等量滅菌飲用水，取材方法同實驗一。

1.7 檢測指標及方法

1.7.1 肝組織HE染色 小鼠肝組織固定于10%福爾馬林溶液3 d后，脫水、包埋，切取4μm石蠟切片，用HE染色試劑盒染色。將切片置于70℃烤片機烤片40 min，然后依次進行脫蠟、蘇木精染液15 min、鹽酸酒精3 s、伊紅染液10 s、脫水處理，最后用中性樹脂封片。用病理掃片機掃片并儲存病理圖像。肝組織病理評分使用NAFLD活動評分（NAFLD activity score，NAS）（表1），NAS＜3分可排除NASH，NAS＞4分則可診斷為NASH，介于兩者之間為有NASH可能［9］。

表1 肝組織NAS評分標準Table 1 NAS scoring criteria for liver tissue

1.7.2 肝組織油紅O染色 每組隨機選取3個包埋于OCT膠中的肝組織，切取8μm冰凍切片，使用油紅O染色試劑盒，按說明書操作，染色完成后于光學顯微鏡下觀察病理學形態(tài)。

1.7.3 肝組織TG及GGT檢測 肝組織TG檢測，稱取50 mg肝組織，在無水乙醇和丙酮溶液（375μL＋375μL）中用全自動樣品快速研磨儀研磨（65 Hz，60 s）3次，勻漿液4℃靜置過夜，次日離心（4℃，3000 r/min，15 min），取上清液用于TG測定。按照說明書進行操作。

肝組織GGT檢測，稱取50 mg肝組織，在450μL生理鹽水中使用全自動樣品快速研磨儀研磨（65 Hz，60 s）3次，勻漿液直接離心（4℃，3000 r/min，15 min），取上清液用于GGT測定。按照試劑盒說明書進行操作。使用BCA法檢測所測樣本蛋白含量，校正肝組織GGT水平。

1.7.4 血清ALT、空腹血糖、空腹血清胰島素檢測 血清ALT、葡萄糖和胰島素測定按照試劑盒說明書進行操作。胰島素抵抗指數(shù)＝空腹胰島素（mU/L）×空腹血糖（mmol/L）/22.5。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD－t檢驗。非正態(tài)分布的計量資料以M（P25～P75）表示，多組間比較及進一步兩兩比較均采用Kruskal－Wallis H檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 血府逐瘀湯對高脂飲食誘導的小鼠NAFLD的作用

2.1.1 對小鼠一般情況和胰島素抵抗的影響 血府逐瘀湯高劑量組3只小鼠因灌胃操作不當死亡，其余各組狀態(tài)良好。各組小鼠體質(zhì)量隨造模周期增加而逐漸上升（P＜0．001），進食量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。16周末，模型組小鼠體質(zhì)量較正常組顯著升高（P＜0．05）；與模型組相比，各用藥組小鼠體質(zhì)量均降低（P值均＜0.05），其中血府逐瘀湯高劑量組和低劑量組降低體質(zhì)量的作用優(yōu)于奧貝膽酸（P值均＜0．05），高、低劑量組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表2）。

與正常組相比，模型組小鼠空腹血糖和胰島素、胰島素抵抗指數(shù)均顯著升高（P值均＜0．05）。血府逐瘀湯高劑量組空腹血糖較模型組降低（P＜0．05），其余用藥組與模型組空腹血糖比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P值均＞0．05）。與模型組相比，血府逐瘀湯高劑量組、低劑量組顯著降低小鼠空腹血清胰島素水平和胰島素抵抗指數(shù)（P值均＜0.05）。奧貝膽酸對照組胰島素抵抗指數(shù)低于模型組（P＜0.05），血府逐瘀湯高劑量組、低劑量組降低胰島素抵抗指數(shù)的作用優(yōu)于奧貝膽酸對照組（P值均＜0.05）（表2）。

表2 血府逐瘀湯對進食量、體質(zhì)量、空腹血糖和胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、肝臟TG、血清ALT的作用Table 2 Effects of XuefuZhuyu Decoction on food intake，body weight，fasting blood glucose and insulin，insulin resistance index，liver TG，serum ALT

