奶牛蹄皮炎關聯微生物群落結構及多樣性分析

李鑌罡 ，肖海俠 ，艾柯代·吐魯洪 ，楊學云 ，馬萬鵬 ，劉璐瑤 ，蘇戰(zhàn)強 ，3*

（1.新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，烏魯木齊 830052；2. 新疆畜牧科學院獸醫(yī)研究所，烏魯木齊 830011；3. 新疆草食動物新藥研究與創(chuàng)制重點實驗室，烏魯木齊 830052）

奶牛蹄病是各種蹄病的總稱，發(fā)生在奶牛的四肢，包括蹄皮炎、蹄葉炎、白線病和蹄底潰瘍等。牛蹄病是規(guī)?；鲎畛Ｒ娗椅：^嚴重的疾病之一，除了導致奶牛跛行，蹄病還會對牛只的生產、繁殖及行為造成影響，同時還會降低動物福利，繼而直接或間接的造成經濟損失，有調查表明每一頭患蹄病的奶牛在整個泌乳期可造成0.114 ～0.320 萬元的損失[1'2]，有些牛場因蹄病造成的經濟損失甚至超過其養(yǎng)殖成本的一半。奶牛蹄皮炎是指蹄后跟系部皮膚出現潰爛與炎癥并在病灶周圍形成白色邊緣伴有長毛發(fā)狀或其周邊附著較厚的多毛性疣。 奶牛蹄皮炎是一種細菌性疾病，當?；继闫ぱ讜r，患處表現為有腐敗氣味，表皮增厚和腫脹，高發(fā)于牛蹄系部于指間（趾），蹄底皮膚過度角質化，如果未能及時發(fā)現該病，患處則會破潰脫落出血，導致創(chuàng)面暴露于環(huán)境中，繼發(fā)深層感染，且會有分泌物滲出，四肢的指（趾）間和系部均可發(fā)病，有時形成結痂[3]。發(fā)病奶牛大多體溫正常，跛行程度因嚴重性而表現不一。奶牛蹄皮炎發(fā)病機理十分復雜，引起奶牛蹄皮炎的因素多種多樣，其中包括管理因素[4'5]、生理因素[6]、行為因素[7]、遺傳因素[8，9]等。

在前期的調查中新疆烏魯木齊周邊地區(qū)的奶牛蹄病以蹄皮炎為主，占蹄病的88.24%，傳統(tǒng)的微生物分離鑒定方法存在一些局限性， 有許多的細菌在樣本中含量相對較少或難以制造某些細菌的生長環(huán)境，導致無法培養(yǎng)或生長發(fā)育不良[10]。 如果不能將全部細菌分離鑒定，便不能全面的反應樣本中的菌群分布情況，因此需借助高通量測序技術對奶牛蹄部腐肉樣本中的菌群進行多樣性的分析，為以后的研究提供數據參考。 本研究采集奶牛蹄皮炎樣本和健康奶牛蹄樣本，通過Ⅰllumina NovaSeq 二代測序技術研究其微生物的菌落結構，分析奶牛蹄皮炎樣本中的菌落組成，為奶牛蹄皮炎的防控提供更全面的理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

NanoDrop ND-1000 分光光度計，美國Thermo 公司；高速冷凍離心機，德國賽多利斯公司；PCR 儀，美國Thermo 公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集與處理

從新疆昌吉地區(qū)某2 個規(guī)?；膛觯ˋ，B）采集健康奶牛蹄樣本和奶牛蹄皮炎樣本各10 份，其中5份為 A 場奶牛蹄皮炎樣本（A_FR1、A_FR2、A_FR3、A_FR4、A_FR5）、5 份為 A 場健康牛蹄部樣本（A_JK1、A_JK2、A_JK3、A_JK4、A_JK5）、5 份為 B 場蹄部腐肉樣本（B_FR1、B_FR2、B_FR3、B_FR4、B_FR5）、5 份為B 場健康牛蹄部樣本（B_JK1、B_JK2、B_JK3、B_JK4、B_JK5）。采樣前使用生理鹽水將患蹄表面糞污沖洗干凈，使用消毒后的修蹄刀暴露患處，用消毒后的剪刀采集蹄皮炎腐肉并使用滅菌棉簽蘸取健康蹄部拭子，分別放于高壓處理后的5 mLEP 管低溫保存，將樣品標記后迅速送回實驗室進行檢測。

