巨噬細胞耗竭及其在肝損傷中的應(yīng)用

于 倩，趙 賽，劉亮明

南京醫(yī)科大學(xué)上海松江臨床醫(yī)學(xué)院，上海 201615

巨噬細胞是先天性免疫系統(tǒng)的組成部分，具有促進損傷愈合、產(chǎn)生活性氧物質(zhì)和吞噬異物的作用，其功能異?？梢饳C體免疫反應(yīng)失調(diào)或組織病理性損傷。巨噬細胞有組織駐留型和非組織駐留型兩種細胞群體，其共有的顯著特征主要是具有分泌功能，包括分泌具有廣泛生物學(xué)功能的細胞因子、生長因子、免疫炎癥因子和趨化因子等。巨噬細胞的另一特征是能夠表達特定的細胞表面標志物如F4/80、CD68、iNOS和CD206等［1］。非組織駐留的巨噬細胞主要分布于循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)，而駐留型巨噬細胞則主要存在于各個組織器官中，如神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細胞、肝臟Kupffer細胞、皮膚朗格漢斯細胞和腹腔的巨噬細胞等。巨噬細胞的分化、增殖和極化依賴于特定的生長因子及其受體。巨噬細胞的表型受到其周圍微環(huán)境的影響，目前已鑒定出兩類極化表型的巨噬細胞：M1和M2表型細胞。M1表型細胞，也被稱為經(jīng)典激活的巨噬細胞，表達iNOS，釋放促炎細胞因子，如TNFα、IL－1b、IL－6和IL－12；而M2型巨噬細胞，即交替激活的巨噬細胞，表達CD206和Arg－1，負責釋放抗炎細胞因子，如IL－10［2］。

巨噬細胞表型與功能活性的這種多樣性和復(fù)雜性，使得巨噬細胞的體內(nèi)生物學(xué)研究存在一定困難。為解決這一問題，近年采用了一種稱為巨噬細胞耗竭的方法來進行研究。巨噬細胞耗竭實際上是一種采用理化或遺傳學(xué)技術(shù)將巨噬細胞去除的方法。這種方法現(xiàn)已廣泛用于研究巨噬細胞在動物疾病模型中的作用和免疫病理或炎癥損傷機制，也開始用于某些疾病模型如移植排異［3］、腸腫瘤［4］和心功能不全［5］等的治療研究。在本文中，主要介紹了近年應(yīng)用較多的幾種巨噬細胞耗竭方法及其在肝損傷中的應(yīng)用。

1 巨噬細胞耗竭方法

1.1 氯膦酸鹽脂質(zhì)體法 脂質(zhì)體是具有雙層磷脂結(jié)構(gòu)的納米級囊泡［6］，生物相容性好，不會引起抗原、熱原、過敏和毒性反應(yīng)，易被生物降解，能夠封裝活性藥物，因此被作為載體廣泛地應(yīng)用于藥物遞送［7］。其中，氯膦酸鹽脂質(zhì)體法是目前最常用的巨噬細胞耗竭方法。

在體內(nèi)，脂質(zhì)體封裝形式的氯膦酸鹽可被巨噬細胞吞噬并攝入細胞內(nèi)，此時細胞內(nèi)的溶酶體磷脂酶會消化磷脂雙層，釋放其中的氯膦酸鹽分子。細胞內(nèi)的氯膦酸鹽達到某一閾值濃度時，可抑制ATP依賴性酶，損害并破壞細胞能量代謝，導(dǎo)致巨噬細胞凋亡［8］。此外，氯膦酸鹽半衰期很短，也難以透過細胞膜，對非吞噬細胞無明顯毒性作用，故通過選擇給藥途徑可以獲得器官特異性的巨噬細胞消耗。例如，皮下注射氯膦酸鹽脂質(zhì)體能夠耗竭小鼠引流淋巴結(jié)中的巨噬細胞［8］；靜脈注射氯膦酸鹽脂質(zhì)體可以耗竭肝臟、脾、骨髓和血液中的巨噬細胞［9］。

