HCV感染者直接抗病毒藥物治療對miR-181a調(diào)節(jié)CD4+T淋巴細胞衰老相關(guān)指標的影響

李瑞娟，權(quán)會琴，王曉艷，邊培育，葉傳濤，范 超，張 穎，周 云

(空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院傳染科，陜西 西安 710038)

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)會引起慢性丙型肝炎，進而發(fā)展成肝硬化，甚至演變成肝細胞癌。HCV感染后，早期活躍并持續(xù)的CD4+T細胞增殖反應(yīng)能對抗很多HCV蛋白，預(yù)測疾病轉(zhuǎn)歸[1]。研究發(fā)現(xiàn)很多miRNA能調(diào)節(jié)HCV的復(fù)制與疾病發(fā)展和預(yù)后。miRNA可直接作用于HCV RNA，或通過HCV相關(guān)的宿主信號通路來調(diào)節(jié)HCV復(fù)制及疾病進展[2]。本研究小組此前發(fā)現(xiàn)HCV能下調(diào)miR-181a表達，引起雙重特異性磷酸酶6過表達，損害CD4+T細胞功能，導(dǎo)致細胞衰老[3]，還發(fā)現(xiàn)HCV感染相關(guān)的CD4+T細胞衰老可由ΔNp63-miR-181a-SIRT1信號通路對抗調(diào)節(jié)[4]。沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶1(sirtuin1， SIRT1)在HCV感染者CD4+T淋巴細胞上表達增高，但是miR-181a、SIRT1在HCV感染者服用直接抗病毒藥物(direct antiviral agents，DAA)治愈后CD4+T淋巴細胞上的表達情況尚無研究。本研究擬檢測并比較HCV感染者經(jīng)DAA治療前后miR-181a對CD4+T淋巴細胞衰老、負性調(diào)節(jié)因子相關(guān)指標的影響，并探討其臨床意義。

1 對象與方法

1.1 對象

收集在空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院傳染科就診的HCV感染者及治愈者的外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，診斷標準依據(jù)世界衛(wèi)生組織發(fā)布的《2016年歐洲肝病學(xué)會丙型肝炎治療指南》[5]。實驗分為HCV感染未治療組(HCV組，26例)、HCV治愈組(22例)、健康對照組(20例)，入組標準及治療方案同本實驗室之前設(shè)計方案[6]。具體HCV組入組標準為HCV RNA和抗-HCV陽性6個月以上，年齡大于18歲，排除其他噬肝病毒患者、肝癌患者及自身免疫性肝病患者；HCV治愈組入組標準為慢性丙型肝炎患者完成12周抗病毒治療，達到病毒學(xué)應(yīng)答，HCV RNA均低于檢測下限，肝功能指標ALT、AST正常，治療采用索磷布韋聯(lián)合達卡他韋方案。本研究經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(許可證號：TDLL-2016142)，并與患者及健康對照者簽署知情同意書。

主要試劑：用于磁珠分選細胞的CD4+T淋巴細胞分離試劑盒購自德國美天旎公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)試劑盒購自德國Qiagen公司；miR-181a引物、P53、P21引物購自上海生工公司；hsa-miR-181a-5p和SIRT1基因雙熒光素酶檢測由上海生工公司提供；流式抗體CD3、CD4、CD57、SIRT1等購自美國BD公司；RPMI1640、OPT-MEM Ⅰ 培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR 使用CD4+T淋巴細胞分離試劑盒將CD4+T淋巴細胞從PBMC中分離，用TRIzol提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過qRT-PCR檢測各組miR-181a，SIRT1、P53、P21mRNA的表達水平。其中miR-181a以U6為內(nèi)參基因，SIRT1以GAPDH為內(nèi)參基因，P53、P21以β-actin為內(nèi)參基因，引物設(shè)計如表1。qRT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；進入循環(huán)95 ℃ 10 s，60 ℃ 5 s，共循環(huán)42次；60 ℃ 5 s，65 ℃ 5 s，95 ℃ 30 s。生成擴增曲線及熔解曲線，得出Ct值，采用2-ΔΔCt算法計算各目的基因表達量與內(nèi)參基因進行標準化，得到各基因的相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.2 雙熒光素酶報告基因檢測 準備好用于轉(zhuǎn)染的293T細胞和目的質(zhì)粒，將10 μL DMEM與0.16 μg的h-SIRT1質(zhì)粒以及5 pmol的 hsa-miR-181a/Negative Control充分混勻后室溫放置(溶液A)，將10 μL DMEM與0.3 μL的轉(zhuǎn)染試劑(濃度為0.8 g/L)充分混勻(溶液B)，將溶液A與B充分混勻，室溫放置20 min。將轉(zhuǎn)染混合物加入細胞并混勻，37 ℃，50 mL/L CO2條件下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染6 h后換新鮮培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，用Promega Dual-Luciferase系統(tǒng)檢測。以96孔板每孔100 μL的量加入裂解液，室溫搖床上緩慢搖15 min，將細胞裂解液吸至1.5 mL離心管，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清移入新管；96孔板中加入Luciferase Assay Reagent Ⅱ 工作液100 μL；加入20 μL細胞裂解液，測定記錄Firefly luciferase值，此值為內(nèi)參值。加入100 μL Stop & Glo?Reagent，測定記錄Renilla luciferase值，此即為報告基因發(fā)光值，Renilla luciferase值/Firefly luciferase值為熒光素酶相對活性。

