針刺在阿爾茨海默病中調(diào)控多種類型自噬的機制研究進展

張 菶，楊添淞，李 孟，孫曉偉，馮楚文，孫忠人,3△,周曉卿

1.黑龍江中醫(yī)藥大學,黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院,黑龍江 哈爾濱 150040;3.黑龍江中醫(yī)藥大學針灸臨床神經(jīng)生物學(腦病)重點實驗室,黑龍江 哈爾濱 150040;4.北京中醫(yī)藥大學深圳醫(yī)院(龍崗),廣東 深圳 518172

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)主要發(fā)生于中老年期，以記憶障礙、思維和計算能力障礙甚至人格改變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)[1]。雖目前發(fā)病機制尚不明確，但該病以細胞外由β淀粉樣蛋白(β-amyloid protein,Aβ)堆積形成的老年斑(Senile plaques, SP)和細胞內(nèi)異常磷酸化Tau蛋白積聚形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)(Neurofibrillary tangles,NFTs)為典型病理表現(xiàn)[2]。自噬(Autophagy)是真核細胞清除衰老受損細胞或細胞器的主要途徑, 在維持細胞穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用。自噬按細胞內(nèi)底物進入溶酶體腔方式的不同可分為大自噬(巨自噬)、小自噬(微自噬)和分子伴侶介導的自噬，按吞噬底物是否具有選擇性可分為選擇性自噬(包括線粒體自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、核糖體自噬、高爾基體自噬、鐵自噬和脂類自噬等)和非選擇性自噬[3]。目前研究表明,在AD發(fā)病過程中多種類型的自噬過程均可被激活，它們通過激活相應的下游分子通路，在一定程度上清除AD疾病過程產(chǎn)生的病理產(chǎn)物，繼而促進神經(jīng)功能恢復，但單純通過該應激反應清除變性或錯誤折疊蛋白的能力是遠不夠的。針刺作為傳統(tǒng)中醫(yī)療法，在臨床促進AD患者神經(jīng)功能恢復方面有一定療效，同時發(fā)現(xiàn)針刺在包括AD在內(nèi)的多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中可通過調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞自噬水平促進神經(jīng)功能恢復，本研究將對針刺調(diào)控AD的自噬機制方面作以綜述。

1 巨自噬在AD中的作用以及針刺對該作用的影響

1.1 巨自噬發(fā)生過程

巨自噬是目前研究較為深入的自噬類型，其在包括AD在內(nèi)的多種組織和器官的病理損傷中也較為常見。該過程可大致分為起始階段、延伸和自噬小體形成階段、吞噬目的蛋白并降解階段[4]。

巨自噬起始階段主要由ULK1-Atg13-FIP2000、Vps34-Vps15-Beclin1兩種復合物構(gòu)成自噬囊泡結(jié)構(gòu)。ULK1-Atg13-FIP2000復合物的形成受復合物雷帕霉素靶蛋白1(Mammalian target of rapamycin 1,mTOR1)和AMP依賴的蛋白激酶[Adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase, AMPK]共同調(diào)控。正常情況下，mTOR1通過磷酸化ULK1上的Ser757位點，從而阻止AMPK對ULK1的磷酸化過程，使ULK1不能與Atg13、FIP2000等蛋白形成復合物，對自噬囊泡的形成發(fā)揮負調(diào)控作用。反之，在某些因素刺激下，AMPK可通過抑制mTOR1活性，同時磷酸化ULK1上的Ser317等位點激活ULK1，促進其與Atg13、FIP2000形成復合物，繼而促進自噬囊泡的形成。Beclin1正常情況下通過與Bcl2結(jié)合使細胞自噬水平保持穩(wěn)定，而某些應激或病理狀態(tài)下，Beclin1與Bcl2分離，前者隨之與Vps34、Vps15等蛋白形成復合物，促進自噬囊泡結(jié)構(gòu)形成[5]。

自噬囊泡通過上述過程不斷延展的同時，會將自噬底物包圍，直至將其全部包裹形成自噬小體，該過程主要在Atg12-Atg5-Atg16、Atg8/LC3兩種復合物的幫助下實現(xiàn)。Atg7和Atg10將Atg12活化后，后者先與Atg5結(jié)合形成復合物，隨后該復合物再與Atg16結(jié)合形成Atg12-Atg5-Atg16復合物，該復合物可結(jié)合在自噬囊泡上招募Atg8/LC3。Atg8最早發(fā)現(xiàn)于酵母，LC3為其在哺乳動物中的同源物。自噬激活后，LC3在Atg4作用下通過暴露其C末端形成LC3-I，后者又在Atg12-Atg5-Atg16復合物催化下生成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ被招募到自噬囊泡上促進其延展，并最終形成自噬小體，因此LC3-Ⅱ表達水平或LC3-Ⅱ與LC3-I表達比值也是判斷自噬活化程度的關(guān)鍵[6]。