2.1.2 對小鼠肝組織病理學的影響 HE染色結(jié)果顯示，正常組小鼠肝組織結(jié)果正常，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞圍繞中央靜脈放射狀排列；模型組小鼠肝組織空泡狀脂肪變性明顯增多，可見部分小葉內(nèi)炎癥灶及肝細胞氣球樣變；經(jīng)血府逐瘀湯高劑量、低劑量、奧貝膽酸干預后，肝組織脂滴分布及含量明顯下降（圖1）。NAS評分結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組脂肪變、炎癥浸潤、氣球樣變、NAS總分顯著升高（P值均＜0.05）；與模型組比較，各用藥組脂肪變、炎癥浸潤、氣球樣變、NAS總分均顯著降低（P值均＜0.05），其中血府逐瘀湯高劑量改善脂肪變積分的作用優(yōu)于血府逐瘀湯低劑量和奧貝膽酸（P值均＜0.05）。血府逐瘀湯高、低劑量改善NAS總分的作用均優(yōu)于奧貝膽酸（P值均＜0.05）。各用藥組之間炎癥浸潤、氣球樣變評分差異均無統(tǒng)計學意義（P值均＞0.05）（表3）。

表3 血府逐瘀湯對小鼠肝組織NAS評分的影響Table 3 Effects of XuefuZhuyu Decoction on NAS score of mouse liver tissue

2.1.3 對小鼠肝臟脂質(zhì)沉積及肝功能損傷的影響 肝組織油紅O染色顯示，正常小鼠肝細胞內(nèi)未見明顯脂滴蓄積，模型組可見肝細胞內(nèi)存在明顯且廣泛的大泡狀紅色脂滴，經(jīng)血府逐瘀湯高劑量、低劑量或奧貝膽酸干預后，肝細胞內(nèi)脂滴變小，數(shù)量明顯下降（圖1）。

圖1 血府逐瘀湯對NAFLD小鼠肝組織病理及脂質(zhì)沉積的影響Figure 1 Effects of XuefuZhuyu Decoction on liver histopathology and lipid deposition in NAFLD mice

模型組肝臟TG水平、血清ALT水平較正常組顯著上升；各用藥組TG、ALT水平較模型組顯著降低（P值均＜0.05），其中血府逐瘀湯低劑量改善血清ALT的作用優(yōu)于奧貝膽酸（P＜0.05）（表2）。

2.2 血府逐瘀湯各提取部位對高脂飲食誘導的小鼠NAFLD的作用

2.2.1 對小鼠一般情況和胰島素抵抗的影響 實驗過程中除血府逐瘀湯對照組1只小鼠因打架死亡，其余各組狀態(tài)良好。隨著造模周期增加，各組小鼠體質(zhì)量逐漸上升（P＜0.001），進食量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。16周末，模型組小鼠體質(zhì)量較正常組顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，血府逐瘀湯提取部位1組、血府逐瘀湯對照組小鼠體質(zhì)量降低（P值均＜0.05）（表4）。

與正常組相比，模型組小鼠的空腹血糖、血清胰島素、胰島素抵抗指數(shù)顯著升高（P值均＜0.05）；血府逐瘀湯各提取部位組和血府逐瘀湯對照組小鼠的空腹血糖及胰島素抵抗指數(shù)均較模型組顯著降低（P值均＜0.05）。血府逐瘀湯各提取部位對NAFLD小鼠空腹血清胰島素無顯著效應，血府逐瘀湯對照組空腹血清胰島素明顯低于模型組（P＜0.05）（表4）。

2.2.2 對小鼠肝組織病理學的影響 肝組織HE染色結(jié)果顯示，正常組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細胞圍繞中央靜脈放射狀排列；模型組小鼠肝組織出現(xiàn)明顯空泡狀脂肪變性，可見部分小葉內(nèi)炎性細胞浸潤及肝細胞氣球樣變；血府逐瘀湯各提取部位組及血府逐瘀湯對照組的上述病理變化均顯著減輕（圖2）。NAS評分結(jié)果顯示，與正常組小鼠相比，模型組小鼠脂肪變、炎癥浸潤、氣球樣變及NAS總分顯著增高（P值均＜0.05）；血府逐瘀湯各提取部位組和血府逐瘀湯對照組的脂肪變、炎癥浸潤、氣球樣變及NAS總分均較模型組顯著下降（P值均＜0.05），其中血府逐瘀湯提取部位2、3組改善脂肪變性作用與血府逐瘀湯對照組相當，提取部位2改善NAS總分的作用與血府逐瘀湯對照組相當（表5）。