1.2.3 流式細胞術(shù) Ficoll-Pague密度梯度離心法分離PBMC，洗滌后加入CD3、CD4、CD57、程序性死亡受體1(programmed death-1，PD-1)表面抗體，4 ℃避光孵育30 min后洗滌，1 500 r/min離心5 min 后棄上清。SIRT1、T細胞免疫球蛋白黏蛋白-3(T cell immunoglobulin and mucin domain 3，TIM-3)為胞內(nèi)染色，用Inside Stain Kit中的固定液4 ℃固定30 min，1 500 r/min離心5 min后棄上清；加破膜液180 μL，1 500 r/min離心5 min后棄上清。加50 μL破膜液，加SIRT1、TIM-3抗體，室溫避光孵育30 min，1 500 r/min離心5 min后棄上清，加流式緩沖液，上機檢測。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 利用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計分析，GraphPad Prism 8.3軟件作圖，計量資料以ˉx±s表示，計量資料多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Bonferroni法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組人群PBMCs中CD4+T淋巴細胞計數(shù)

流式細胞儀檢測各組人群PBMCs中CD4+T淋巴細胞的水平，3組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.46，P=0.63；圖1)。

圖1 各組人群PBMCs中CD4+T淋巴細胞計數(shù)

2.2 CD4+T淋巴細胞上miR-181a、SIRT1、P53及P21的表達情況

采用qRT-PCR檢測3組人群CD4+T淋巴細胞上miR-181a，SIRT1、P53、P21mRNA的表達水平，每組8例。結(jié)果顯示，miR-181a表達倍數(shù)變化在3組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=7.59，P<0.01)，HCV治愈組及HCV組miR-181a表達水平較健康對照組明顯下降(P<0.01，圖2A)。SIRT1mRNA表達倍數(shù)變化在3組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9.69，P<0.01)，HCV治愈組及HCV組SIRT1mRNA表達水平較健康對照組明顯上升(P<0.05，P<0.01，圖2B)。P53mRNA表達倍數(shù)的變化在3組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=6.53，P<0.01)，HCV治愈組及HCV組P53mRNA表達水平較健康對照組明顯下降(P<0.05，圖2C)。P21mRNA表達倍數(shù)變化在3組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=27.02，P<0.01)，HCV組及HCV治愈組P21mRNA表達水平較健康對照組明顯下降(P<0.01，圖2D)。

A：miR-181a表達倍數(shù)變化，HCV治愈組及HCV組較健康對照組下降；B：SIRT1 mRNA表達倍數(shù)變化，HCV治愈組及HCV組較健康對照組上升；C：P53 mRNA表達倍數(shù)變化，HCV治愈組及HCV組較健康對照組下降；D：P21 mRNA表達倍數(shù)變化，HCV治愈組及HCV組較健康對照組下降。 aP<0.05， bP<0.01 vs健康對照組。圖2 CD4+T淋巴細胞上miR-181a，SIRT1、P53及P21 mRNA的表達水平

2.3 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CmiR-181a靶向調(diào)控SIRT1的表達

圖3A為hsa-miR-181a與h-SIRT1靶位點結(jié)合示意圖，圖3B顯示hsa-miR-181a與h-SIRT1-wt共培養(yǎng)，可顯著下調(diào)熒光素酶的活性(P<0.01)，h-SIRT1突變后這種下調(diào)作用消失，說明兩者間存在靶向調(diào)控作用。

A：hsa-miR-181a與h-SIRT1靶位點結(jié)合示意圖；B：hsa-miR-181a顯著下調(diào)h-SIRT1的熒光的表達。 bP<0.01。圖3 miR-181a靶向調(diào)控SIRT1的表達