脂質(zhì)體包封藥物對巨噬細胞耗竭維持時間較短。肝內(nèi)Kupffer細胞耗盡后，新的Kupffer細胞會在1周左右重新出現(xiàn)［6］。為了達到較長時間去除巨噬細胞的目的，現(xiàn)多采用多次用藥的方式解決。該方法中首次注射脂質(zhì)體封裝的氯膦酸鹽劑量為200μL，之后每隔4 d減量至100μL注射［10］。但是重復(fù)使用可導(dǎo)致中性粒細胞增多、貧血以及促炎因子IL－6和IL－1β的表達增加［11］。

1.2 GdCl3注射方法 GdCl3酸性溶液靜脈注射時在溶酶體中被解離成游離的Gd3＋，這些游離的Gd3＋顆粒能夠被Kupffer細胞吸收并促使其自身凋亡［12］。Bloomer等［13］證實GdCl3可減少巨噬細胞特異性標志物如CD206的表達，并損害肝臟中巨噬細胞的吞噬功能。GdCl3溶液腹腔給藥可以耗盡Kupffer細胞以及靜脈途徑給藥可以抑制巨噬細胞在肝臟的浸潤和活化［14－15］。然而，GdCl3對結(jié)腸黏膜巨噬細胞無明顯的耗竭作用［16］。長期給予GdCl3對肝功能或動物存活的影響很小，這表明它是一種安全的實驗試劑，可為巨噬細胞耗竭提供一種有前途的策略。

1.3 阻斷集落刺激因子－1及其受體（CSF－1/CSF－1R）信號方法 CSF－1是由c－fms基因編碼的巨噬細胞特異性生長因子［17］，主要產(chǎn)生于中性粒細胞、肝星狀細胞、胸腺基質(zhì)細胞、脂肪組織源性和肝源性間皮細胞、成骨細胞和神經(jīng)元［18－20］。巨噬細胞的產(chǎn)生、增殖和存活依賴于CSF－1，并在其細胞表面高水平表達CSF－1R（CD115）。CSF－1能夠通過CSF－1R酪氨酸激酶的自身磷酸化和隨后下游分子的磷酸化來發(fā)揮其生物學(xué)功能。因此，以CSF－1/CSF－1R為靶點的方法也成為巨噬細胞耗竭的一種重要手段。

GW2580是一種選擇性CSF－1R酪氨酸激酶抑制劑，常被用來研究小膠質(zhì)細胞在疾病中的作用。CSF－1能夠與小膠質(zhì)細胞表達的CSF－1R結(jié)合，導(dǎo)致酪氨酸受體激酶二聚化和自磷酸化，并觸發(fā)調(diào)節(jié)生存的ERK和AKT通路的激活。GW2580對小鼠的治療誘導(dǎo)了小膠質(zhì)細胞中增殖相關(guān)轉(zhuǎn)錄和炎癥相關(guān)基因的下調(diào)，這可能是減少脊髓損傷后的神經(jīng)炎癥和促進功能恢復(fù)的原因［21］。除此之外，GW2580還能夠耗竭腎臟、脾臟及腹膜腔的巨噬細胞，但是對循環(huán)中的單核細胞沒有影響［22］。類似地，CSF－1R的小分子抑制劑PLX3397和SU11248也可有效去除巨噬細胞［23－24］。

巨噬細胞特異性基因敲除和點突變模型是全面了解單核吞噬細胞群在宿主組織穩(wěn)態(tài)及病理條件下功能的重要工具。Kupffer細胞是完全依賴于CSF－1的組織駐留巨噬細胞［25］，因此，Csf基因自發(fā)突變小鼠（Csf1op/Csf1op）模型是研究Kupffer細胞在體內(nèi)功能的有效工具。即使是在CSF－1缺失的情況下，巨噬細胞的分化和存活也能由IL－34通過其共同的受體CSF－1R代償［26］，這可能也是相比于Csf1op/Csf1op小鼠，Csf－1r基因敲除小鼠（Csf1r－/Csf1r－）表現(xiàn)出更嚴重的巨噬細胞耗竭的原因［27－28］。