1.2.2 16S rRNA 基因 V3-4 區(qū)的 PCR 擴增

使用離心機將樣品1 200 rpm／min 離心3 min，對樣本使用基因組DNA 試劑盒提取基因組模板，提取步驟參照說明書。 使用分光光度計與1.2%瓊脂糖凝膠電泳對提取的DNA 模板進行質量檢測， 并調整DNA 濃度。 DNA 質量達標后使用引物 338F-806R （338F:5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3''806R:5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對細菌 16S rRNA 基因 V3-V4 區(qū)的 PCR 擴增[11]。 反應程序：98 °C，2 min ＋（98 °C，15 s ＋ 55 °C，30 s ＋ 72 °C，30 s）× 25 ＋ 72 °C，5 min。 將合格的 PCR 產物進行回收，并使用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit 分析試劑盒對其進行定量檢測， 將PCR 產物委托上海派森諾生物技術有限公司的Illlumina NovaSeq6000 測序平臺進行測序。

1.2.3 生物信息學分析

使用Qiime （1.9.1） 軟件對測序獲得的原始數據進行拼接、 過濾與去嵌合體， 得到有效序列。 調用UCLUST 將有效序列按97%的序列相似度歸類和可操作分類單元劃分，并在結果中篩選豐度較高的可操作分類單元，選為代表序列。 使用Greengenes 數據庫（Release 13.8）將可操作分類單元進行查詢比對，將其進行物種注釋，并統(tǒng)計樣本在不同分類水平的豐度情況。 對可操作分類單元的序列數進行稀疏曲線分析 。 使 用 Qiime 軟 件 計 算 各 樣 本 的 Chao1、Faith-pd、Good coverage、Shannon、Simpson、Pielou-e 和Observed species 多樣性指數，并根據Bray-Curtis 距離算法使用R 語言得到Beta 多樣性距離矩陣。 使用UPGMA 的加權平均法對樣本中屬水平豐度靠前的菌群進行聚類分析，并對其繪制熱圖。

2 結果與分析

2.1 Alpha 多樣性分析

本研究通過計算 Chao1、Faith-pd、Good coverage、Shannon、Simpson、Pielou-e 和 Observed species 多樣性指數對A 和B 兩牛場中奶牛蹄皮炎樣本和健康奶牛蹄樣本進行Alpha 多樣性分析， 結果如圖1 所示，A 牛場奶牛蹄皮炎樣本于健康蹄樣本和B 牛場奶牛蹄皮炎樣本于健康蹄樣本各個指數均值差異性均顯著（P < 0.05），且各個樣本的Coverage 值范圍為0.9430 ～0.9966，表明測序基本覆蓋到了全部的OUT 數據，可反映樣本的真實情況。

圖1 A_FR、B_FR、A_JK 和 B_JK 組樣本群落 Alpha 多樣性指數

2.2 Beta 多樣性分析

通過主坐標分析（Principal coordinate analysis，PCoA)發(fā)現A 牛場蹄皮炎樣本和A 牛場健康奶牛蹄樣本之間及B 牛場蹄皮炎樣本和B 牛場健康奶牛蹄樣本之間聚集在一起的微生物群落結構差異度較大，見圖2。 PERMANOVA 差異檢驗分析表明A 牛場蹄皮炎樣本組和A 牛場健康奶牛蹄樣本組、B 牛場蹄皮炎樣本組和B 牛場健康奶牛蹄樣本組、A 牛場蹄皮炎樣本組和B 牛場蹄皮炎樣本組菌群結構差異顯著（P<0.05）；A 牛場健康奶牛蹄樣本組和B 牛場健康奶牛蹄樣本組菌群結構差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 A 牛場奶牛蹄皮炎樣本組、B 牛場奶牛蹄皮炎樣本組、A 牛場健康奶牛蹄樣本組和B 牛場健康奶牛蹄樣本組菌群的PCoA