2.4 CD4+T淋巴細胞上SIRT1、CD57、PD-1、TIM-3的表達水平

流式細胞儀檢測健康對照組(n=12)、HCV治愈組(n=15)、HCV組(n=18)3組人群CD4+T淋巴細胞上SIRT1、CD57、PD-1、TIM-3表達水平。SIRT1在3組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=10.60，P<0.01)，與健康對照組相比，HCV組SIRT1表達水平明顯升高(P<0.01)，經(jīng)治療后，HCV治愈組表達水平下降，但與HCV組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，HCV治愈組與健康對照組比較，SIRT1的表達水平顯著升高(P<0.05，圖4A)。CD57在3組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖4B)。PD-1表達水平在3組間有統(tǒng)計學(xué)差異(F=5.31，P<0.01)，其中與健康對照組相比，PD-1在HCV組明顯升高(P<0.01)，經(jīng)治療后略有下降，HCV治愈組和健康對照組、HCV組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(圖4C)。TIM-3在3組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=11.33，P<0.01)，與健康對照組相比，TIM-3在HCV組(P<0.01)、HCV治愈組(P<0.01)升高，HCV治愈組和HCV組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(圖4D)。

A：CD4+T淋巴細胞上SIRT1的表達，HCV治愈組及HCV組較健康對照組上升；B：CD4+T淋巴細胞上CD57的表達，3組間無統(tǒng)計學(xué)差異；C：CD4+T淋巴細胞上PD-1的表達，HCV治愈組及HCV組較健康對照組上升；D：CD4+T淋巴細胞上TIM-3的表達，HCV治愈組及HCV組較健康對照組上升。 aP<0.05， bP<0.01 vs健康對照組。圖4 CD4+T淋巴細胞上SIRT1、CD57、PD-1、TIM-3的表達水平

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)CD4+T細胞衰竭是慢性HCV感染的標志，HCV特異性CD4+T細胞在早期消退和持續(xù)感染期間表型相似，分泌類似水平的細胞因子。然而，持續(xù)的病毒血癥驅(qū)動T細胞激活和PD-1、細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)蛋白4的表達，阻斷T細胞分化[7]。另有研究分析參與DAA臨床試驗的HCV患者的外周先天和適應(yīng)性免疫細胞群及T淋巴細胞上趨化因子受體的表達。在開始治療1～2周內(nèi)，外周血CD4+T和CD8+T淋巴細胞的濃度顯著升高，單核細胞和自然殺傷細胞的濃度無明顯升高。同時具有活化表型(人類白細胞抗原HLA-DR+和CD38+)的CD4+和CD8+T淋巴細胞的百分比下降，這些變化在治療過程中不能持續(xù)，治療結(jié)束后恢復(fù)到治療前水平[8]。有研究觀察到HCV特異性CD4+T細胞的頻率在DAA治療后2周內(nèi)增加，雖然Th1表型的細胞在基線時是主要的亞群，但具有濾泡T輔助細胞表型和轉(zhuǎn)錄特征的細胞逐漸形成了循環(huán)的CD4+T細胞庫，同時伴隨HCV特異性中和抗體和生發(fā)中心活性的下降[9]。本實驗檢測發(fā)現(xiàn)DAA治療前后，CD4+T淋巴細胞計數(shù)在健康對照組、HCV組、HCV治愈組3組人群中并無差異。這可能與HCV感染者收集PBMC時沒有按第2、4、8周等時間節(jié)點收集有關(guān)，尤其是沒有獲取到治療早期第2周的CD4+T細胞數(shù)據(jù)。與文獻[8]相一致的是，CD4+T淋巴細胞計數(shù)在HCV感染者DAA治療前后并無差異。

Sirtuin蛋白是高度保守的組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶，具有廣泛功能，包括調(diào)控轉(zhuǎn)錄、細胞周期、細胞分化、凋亡、應(yīng)激、代謝和基因組穩(wěn)定性[10]。SIRT1對多種免疫性、腫瘤性及感染性疾病具有顯著影響，且在衰老細胞中表達減少[11]。有研究報道HCV core蛋白能抑制HepG2細胞凋亡，誘導(dǎo)SIRT1mRNA和蛋白水平升高，而敲除SIRT1細胞凋亡依舊[12]。我們此前證明HCV慢性感染者外周血CD4+T細胞上miR-181a水平下調(diào)，抗衰老蛋白SIRT1上調(diào)，過表達miR-181a能下調(diào)SIRT1蛋白的表達水平。我們推測HCV感染能抵抗細胞衰老，但是細胞功能下降，不能有效清除HCV，導(dǎo)致HCV感染慢性化[3]。在本研究中，我們進一步證明了miR-181a能結(jié)合SIRT1的3′非翻譯區(qū)，抑制SIRT1表達(圖3)，這與文獻[13]一致。本研究中HCV組與健康對照組相比，外周CD4+T淋巴細胞上miR-181a下降、SIRT1mRNA表達上升，經(jīng)過治療，HCV治愈組miR-181a依然下降(圖2A)，且與健康對照組有統(tǒng)計學(xué)差異；HCV治愈組SIRT1表達無論是mRNA水平(圖2B)還是蛋白水平(圖4A)均下降，但與HCV組相比無統(tǒng)計學(xué)意義，而與健康對照組有顯著性差異。提示HCV感染者經(jīng)DAA藥物治愈后，CD4+T細胞的衰老及功能并未完全恢復(fù)，miR-181a下降，導(dǎo)致SIRT1上升，引起P53、P21的下降。