自噬小體形成后，會與溶酶體融合形成自噬溶酶體，在溶酶體內(nèi)多種酸性水解酶作用下將自噬小體內(nèi)的底物降解，從而完成全部自噬過程。

1.2 巨自噬與AD的關(guān)系

1.2.1 巨自噬與Aβ代謝 自噬對于AD后Aβ的代謝是把雙刃劍。Aβ是β淀粉樣前體蛋白(Aβ precursor protein, APP)裂解生成。APP在神經(jīng)組織中廣泛存在于神經(jīng)元樹突和軸突表面，該蛋白可通過內(nèi)吞途徑進入細胞內(nèi)，與β分泌酶、γ分泌酶等物質(zhì)一起包裹于內(nèi)體，β分泌酶可將APP分解成β-CTF，后者可再被γ分泌酶分解形成Aβ。目前有實驗分別在正常小鼠肝細胞、AD大鼠神經(jīng)細胞中發(fā)現(xiàn)自噬囊泡內(nèi)含有大量APP、β-CTF，上述均為形成Aβ的過程因子，因此可以認為自噬小體是生成Aβ的重要場所。但亦有研究發(fā)現(xiàn)，APP以及其降解產(chǎn)物β-CTF和Aβ等均可作為自噬小體的底物被清除，因此巨自噬對于AD后Aβ生成與降解起到雙向調(diào)控作用[7]。

1.2.2 巨自噬與Tau蛋白代謝 Tau蛋白主要分布于神經(jīng)元軸突，屬微管結(jié)合蛋白，其主要作用為促進微管裝配。正常情況下，Tau蛋白不會被磷酸化，而AD動物腦組織內(nèi)可檢測到大量磷酸化Tau蛋白表達。目前Tau蛋白磷酸化機制尚不明確，但有關(guān)AD疾病模型中自噬水平與Tau蛋白表達的實驗表明，3MA等自噬抑制劑可通過阻斷磷酸化Tau蛋白降解，進而加速下游病理產(chǎn)物NFTs生成，反之則可使磷酸化Tau蛋白表達明顯下降。上述實驗從一個側(cè)面說明巨自噬激活可通過抑制Tau蛋白表達對AD發(fā)病產(chǎn)生抑制作用[8]。

1.3 針刺在AD中對巨自噬的影響

1.3.1 腎腦相濟針刺法在AD中對巨自噬的影響 目前使用該理論指導AD的治療是最常見的，因為腦與心、腎等臟腑關(guān)系密切。腦為元神之府，統(tǒng)領(lǐng)神志及臟腑功能，腦髓來源于腎之精髓，腎精充足上輸于腦，才可使人體神志清晰；同時腦與心共主神明，《醫(yī)學衷中參西錄》載:“人之神明有體用，神明之體藏于腦，神明之用出于心”。督脈通過“上貫心”“貫脊屬腎”的走行規(guī)律，將心、腦和腎三者聯(lián)系起來，成為廣義上的腦，共同發(fā)揮元神之府的功用[9]。因此,針刺督脈可發(fā)揮貫通心腦腎三臟、調(diào)節(jié)神志的作用。

AD中醫(yī)屬“癡呆”。許多學者均認為癡呆病位在腦，腎虛是發(fā)病根本。武峻艷認為，“氣”在腎-督脈-腦系統(tǒng)中通過溝通“精”“神”實現(xiàn)人體的形神合一。稟賦不足、情志內(nèi)傷和房勞過度等均可使精髓化生不足，是AD發(fā)生的主要病機[10]。針刺腎、腦腧穴通過調(diào)節(jié)腎-督脈-腦系統(tǒng)之氣，促進精髓腎腦相關(guān)病化生并傳輸于腦，是治療癡呆的主要理論基礎(chǔ)。高楊[11]認為，“腎氣虧虛、濁瘀蒙竅”是AD的主要中醫(yī)病機，AD的病理產(chǎn)物Aβ和Tau蛋白等應屬內(nèi)生痰濁瘀血。

鄭清[12]在電針通過調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號通路對AD大鼠學習記憶認知障礙與自噬水平的相關(guān)性實驗中通過同時針刺百會穴、腎俞穴發(fā)現(xiàn)，該針法可通過抑制PI3K/AKT/mTOR通路，繼而激活大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞巨自噬水平，從而清除NFTs，促進AD大鼠學習記憶認知功能。有學者通過針刺相同穴位發(fā)現(xiàn)，該針刺法通過抑制GSK3β/mTOR通路改善AD大鼠記憶障礙，這可能通過mTOR下調(diào)激活海馬區(qū)神經(jīng)細胞巨自噬水平，繼而促進AD相關(guān)病理產(chǎn)物降解有關(guān)[13]。