2.3 在門分類水平上的細菌組成

利用QIIME 軟件分析犢牛肺炎樣本和健康樣本在門分類水平上豐度前10 個物種。 結果表明，在奶牛蹄皮炎腐肉樣本中，A 場的優(yōu)勢菌分別為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和梭桿菌門（Fusobacteria） 等；B 場中的優(yōu)勢菌分別為厚壁菌門 （Firmicutes）、 擬桿菌門 （Bacteroidetes）、 變形菌門（Proteobacteria）、螺旋體（Spirochaetes）等。 A 場和 B 場相比，梭桿菌門（Fusobacteria）在 A 場的樣本中被檢出，而螺旋體（Spirochaetes）僅在A 場的A_FR1、A_FR5 中檢出但豐度最高僅為1.74%。 B_FR1 中擬桿菌門的豐度為75.03%，在樣品中豐度值最高。 健康牛蹄部樣本中優(yōu)勢菌群為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）；厚壁菌門（Firmicutes）在健康牛蹄部樣本中豐度均高于64.10%，其次為擬桿菌門（Bacteroidetes），且豐度均高于12.90%。 蹄部腐肉樣本于健康樣本相比，A 場的梭桿菌門（Fusobacteria）于B 場的螺旋體（Spirochaetes）豐度均高于健康樣本，見圖3。

圖3 樣本中細菌門分類水平的比較

2.4 在屬分類水平上的細菌組成

利用QIIME 軟件分析奶牛蹄部腐肉樣本和健康牛蹄部樣本在屬分類水平上豐度較高的前10 個物種。 結果如圖4， 在A 牛場奶牛蹄部腐肉樣本中優(yōu)勢菌群為梭桿菌屬 （Fusobacterium）、 卟啉單胞菌屬（Proteobacteria）； 在B 牛場中奶牛蹄部腐肉樣本中優(yōu)勢菌群為密螺旋體 （Treponema）、 卟啉單胞菌屬（Proteobacteria）；A 場和B 場奶牛蹄部腐肉樣本中的主要菌群分別為梭桿菌屬（Fusobacterium）、密螺旋體（Treponema）、卟啉單胞菌屬（Porphyromonas）等。 在 A 場樣本中，A_FR1、A_FR2、A_FR3 中豐度最高的菌群為梭桿菌屬（Fusobacterium），分別占總細菌數的 15.04%、58.60%、16.93%，在 A_FR4、A_FR5 中，豐度最高的菌群為啉單胞菌屬 （Proteobacteria）， 分別占8.43%、9.11%。 不同于A 場，B 場中大量存在梭桿菌屬（Fusobacterium），而 A 場中大量存在密螺旋體（Treponema）。

圖4 細菌屬分類水平的比較

2.5 物種組成熱圖分析

使用平均豐度前10 位的屬的豐度數據繪制熱圖。 結果如圖5 所示，熱圖橫、縱坐標分別為不同樣本編號和豐度前10 的菌屬名稱。 圖中色塊顏色越深，代表樣本中該屬細菌豐度高于其他樣本；色塊顏色越淺，代表樣本中該屬細菌的豐度低于其他樣本。 結果顯示在屬水平上A 和B 兩牛場奶牛蹄皮炎樣本與健康牛蹄樣本前10 位物種的豐度差異較大。 梭桿菌屬（Fusobacterium）、密螺旋體（Treponema）與卟啉單胞菌屬 （Porphyromonas） 等在奶牛蹄皮炎樣本中豐度較高， 而費克藍姆菌屬 （Facklamia）、 異位線蟲（Atopostipes）與厭氧球菌屬（Anaerococcus）豐度較高。