抑癌基因P53通過引起細胞周期阻滯和細胞凋亡來維持基因組的穩(wěn)定性，P53的乙?；诩毎ダ现衅痍P(guān)鍵作用。SIRT1蛋白可使P53去乙酰化，削弱P53的作用，進而減少凋亡并延長細胞壽命[14]。P21是P53的靶基因，P21蛋白的過表達可導(dǎo)致細胞周期阻滯，并出現(xiàn)一系列衰老征象[15]。有研究發(fā)現(xiàn)慢性HCV感染者中，CD4+T淋巴細胞的端粒長度越短，與肝硬化進展、臨床預(yù)后不佳越相關(guān)[16]。本研究小組此前也發(fā)現(xiàn)HCV組比健康對照組的CD4+T淋巴細胞端粒長度更短，衰老細胞更多，然而SIRT1的表達比健康對照組更高[3]。HCV組及HCV治愈組CD4+T淋巴細胞上P53、P21水平較健康對照組下降。推測在HCV感染后，外周循環(huán)CD4+T淋巴細胞衰老，導(dǎo)致SIRT1反應(yīng)性增高，抑制P53、P21的表達，HCV治愈后，CD8+T淋巴細胞衰老狀態(tài)部分恢復(fù)，但與健康對照組仍有差異(圖2B～D)。

有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)HCV特異性CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞高表達PD-1、CD57，且與血漿中HCV病毒載量的水平呈正相關(guān)[17]。但在本實驗中衰老標志分子CD57在3組間無統(tǒng)計學(xué)差異，且在HCV組、HCV治愈組的CD8+T細胞上表達也無差異[6]。本研究中HCV組與健康對照組相比，外周CD4+T淋巴細胞上PD-1、TIM-3表達水平上升，經(jīng)治療后，HCV治愈組PD-1表達水平與健康對照組無統(tǒng)計學(xué)差異，TIM-3表達雖有所下降，但仍比健康對照組高(圖4)。持續(xù)性HCV病毒血癥導(dǎo)致PD-1持續(xù)上調(diào)[7]，有實驗[18]分析慢性HCV感染者T淋巴細胞的耗竭狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)PD-1在HCV肽刺激的CD4+T淋巴細胞上表達上升且有統(tǒng)計學(xué)差異，TIM-3在HCV肽刺激的CD4+T淋巴細胞上表達上升，但無統(tǒng)計學(xué)差異。該研究認為慢性HCV感染導(dǎo)致CD4+T和CD8+T淋巴細胞功能耗竭，病毒持續(xù)感染。本研究提示，HCV組經(jīng)DAA治療后，CD4+T淋巴細胞功能部分恢復(fù)，PD-1降至與健康對照組無差異，但TIM-3仍比健康對照組高。

綜上所述，本研究分析了miR-181a調(diào)節(jié)HCV感染者DAA治療前后CD4+T淋巴細胞衰老相關(guān)指標的變化。發(fā)現(xiàn)HCV組比健康對照組的CD4+T淋巴細胞衰老水平更高，miR-181a水平降低，SIRT1蛋白表達水平升高。經(jīng)過DAA治療，獲得持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答后，HCV治愈組CD4+T細胞上miR-181a表達水平仍與健康對照組有差異；SIRT1蛋白表達水平下降，但與健康對照組仍有差異。HCV組和HCV治愈組的P53、P21表達與健康對照組相比均降低，而HCV治愈組和HCV組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。HCV感染者CD4+T淋巴細胞上PD-1、TIM-3表達水平升高，經(jīng)DAA治療后PD-1、TIM-3表達下降，細胞衰老部分緩解，細胞免疫耗竭功能部分恢復(fù)。