孫赫楠等[14]通過針刺AD患者百會、涌泉穴發(fā)現(xiàn)，該針刺法可明顯下調(diào)AD病理損傷主要產(chǎn)物Aβ水平。但腎腦相濟針刺理論是否通過調(diào)控自噬達到此目的？高楊[11]通過構(gòu)建大鼠AD模型，并同樣選取上述穴位作為干預方法，通過觀察大鼠海馬區(qū)和顳葉皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細胞發(fā)現(xiàn)，針刺下調(diào)Aβ機制與上調(diào)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ和抑制p62表達有關(guān)。

1.3.2 調(diào)督啟神針法在AD中對巨自噬的影響 督脈與腦密切相關(guān)，在循行上督脈入絡(luò)腦，因此臨床上單純以督脈穴為主穴對AD后神經(jīng)功能恢復也有較大幫助。

趙盼盼[15]通過針刺AD大鼠百會穴、迎香穴觀察該針刺法對大鼠神經(jīng)功能缺損的影響以及該針刺法通過調(diào)節(jié)神經(jīng)細胞自噬在這一過程中發(fā)揮的作用中發(fā)現(xiàn)，針刺可通過激活AD大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞自噬水平改善大鼠空間記憶功能，這可能與自噬激活后促進AD病理產(chǎn)物Syn降解有關(guān)。而孔瑩等[16]單純針刺AD模型大鼠督脈百會穴觀察其對自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3-Ⅱ表達影響時發(fā)現(xiàn)，針刺百會穴可明顯上調(diào)上述兩種蛋白表達，說明該針刺法可激活AD后神經(jīng)細胞自噬水平。

1.3.3 其他針法在AD中對巨自噬的影響 張玉杰[17]通過針刺AD大鼠四關(guān)穴觀察大鼠腦組織海馬區(qū)自噬相關(guān)蛋白LC3、p62，以及AD病理損傷相關(guān)蛋白Aβ和Tau表達發(fā)現(xiàn)，針刺可明顯上調(diào)自噬相關(guān)蛋白LC3表達，同時可抑制Aβ和Tau蛋白表達。因此可證實，針刺四關(guān)穴可通過激活AD大鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)細胞巨自噬來降解Aβ、Tau蛋白，繼而促進神經(jīng)功能恢復。

2 分子伴侶介導自噬在AD中的作用以及針刺對該作用的影響

分子伴侶是在細胞內(nèi)幫助其他蛋白質(zhì)進行正常折疊、組裝和降解的一類蛋白質(zhì)，近年發(fā)現(xiàn)，該家族的某些蛋白可作為分子伴侶參與自噬過程，因此該方式被稱為分子伴侶介導的自噬(Chaperone-mediated autopgagy, CMA)[18]。CMA僅存在于哺乳動物，由分子伴侶HSC70識別帶有KFERQ序列的蛋白作為底物，并將后者運送到溶酶體內(nèi)進行降解，因此該種自噬類型屬于選擇性自噬。

CMA可參與包括亨廷頓病、AD以及帕金森病在內(nèi)的多種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病過程。在AD發(fā)病中，通過分子伴侶選擇性識別突變的Tau蛋白，進而將后者運輸?shù)饺苊阁w內(nèi)降解成多肽，可有效抑制AD進展。

但目前尚無有關(guān)針刺通過調(diào)節(jié)CMA機制抑制AD后磷酸化Tau蛋白或Aβ的文獻，因此未來可將該研究作為突破口觀察針刺促進AD后神經(jīng)功能恢復的可能機制。

3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在AD中的作用以及針刺對該作用的影響

3.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激發(fā)生過程

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(Endoplasmic reticulum, ER)是哺乳動物胞質(zhì)內(nèi)重要細胞器，其主要功能是參與蛋白質(zhì)折疊修飾以及Ca2+貯存釋放。ER是蛋白質(zhì)形成的場所，而且可敏感地感受到細胞內(nèi)外環(huán)境變化。當ER感受到缺血缺氧、酒精、藥物、中毒、感染(細菌、病毒等)及營養(yǎng)缺乏等生理或病理改變后會通過各種應激反應調(diào)控其自身穩(wěn)態(tài)，這種改變被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(Endoplasmic reticulum stress，ERS)。在各種ERS中，最典型的就是未折疊蛋白反應(Unfolded protein response, UPR)，該反應通過誘導自噬、減少新生蛋白質(zhì)合成、增加分子伴侶合成及錯誤折疊或未折疊蛋白質(zhì)降解來維持ER內(nèi)穩(wěn)態(tài)[19]。