1.4 巨噬細胞耗竭轉(zhuǎn)基因模型 轉(zhuǎn)基因小鼠通過特定方法在其基因組中引入外源DNA，并驅(qū)動表達具有特定功能的基因以達到某種生物學(xué)功能。因此，巨噬細胞耗竭也可以通過轉(zhuǎn)基因動物模型實現(xiàn)?；诎缀矶舅厥荏w（DTR）的轉(zhuǎn)基因小鼠是目前應(yīng)用最多的用于巨噬細胞耗竭的轉(zhuǎn)基因模型。小鼠細胞由于缺乏對白喉毒素（DT）的功能性細胞表面受體，因此對DT具有天然的抵抗力。通過人DTR轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)能夠在體內(nèi)通過DT給藥實現(xiàn)對特定類型的小鼠細胞的有效誘導(dǎo)消融［29］。例如，施用DT使得CD11b－DTR轉(zhuǎn)基因小鼠選擇性地耗盡巨噬細胞及其他髓系細胞如單核細胞、破骨細胞、小膠質(zhì)細胞和樹突狀細胞等［30］。

目前，尚沒有任何理化手段可以達到在不干擾整個單核巨噬細胞系統(tǒng)的情況下選擇性地只耗竭組織駐留的巨噬細胞，因此，研究人員提出了基于細胞特異的基因設(shè)計靶向耗竭組織駐留巨噬細胞的方案。Clec4f是Kupffer細胞特異性表達的基因，參與Kupffer細胞的糖脂呈遞過程［31］。Scott等［32］設(shè)計了基于Clec4f基因的KC－DTR巨噬細胞耗竭模型，旨在排除其他單核巨噬細胞系統(tǒng)細胞耗竭對實驗的影響。不僅如此，由于基因的特異性，該模型還實現(xiàn)了對Kupffer細胞100%的耗竭效率［32］。類似地，Slco2b1－flox/DTR轉(zhuǎn)基因小鼠被設(shè)計用于間質(zhì)巨噬細胞的耗竭［33］。

M2型巨噬細胞由于具有強大的免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用，在過去十年引起了越來越多的關(guān)注。Mrc1是表達于M2亞群的特異性標記基因［29］，因此，Kambara等［2］建立了Mrc1基因啟動子控制下表達人DTR的轉(zhuǎn)基因小鼠。CD206，又稱甘露糖受體，主要表達于M2型巨噬細胞和未成熟樹突狀細胞表面［34］。實驗結(jié)果表明在轉(zhuǎn)基因小鼠上給予DT可以引起CD206陽性細胞的條件性消融，這意味著在體內(nèi)平衡條件下M2極化的巨噬細胞可以被有效地耗盡［2］。

另一個應(yīng)用較為廣泛的轉(zhuǎn)基因模型是Fas誘導(dǎo)巨噬細胞凋亡（macrophage Fas－induced apoptosis，MAFIA）轉(zhuǎn)基因小鼠模型。MAFIA轉(zhuǎn)基因小鼠的巨噬細胞表達在Csf1r啟動子的控制下驅(qū)動自殺基因Fas的表達［35］。轉(zhuǎn)基因插入物包含突變的人FK506結(jié)合蛋白1A（FKBP12），它能夠優(yōu)先結(jié)合小分子耦合物AP20187，激活caspase－8途徑并且使得巨噬細胞Fas結(jié)構(gòu)域交叉連接，從而誘導(dǎo)程序性巨噬細胞凋亡［36］。盡管MAFIA轉(zhuǎn)基因小鼠的脊髓小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞也表達FKBP12，但由于AP20187不能通過血腦屏障，該轉(zhuǎn)基因模型不能用于小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞相關(guān)疾病的研究［37］。

研究［38］表明，MAFIA轉(zhuǎn)基因小鼠巨噬細胞耗竭模型可獲得95%以上的巨噬細胞耗竭效率。目前，該模型所耗竭的巨噬細胞亞型以M2型為主。Bailey等［39］研究表明在巨噬細胞耗竭的MAFIA小鼠中，關(guān)節(jié)內(nèi)巨噬細胞短暫地耗竭顯著增加了M1型巨噬細胞的數(shù)量，M2型巨噬細胞的數(shù)量則呈現(xiàn)下降趨勢。目前對于巨噬細胞耗竭模型中極性變化的機制尚不明了。