表5 血府逐瘀湯各提取部位對小鼠肝組織NAS評分的影響Table 5 Effects of each extract of XuefuZhuyu Decoction on NASscore of mouse liver tissue

2.2.3 對小鼠肝臟脂質(zhì)沉積及肝功能損傷的影響 肝組織油紅O染色結(jié)果顯示，正常組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)正常，胞內(nèi)未見明顯脂滴蓄積，而模型組可見肝細胞內(nèi)存在明顯且廣泛的紅色脂滴，血府逐瘀湯各提取部位組及血府逐瘀湯對照組小鼠脂滴數(shù)量明顯減少（圖2）。

圖2 血府逐瘀湯各提取部位對NAFLD小鼠肝組織病理及脂質(zhì)沉積的影響Figure 2 Effects of each extract of XuefuZhuyu Decoction on liver histopathology and lipid deposition in NAFLD mice

模型組小鼠肝臟TG水平較正常組顯著上升，血府逐瘀湯各提取部位組及血府逐瘀湯對照組的小鼠肝臟TG水平均較模型組顯著下降（P值均＜0.05），其中提取部位2、3降低肝組織TG的作用與血府逐瘀湯相當（表4）。

與正常組相比，模型組小鼠血清ALT水平顯著上升（P＜0.01），血府逐瘀湯提取部位2、3組及血府逐瘀湯對照組小鼠的血清ALT水平較模型組下降（P值均＜0.05）（表4）。

模型組小鼠肝臟GGT水平較正常組顯著上升（P＜0.05），血府逐瘀湯提取部位2組及血府逐瘀湯對照組小鼠的肝臟GGT水平較模型組顯著下降（P值均＜0.05）（表4）。

表4 血府逐瘀湯各提取部位對進食量、體質(zhì)量、空腹血糖和胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、肝臟TG、血清ALT、肝臟GGT的作用Table 4 Effects of each extract of XuefuZhuyu Decoction on food intake，body weight，fasting blood glucose and insulin，insulin resistance index，liver TG，serum ALT

3 討論

目前針對NAFLD患者的主要建議是圍繞健康飲食和定期鍛煉為主的生活方式改變［10］，但鑒于人類受社會、生理、心理以及遺傳等因素影響，長期維持上述生活方式的改變具有挑戰(zhàn)性。目前針對由NAFL進展為NASH以及相關(guān)肝硬化和肝癌的擔憂，NAFLD領(lǐng)域也開展多項藥物臨床試驗，主要靶向4個方面［11］，包括控制能量的攝入、靶向能量效率和處置、改善脂毒性肝損傷以及直接針對伴有炎癥和纖維化的肝硬化。但因其復雜的發(fā)病機制及多數(shù)研發(fā)藥物存在不良反應，目前尚無藥物被批準用以預防或治療NAFLD。

臨床實踐提示中醫(yī)藥對于NAFLD的治療有其優(yōu)勢，值得深入研究。根據(jù)臨床表現(xiàn)與病因病機的分析，NAFLD屬于中醫(yī)“肝癖”“脅痛”及“積聚”范疇，痰、濕、濁、瘀、熱是其主要的病理產(chǎn)物和致病因素，痰瘀互結(jié)證是其主要的中醫(yī)證型之一［12］?？梢姟梆觥笔荖AFLD中醫(yī)辨證施治過程中無法回避的因素。一項大型橫斷面分析［13］表明，定期服用抗血小板藥物阿司匹林可能與NAFLD的低患病率有關(guān)。NAFLD患者全血黏度、紅細胞聚集性、血漿黏度和纖維蛋白原等血液流變學指標較健康對照人群有顯著性差異［14］。