圖5 物種聚類的屬水平物種組成熱圖

3 討 論

奶牛蹄皮炎是一種細菌病[12]，可導致奶牛的跛行，引起炎癥反應及皮膚損傷，使得奶牛在行走或站立時疼痛，進而使得奶牛采食量下降和泌乳量降低等情況出現，造成經濟損失。 Burger 等人研究表明，奶牛27%的經濟虧損都是由蹄病造成的[13]。另有調查顯示，每頭患蹄皮炎的奶牛損失的總成本（治療成本、產奶量下降成本）為1990 元左右[14]。 現如今對奶牛蹄皮炎的病因及傳播機制尚不明確，但隨著基因測序等實驗室技術的發(fā)展，奶牛蹄皮炎的相關病原菌和疾病傳播機制也在慢慢被揭開。 曾有多位學者在本病樣本中分離出多種細菌，尤其是密螺旋體[15]。 此外，有報道稱本病相關細菌難以使用培養(yǎng)基培養(yǎng)，且難以建立感染模型[16～18]。 因此，本次研究利用高通量測序技術對奶牛蹄皮炎樣本和健康奶牛蹄樣本進行檢測，可對“無法培養(yǎng)”的微生物進行測序，檢測奶牛蹄病樣本中微生物群落結構的多樣性。資料顯示，我國使用高通量測序技術對奶牛蹄病的微生物多樣性檢測的案例很少。 在本試驗中，提供了我國新疆地區(qū)牛場中蹄皮炎腐肉樣本中的數據信息，為將來對奶牛蹄病的防控措施的制定及治療時的藥物選擇提供了參考。 本次試驗結果表明，患蹄病的奶牛蹄部腐肉處菌群多樣性在不同細菌分類水平均上升，蹄病腐肉中的菌群結構更復雜。 王德海對齊齊哈爾市某規(guī)?；鲋心膛Ｌ闫ぱ撞≡⑸锒鄻有赃M行檢測，結果發(fā)現樣本中優(yōu)勢菌門為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）等，但未發(fā)現螺旋體（Spirochaetes）的存在，這一結果可能是因為不同地區(qū)奶牛蹄皮炎的流行情況不同[19]。 本次實驗結果發(fā)現，奶牛蹄皮炎中的菌門分布情況與大多數哺乳動物腸道內優(yōu)勢菌門相似[20'21]，因此，部分奶牛蹄病的一些致病菌可能來自于奶牛腸道中的細菌。 如果及時清理牛場圈舍中的糞污，可能會減少牛蹄與致病菌的接觸時間，減少發(fā)病幾率。 但與腸道菌群不同的是，擬桿菌門（Bacteroidetes）的比例會上升，厚壁菌門（Firmicutes）與擬桿菌門（Bacteroidetes）的比例失調可能是引起蹄病的原因也可能是發(fā)生蹄病后的癥狀，還需要進一步研究。

密螺旋體一直被認為是導致奶?；继闫ぱ椎闹饕≡⑸?， 并且在受感染的奶牛所在牛場的奶牛糞便及環(huán)境樣本中檢測到密螺旋體[15'22]。 本次實驗中，在A、B 牛場均檢出螺旋體（Spirochaetes），試驗結果與之相符。 A 牛場與B 牛場采集的奶牛蹄皮炎樣本中菌群分布有所差異，A 場和B 場相比，梭桿菌門（Fusobacteria）僅在A 場的樣本中被檢出，而螺旋體（Spirochaetes）僅在 A 場的 A_FR1、A_FR5中檢出但豐度最高僅為1.74%，可能是由于牛場環(huán)境不同，導致不同牛場中奶牛蹄部患處的細菌分布也存在差異。 A、B 兩牛場健康牛蹄部樣本的細菌分布與豐度相似， 該結果表明兩牛場中環(huán)境均分布情況相似。

奶牛蹄皮炎的發(fā)生與多種細菌有關。 在屬分類水平上，A 牛場中的梭桿菌屬（Fusobacterium）豐度上升，壞死梭桿菌屬于梭桿菌屬（Fusobacterium），該菌侵染力不強，但可以輕易的侵入受傷的皮膚組織，會使組織出現濃腫和腐臭氣味，這與先前在牛場采樣時患病奶牛癥狀相符，因此梭桿菌屬（Fusobacterium）豐度值的上升可能是部分蹄病的癥狀之一；B 牛場中的密螺旋體（Treponema）豐度值高于該場健康蹄部樣本，最高可達29.43%，有學者認為，奶牛蹄皮炎是由密螺旋體導致的[15]，密螺旋體的豐度值的升高也與其相互驗證。當奶牛發(fā)生蹄皮炎時，菌群的多樣性降低，1 種或多種細菌的豐度增高。但在研究中發(fā)現，不同奶牛場中豐度增高的菌群存在差異，但厚壁菌屬起主導作用，可能與牛場環(huán)境有關。

4 結 論

奶?；继闫ぱ缀?，患處腐肉菌群多樣性及豐度明顯升高。 不同牛場蹄皮炎患處樣本中厚壁菌門豐度較高，但不同牛場中還有其它不同菌門上升。當奶牛患蹄皮炎后患處腐肉菌群失調，菌群結構分布以及豐度變化與奶牛蹄皮炎的發(fā)生存在密切關聯。