2 巨噬細胞耗竭與肝損傷

肝巨噬細胞包括組織駐留巨噬細胞和由趨化因子招募的循環(huán)單核細胞。Kupffer細胞是肝臟駐留的巨噬細胞，是肝臟微環(huán)境中細胞因子和生長因子的主要來源，因此，在調(diào)節(jié)肝臟免疫及炎癥中具有重要作用。Kupffer細胞是肝臟的主要免疫細胞，通過去除該細胞或抑制其功能可以探索其在肝損傷中的作用。

大多數(shù)研究證明，Kupffer細胞耗竭或抑制其功能在肝臟中發(fā)揮保護性作用（圖1）。Schümann等［40］的研究表明，在去除Kupffer細胞的情況下，肝損傷僅限于少數(shù)幾個小壞死區(qū)。Guo等［15］發(fā)現(xiàn)GdCl3處理的小鼠口服氨芐西林可降低門靜脈血中的內(nèi)毒素水平，并減輕肝損傷。Kupffer細胞的早期激活促進了活性氧物質(zhì)和促炎介質(zhì)的形成。GdCl3對Kupffer細胞激活的抑制作用在體內(nèi)肝臟再灌注損傷的大鼠模型中顯示出潛在的肝臟保護作用［41］。

圖1 巨噬細胞耗竭的肝保護作用機制Figure 1 Liver protective mechanisms of macrophage depletion

慢性肝損傷經(jīng)常導(dǎo)致肝星狀細胞的激活和肝纖維化的進展。大量研究［6］證明，抑制Kupffer細胞能明顯降低肝酶活性，改善肝纖維化。因此，Kupffer細胞在與肝纖維化相關(guān)的炎癥中起著關(guān)鍵作用。相關(guān)光電子顯微鏡下可見Kupffer細胞與位于竇周隙的肝星狀細胞相互作用［20］，證明Kupffer細胞在調(diào)節(jié)肝星狀細胞以及促進肝纖維化中具有重要作用。TNFα和IL－1是激活肝星狀細胞的主要細胞因子［20］。研究［40，42］表明，巨噬細胞耗竭能夠顯著降低Kupffer細胞來源的促炎性細胞因子，如IL－1和TNFα的水平，提示Kupffer細胞耗竭通過旁分泌作用調(diào)節(jié)肝星狀細胞，從而改善肝纖維化。LncRNA－H19被證明能夠抑制肝細胞膽汁酸失調(diào)以及激活肝星狀細胞促進肝纖維化［43］。Tian等［44］發(fā)現(xiàn)巨噬細胞耗竭能夠顯著降低肝臟中LncRNA－H19的表達，從而抑制膽管結(jié)扎所誘導(dǎo)的膽汁淤積性肝損傷和纖維化。此外，Pradere等［45］研究發(fā)現(xiàn)，肝巨噬細胞以一種依賴于NF－κB的方式增強肝星狀細胞的存活。相反，體內(nèi)纖維化形成過程中巨噬細胞的耗盡會導(dǎo)致肝星狀細胞中的NF－κB活性受到抑制。

肝臟的纖維間隔存在豐富的膠原和成熟的彈性蛋白。彈性蛋白的降解能夠促進肝纖維化的進展，而MMP－12在調(diào)節(jié)彈性蛋白中具有重要作用。巨噬細胞耗竭實驗［46］表明，巨噬細胞是MMP－12的唯一來源，這提示巨噬細胞可能通過產(chǎn)生MMP－12介導(dǎo)彈性蛋白降解從而加重肝纖維化。CD206作為模式識別受體調(diào)節(jié)巨噬細胞吞噬作用，它能夠內(nèi)化巨噬細胞和肝竇細胞中的膠原蛋白，這在纖維化中起著至關(guān)重要的作用。GdCl3處理后，CD206在小鼠肝臟中的表達下調(diào)，促進CD206陽性細胞的凋亡，從而緩解肝纖維化［47］。