血府逐瘀湯是活血化瘀治法的代表方劑，已發(fā)現(xiàn)其可改善組織器官的血液微循環(huán)，減輕炎癥反應，抑制結(jié)締組織代謝［15］。從藥物組成上看，血府逐瘀湯由桃紅物湯合四逆散（枳殼代枳實）再加桔梗、牛膝而成。桃紅四物湯活血養(yǎng)血，四逆散疏肝理脾，桔梗與牛膝一升一降，其與NAFLD“氣滯血瘀”的病機相合。血府逐瘀湯雖然傳統(tǒng)上多用于胸痹、真心痛，但近現(xiàn)代血府逐瘀湯的應用已多有擴展，已見血府逐瘀湯或其加減方應用于治療NAFLD［16］、肝纖維化［17］的報道。本課題組在臨床對于NAFLD，癥見舌質(zhì)暗紅甚至瘀點、瘀斑、舌下青筋瘀曲合并失眠、煩躁等血瘀表現(xiàn)明顯者，采用血府逐瘀湯治療往往多有效驗。相關(guān)研究［5，18］也證實血府逐瘀湯可顯著改善NAFLD患者臨床癥狀。

已發(fā)現(xiàn)血府逐瘀湯含有668個化學成分［19］，復方的單味藥獨立研究有可能忽略復方中各味藥物之間的協(xié)同、拮抗作用以及產(chǎn)生的新物質(zhì)［20］，而將復方看作一個整體，利用溶劑特性，提取出含有相同特性的化學成分的各部位，有利于更全面探索復方發(fā)揮治療作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究中，根據(jù)溶劑特性提取不同的血府逐瘀湯有效部位：血府逐瘀湯提取部位1是水提醇沉的沉淀部位，通過乙醇沉淀，理論上可得到蛋白質(zhì)、多糖等水溶性大分子，而上清物質(zhì)則可能包含溶于水的無機鹽、糖、氨基酸、有機酸鹽、生物堿鹽、苷類等以及溶于乙醇的親脂性成分；血府逐瘀湯提取部位2和提取部位3則經(jīng)石油醚分離此上清部位所得，其中提取部位3為溶于石油醚的揮發(fā)油、油脂等親脂性成分，去掉親脂性成分的上清物質(zhì)為提取部位2。

實驗結(jié)果顯示，血府逐瘀湯各提取部位不同程度改善高脂飲食誘導的NAFLD和胰島素抵抗。提取部位1中可能存在的地黃多糖可降低肥胖糖尿病大鼠的血清TG、總膽固醇、胰島素以及血糖水平［21］；甘草粗多糖可改善高脂飲食誘導的大鼠NAFLD，降低血脂，增強胰島素敏感性和肝組織過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、還原型谷胱甘肽酶活性［22］；當歸多糖也顯示具有抗氧化作用，可顯著提高D－半乳糖致衰老模型小鼠血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶的活性［23］。提示提取部位1改善NAFLD可能與復方中多糖部位降脂和降糖，提高肝組織抗氧化酶活性，改善氧化應激相關(guān)。

