動物布魯氏菌病血清學檢測方法的比較

楊 康，楊夷平，古麗巴哈·哈德爾，阿達來提·尤素甫，段進剛，何 波，方先珍*

（1.哈密市動物疫病預防控制中心，新疆 哈密 839000；2.伊州區(qū)動物疫病預防控制中心，新疆 哈密 839000）

布魯氏菌?。˙rucellosis，簡稱布病）是由布魯氏菌引起的一種人畜共患病，對人和動物的生殖、神經和骨骼系統(tǒng)可以造成嚴重損害，在我國屬于二類動物疫病。 動物主要感染牛、羊、豬、狗，近幾年來在牛羊中流行呈現(xiàn)增長趨勢，嚴重威脅公共衛(wèi)生安全和畜牧業(yè)健康發(fā)展[1～3]。 因此，如何能快速、準確的對該病進行實驗室檢測，對做好該病的動物疫病預防工作至關重要。目前，市場上流通的布病血清學檢測試劑盒種類較多，各有優(yōu)缺點：虎紅平板凝集試驗操作簡單，但試驗結果受反應溫度和時間的影響，不易判定，大多數(shù)下用于樣品的初篩；試管凝集試驗是我國診斷布魯氏菌病的金標準，但該方法操作起來繁瑣、復雜、費時，不易現(xiàn)場操作；熒光偏振試驗操作簡單、反應時間短，準確率高，是OIE 貿易規(guī)定的試驗方法，但該方法使用的診斷儀器和診斷試劑費用比較高；ELISA 試驗操作簡便、快速、樣品需求量小，但該方法對實驗條件和設備要求比較高，不便在基層使用[4～6]。如何能結合實際情況，篩選出檢測速度快、準確性高、價格適宜、能指導生產的檢測試劑盒值得我們去探討與研究。 本文針對虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗、熒光偏振試驗、競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗5 種常規(guī)血清學檢測方法進行了比較分析，為今后開展布魯氏菌病診斷技術提供了一定參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本

收集哈密市域內近幾年陸續(xù)送檢的未經免疫的陽性血清151 份，陰性血清21 份，總計172 份。

1.1.2 檢測試劑

布魯氏菌菌病虎紅抗原；試管凝集抗原、陰性血清、陽性血清；ELISA 檢測試劑盒；熒光偏振檢測診斷試劑盒。

1.1.3 主要儀器

酶標儀；洗板機；恒溫培養(yǎng)箱；熒光偏振儀。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法

RBT、SAT 試驗按照GB／T 18646-2018 動物布魯氏菌病診斷技術操作及結果判定；FPA 和ELISA 試驗按照檢測試劑盒的說明書進行操作及結果判定。

1.2.2 評價方法

在進行不同的試驗方法比較時，利用Excel 將檢測結果進行統(tǒng)計，并形成表1，對檢測結果進行比較。并參照該表計算出：敏感性=（A／P1）×100%、特異性=（D／N1）×100%、假陽性率=（B／N1）×100%、假陰性率=（C／P1）×100%、一致性（符合率）=[（A＋D）／S]）×100%，用這些指標比較不同診斷試劑的診斷效果[7]。

表1 診斷試驗與參比試驗結果比對表

2 結果與分析

2.1 檢測結果的比較

將收集的 172 份樣品，用 RBT、SAT、FPA、cELISA、iELISA 進行檢測，并以國標 GB／T 18646-2018 中的SAT 檢測方法為參照，將各檢測方法的檢測結果錄入到Excel 表格中，對數(shù)據進行整理得到表2。

表2 SAT 檢測結果與FPA、cELISA、iELISA 檢測結果的比較

續(xù)上表

2.2 不同診斷方法的效果評價

根據公式，計算出各診斷方法的一致性、敏感性與特異性，其中RBT 的敏感性最高，為100%；FPA 的特異性最高，為74.51%；FPA 的假陽性率最低，為25.49%，RBT 的假陰性率最低，為0；各診斷試驗的符合率由高到低依次為RBT、FPA、cELISA、iELISA，具體結果見表3。

表3 不同診斷方法的效果評價

2.3 SAT 與FPA 檢測靈敏度的比較

將購自于哈藥集團生物疫苗有限公司的標準陽性血清按照表5 中的比例進行倍比稀釋，SAT 最高在血清稀釋度1∶1 600 可以檢測出陽性，F(xiàn)PA 最高在血清稀釋度1∶3 200 可以檢測出陽性，具體結果見表4。