肌成纖維細胞由肝星狀細胞激活后轉(zhuǎn)分化而來，能夠分泌大量細胞外基質(zhì)，是肝纖維化進展的重要環(huán)節(jié)。因此，抗纖維化治療的主要目標之一是開發(fā)一種以成纖維細胞為靶標的藥物遞送系統(tǒng)，以抑制肝纖維化。最新采用膜融合技術(shù)開發(fā)了氯膦酸鹽－尼達尼布（NIN）－外泌體－脂質(zhì)體雜交納米顆粒（CLD/NIN＠LIEV），該方法搭載了靶向成纖維細胞的藥物NIN［6］。細胞外囊泡（EV）是成纖維細胞來源的外泌體，對肝成纖維細胞具有同源歸巢作用，從而增強NIN作用的靶向性。CLD/NIN＠LIEV中的氯膦酸鹽一方面抑制肝臟Kupffer細胞活性，減少Kupffer細胞對納米顆粒的非特異性吞噬作用，進一步增加NIN向成纖維細胞的傳遞；另一方面抑制Kupffer細胞分泌炎性細胞因子，緩解肝臟炎癥及延緩纖維化進展。

目前，M1和M2型巨噬細胞極化已經(jīng)被證明在炎癥和肝損傷的進展中發(fā)揮重要作用，因此利用轉(zhuǎn)基因巨噬細胞耗竭模型實現(xiàn)對特定巨噬細胞亞型的耗竭有利于探索不同亞型巨噬細胞和疾病的關(guān)系。筆者團隊［48］首次提出了“Ces1f可能通過Kupffer細胞M1極化介導(dǎo)急性肝衰竭肝組織炎癥損傷”的假說，因此，采用巨噬細胞耗竭有希望能夠進一步探索Ces1f與肝臟M1型巨噬細胞之間的關(guān)系。

3 小結(jié)

肝巨噬細胞在慢性肝損傷的發(fā)病機制中起著重要作用，并被認為是肝損傷治療的潛在靶點。這些作用包括清除病原體或細胞碎片；在損傷反應(yīng)中釋放抗炎細胞因子；在慢性肝損傷中調(diào)節(jié)非實質(zhì)性肝細胞群及免疫細胞。了解巨噬細胞耗竭促進肝損傷的機制，無論是通過抑制外周單核細胞浸潤，還是通過抑制Kupffer細胞功能或巨噬細胞極化，可能有助于開發(fā)新的針對肝損傷和纖維化的方案。

然而巨噬細胞耗竭中存在一些問題，比如，巨噬細胞耗竭效率難以量化、耗竭的亞型難以確定、耗竭對象不具有特異性即可能會損傷除巨噬細胞外的其他免疫及非免疫細胞。氯膦酸鹽脂質(zhì)體法作為當前應(yīng)用最為廣泛的巨噬細胞耗竭方法，盡管具有經(jīng)濟、制備簡單的優(yōu)點，但其對巨噬細胞耗竭效率差異很大（通常50%～95%），研究結(jié)果的可靠性有待評估［38］。目前，巨噬細胞耗竭作為一種建立模型的方法被應(yīng)用于大量的實驗研究，幾乎所有的方法都有其缺陷，以至于很多相似的實驗得出不同的實驗結(jié)果。實驗結(jié)果的不嚴謹一方面是未選擇符合自身實驗設(shè)計的耗竭方法，另一方面是巨噬細胞耗竭方法本身就具有很多局限性，例如，Csf－1r基因敲除模型中CSF－1R除了能夠在巨噬細胞表達，還能在樹突狀細胞和單核細胞表達［49］。如果不能排除其他免疫細胞對實驗的影響，該方法則不具有嚴謹性。轉(zhuǎn)基因模型能夠基于細胞特異的基因設(shè)計靶向特定巨噬細胞亞型的方案，具有耗竭效率高以及耗竭特異性強的優(yōu)勢，然而轉(zhuǎn)基因小鼠價格昂貴及繁育周期長是實驗設(shè)計需要考慮的重要影響因素。巨噬細胞耗竭方法的主要局限性嚴重阻礙了對巨噬細胞是否真正參與疾病進展的判定。因此，亟需探索出能夠最大程度地減少包含任何潛在混雜因素的巨噬細胞耗竭模型，從而最終確定巨噬細胞在各種疾病發(fā)病機制中的作用。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：于倩負責收集整合文獻資料以及撰寫論文；趙賽負責收集文獻；劉亮明對確定寫作思路及框架具有關(guān)鍵貢獻，并且參與指導(dǎo)撰寫、修改論文以及文章最終定稿。