提取部位2為水溶性的非親脂成分，如紅花中的羥基紅花素A、柴胡中的柴胡皂苷A和D、桔梗中的桔梗皂苷D、枳殼的有效成分橙皮苷與枳殼總黃酮、當歸活性成分正丁烯基苯酞以及甘草酸、赤芍總皂苷、川芎嗪等。據(jù)報道，羥基紅花素A可上調(diào)肝組織中沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1表達，抑制肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因，顯著逆轉(zhuǎn)高脂誘導NAFLD小鼠血清中脂質(zhì)水平，降低肝臟TG水平［24］。在四氯化碳或高脂飲食誘導的肝纖維化大鼠以及過氧化氫誘導的肝星狀細胞中，羥基紅花黃色素A通過提高抗氧化酶活性、上調(diào)過氧化物酶體增殖物激活受體γ和基質(zhì)金屬蛋白酶2的表達、下調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子β1和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1表達、降低α－平滑肌肌動蛋白水平，有效抑制氧化應激介導的肝損傷［25－26］。柴胡皂苷A和D均可改善高脂高糖飲食誘導的NAFLD小鼠肝臟脂質(zhì)沉積，其中柴胡皂苷D通過下調(diào)脂肪酸合成酶和乙酰輔酶A羧化酶的表達來抑制脂肪酸生物合成，以及誘導?；o酶A氧化酶1和肉毒棕櫚?；D(zhuǎn)移酶1α的表達以促進脂肪酸降解［27］。在肝纖維化大鼠中，柴胡皂苷D還可減輕肝功能損傷［28］。桔梗皂苷D抑制固醇調(diào)控元件結(jié)合蛋白1（sterol regulatory element binding protein－1c，SREBP－1C）表達，降低高脂飲食大鼠的脂肪生成［29］。在高脂飲食誘導的NASH大鼠中，桔梗皂苷可通過抑制肝組織中核因子－κB p65核易位和核因子－κB抑制因子α降解，進而抑制炎癥關(guān)鍵介質(zhì)環(huán)氧合酶2的表達［30］。橙皮苷可通過增加高脂高糖誘導的NAFLD小鼠肝組織過氧化物酶體增殖物激活受體α和降低SREBP－1C表達，發(fā)揮降低肝臟TG、總膽固醇、血清ALT和AST水平、血脂水平及減少肝臟脂肪空泡作用［31］，也有研究［32］顯示橙皮苷可通過降低NAFLD小鼠肝組織細胞色素P4502E1表達，減輕肝臟氧化損傷。當歸中的活性成分正丁烯基苯酞可上調(diào)部分高脂飲食誘導的肥胖小鼠白色脂肪組織中的米色和棕色脂肪選擇基因的表達，刺激白色脂肪組織褐變，增加能量消耗，減輕肝臟脂肪變性［33］。枳殼總黃酮、甘草酸可分別降低高脂血癥大鼠和糖尿病小鼠的血清TG、膽固醇及低密度脂蛋白水平等［34－35］。赤芍總皂苷［36］和川芎嗪［37］分別減輕D－氨基半乳糖誘導肝損傷小鼠和四氯化碳誘導的肝纖維化大鼠的肝損傷，其中川芎嗪可通過降低肝組織或血清中的腫瘤壞死因子α、NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3、IL－1β等炎癥細胞因子，以及在體外實驗中抑制肝星狀細胞與血小板衍生生長因子β受體/NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3/半胱氨酸蛋白酶1通路相關(guān)的炎性細胞因子發(fā)揮抗炎效應［37］。以上研究結(jié)果提示提取部位2改善NAFLD可能與復方中苷類、羥基紅花素A、川芎嗪等成分發(fā)揮降脂和減輕肝損傷，抑制肝組織脂質(zhì)代謝相關(guān)基因，增強抗氧化酶活性，降低相關(guān)炎癥因子表達有關(guān)。

提取部位3為水溶性的親脂成分，可能含有揮發(fā)油成分如當歸揮發(fā)油。有研究［38］表明，當歸揮發(fā)油可降低高血脂大鼠血清總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇水平。

總體來看，血府逐瘀湯全方作用優(yōu)于各提取部位，具有各提取部位所不具備的綜合效力。各提取部位中血府逐瘀湯提取部位2組的藥效學結(jié)果接近復方?，F(xiàn)有的關(guān)于有效成分治療NAFLD的研究報道也多集中于血府逐瘀湯各藥物的水溶性非親脂成分，這可能解釋了為何血府逐瘀湯提取部位2治療NAFLD效應接近復方。提取部位1含有的水溶性大分子多糖和蛋白質(zhì)成分以及提取部位3中所含的親脂成分還有較大的研究空間，值得重視。

本研究驗證了血府逐瘀湯治療NAFLD小鼠模型的藥效，同時篩選出提取部位2可能為血府逐瘀湯發(fā)揮藥效的主要部位，為今后進一步研究血府逐瘀湯復方及提取部位治療NAFLD提供了科學依據(jù)。未來可對提取部位進行質(zhì)譜分析，并與復方中各單味藥的有效成分比較，進一步篩選、驗證接近復方藥效的有效成分；其次，鑒于血府逐瘀湯針對NAFLD的良好藥效，有必要開展深層次的生物學機制探討，從物質(zhì)基礎(chǔ)及效用機制兩個方面科學闡釋血府逐瘀湯防治NAFLD的作用。

倫理學聲明：本研究實驗一于2020年7月15日經(jīng)由上海南方模式生物研究中心動物看護與使用委員會審批，批號：IACUC2020－0018；實驗二于2021年4月9日經(jīng)由上海中醫(yī)藥大學實驗動物福利與倫理委員會審批，批號：PZSHUTCM2100409023。兩項實驗均符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻聲明：唐浩負責研究數(shù)據(jù)收集分析，論文初稿撰寫；尹藝曉、劉偉、方怡、王君參與研究數(shù)據(jù)的獲取分析解釋過程；胡義揚提供指導意見；彭景華負責研究設計，論文修改與定稿，研究資金獲取。