表4 SAT 與FPA 檢測靈敏度的比較

3 討 論

本文檢測的樣品主要來源于近幾年本市域內未經布病疫苗免疫的規(guī)模養(yǎng)殖場、散養(yǎng)戶的羊群，其中陽性血清151 份，陰性血清21 份，樣品送檢前進行了RBT 初篩。本市布病凈化的手段主要是通過RBT 初篩，試管凝集確診。 經過幾年的努力，本市動物布魯氏菌病的整體陽性率，已由2016 年的1.9%降至現(xiàn)在的0.4%[8]。

本次比較中發(fā)現(xiàn)，RBT 的符合率是這五種試驗方法中最高的，為82.56%，其敏感性為100%，一致性高達82.56%，這也是RBT 一直被基層作為初篩的重要原因之一。 此外，RBT 操作簡便，對技術人員要求不高，進行簡單培訓，就可以操作，幾分鐘就可以出結果，比較適合進行大批量樣品的檢測，但RBT 特異性比較低，因此該方法只適合樣品的初篩[9]。

SAT 是我國診斷布魯氏菌病的法定方法，所以本文以SAT 作為參考方法，該方法主要是檢測IgM，敏感性較高，常用于布魯氏菌病的早期診斷。 但SAT 單獨使用時特異性比較低，結果需要通過肉眼觀察來判定，受技術人員經驗影響比較大，不能區(qū)分自然感染和人工免疫。此外，SAT 試驗周期比較長，無法做到快速檢測，試驗操作相對較為繁瑣，每個樣品要做4 個稀釋度，牛羊的血清稀釋倍數(shù)不統(tǒng)一，這些無疑增加了技術人員的工作量。 SAT 試驗對溫度要求也比較高，要在37 ℃恒溫箱中反應，不利于在田間或者沒有相關恒溫設備的基層實驗室開展，一般縣級及以上實驗室才能開展。

FPA 試驗結果表明，其特異性和準確率都比較高，不容易造成誤診。 FPA 試驗整個操作過程比較簡單，幾分鐘就可以得到檢測結果，不需要長時間的等待和孵育、洗板、讀板等工作。 但FPA 試驗需要指定的檢測儀器和檢測試劑，價格比較昂貴，不適合在檢測經費比較緊張、監(jiān)測數(shù)量比較多的區(qū)縣、鄉(xiāng)鎮(zhèn)推廣，但可以根據實際情況，結合其他檢測方法選擇性使用。 據了解，F(xiàn)PA 試驗在貿易口岸使用較為常見[10，11]。

ELISA 檢測結果表明，cELISA 和iELISA 都具有較高的敏感性。而且，ELISA 操作簡單，樣本需求量不大，適合大批量檢測[12]。 我區(qū)作為布病檢疫凈化區(qū)，每年檢測數(shù)量都比較多，ELISA 檢測方法就比較適合。同時，ELISA 檢測結果比較客觀，不會受技術人員的主觀因素導致檢測結果各異。但各鄉(xiāng)鎮(zhèn)由于技術人員水平和設備條件限制，且ELISA 檢測的試劑費用相對也比較貴，無法在鄉(xiāng)鎮(zhèn)一級推廣普及。

為了驗證SAT 試驗和FPA 試驗的靈敏度， 本文將哈藥集團的標準陽性血清按比例進行倍比稀釋，SAT 最高在血清稀釋度1∶1 600 可以檢測出陽性，而FPA 在血清稀釋度1∶3 200 依然可以檢測出陽性。 實驗結果表明，F(xiàn)PA 的靈敏度更高。 這樣，在生產實踐中，F(xiàn)PA 可以作為補充試驗，對SAT 檢測結果為陰性的情況下，可以使用FPA 進行再次驗證。

4 結 論

綜上所述，布魯氏菌病血清學檢測方法各有優(yōu)缺點，而且由于客觀條件的限制，每個層面的技術人員所能選擇檢測方法也比較局限，特別是越往基層，所能選擇的檢測方法越單一。這就導致很難對布魯氏菌病血清學檢測方法做出一個統(tǒng)一的選擇。綜合考慮，為了降低牛羊布魯氏菌病傳播的風險，應選取敏感性較高的檢測方法，如鄉(xiāng)鎮(zhèn)可以選擇RBT、市（區(qū)）縣可以選擇ELISA 等。 同時，為了減少養(yǎng)殖戶的經濟損失，與特異性較高的檢測方法結合使用，如市（區(qū)）縣可以選擇SAT、市級單位可以選擇SAT、FPA。 采用兩種以上檢測方法，不僅可以降低布魯氏菌病的傳播風險，減少養(yǎng)殖戶的經濟損失，還可以確保檢測出結果的準確性，為檢疫凈化提供可靠保證。