UPR過程主要是由分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78/免疫球蛋白結(jié)合蛋白(Glucose-regulated protein78/Binding immunoglobulin protein, GRP78/BiP)和3種感受蛋白：需肌醇酶1 (Inositol-requiring protein 1,IRE1) 、蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PKR-like ER kinase, PERK)和轉(zhuǎn)錄激活因子6(Activatingtranscription factor 6，ATF6)介導的信號通路組成。生理條件下，3種感受蛋白與GRP78/Bip結(jié)合而失活。ERS發(fā)生后，GRP78/Bip與感受蛋白分離，前者與大量未折疊蛋白結(jié)合，使感受蛋白被釋放、活化并啟動各自的下游信號通路[20]。

以PERK為例，該蛋白在UPR中形成的通路對減少細胞損傷、緩解ER內(nèi)蛋白質(zhì)代謝壓力有重要作用。ERS發(fā)生時，GRP78/BiP和PERK解離，活化的PERK使真核生物翻譯起始因子2α(Eukaryotic initiation factor 2α, EIF2α)的Ser51位點磷酸化，弱化蛋白質(zhì)的合成。轉(zhuǎn)錄活化因子4(Activating transcription factor 4，ATF4)作為EIF2α的下游信號因子，激活后能通過誘導Atg12、Atg5及Beclin1表達激活自噬，促進未折疊或錯誤折疊蛋白質(zhì)降解，恢復ER穩(wěn)態(tài)[21]。

3.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與AD的關(guān)系

AD動物模型腦內(nèi)神經(jīng)細胞自噬途徑不僅與巨自噬有關(guān)，也可能與ERS有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)ERS與Tau 蛋白間存在相互調(diào)控的特點，磷酸化Tau蛋白聚集可誘發(fā)ERS，而ERS可通過上調(diào)UPR信號誘導Tau蛋白生成增加，因此ERS與Tau蛋白間可能形成惡性循環(huán)，介導AD發(fā)生。Aβ可導致Ca2+通過ER膜上的Ryanodine受體(Ryanodine receptor,RyR)向胞質(zhì)和線粒體釋放，引起活性氧(Reactive oxygen species, ROS)水平升高，促進細胞凋亡。此外Aβ還可通過激活 PERK/EIF2α/ATF4通路誘導自噬發(fā)生[22]。

3.3 針刺在AD中對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響

目前有關(guān)針刺通過調(diào)節(jié)ERS機制抑制AD后磷酸化Tau蛋白或Aβ的文獻較少。毛旭等[23]通過針刺AD大鼠百會穴和百會穴左右旁開5mm處的穴位發(fā)現(xiàn)，該針刺法可通過抑制大鼠海馬CA1區(qū)GRP78/BiP蛋白表達來激活UPR下游通路，繼而下調(diào)Aβ表達，從而抑制神經(jīng)細胞凋亡。

此外針刺頭穴在腦出血[24]、腦缺血再灌注[25]和帕金森病[26]等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病動物模型中，均可通過激活UPR誘導下游通路促進自噬，達到抑制神經(jīng)細胞凋亡的目的。而且在心肌再灌注損傷[27]、潰瘍性結(jié)腸炎[28]和大運動負荷骨骼肌[29]等神經(jīng)系統(tǒng)以外疾病的組織細胞中，針刺也可通過上述機制發(fā)揮作用。

4 線粒體自噬在AD中的作用以及針刺對該作用的影響

4.1 線粒體自噬發(fā)生過程

目前誘導線粒體自噬發(fā)生的信號通路主要包括Parkin1通路和NIX/BNIP3通路等。以NIX/BNIP3通路為例，NIX/BNIP3蛋白通過在線粒體表面募集自噬小體蛋白LC3，特異性誘導線粒體發(fā)生自噬，當受損的線粒體被延展的LC3包繞吞噬后，其后續(xù)過程基本與巨自噬相同，通過與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，以促進受損線粒體降解[30]。

4.2 線粒體自噬與AD的關(guān)系

在AD動物模型和患者大腦中，Aβ分布與受疾病影響的大腦區(qū)的線粒體膜相關(guān)。在APP轉(zhuǎn)基因小鼠模型中發(fā)現(xiàn)Aβ似乎被困在線粒體膜中，有人認為Aβ通過在線粒體導入通道中刺激有毒的活性氧物質(zhì)的異常積累，進而破壞線粒體并影響其功能[31]。

AD模型腦組織中線粒體運輸?shù)母淖兣cTau蛋白磷酸化和異常聚集有關(guān)。纖維纏結(jié)的神經(jīng)元顯示出比無纏結(jié)的神經(jīng)元更嚴重的線粒體分布缺陷，表明纖維纏結(jié)加劇了線粒體結(jié)構(gòu)和功能障礙。各種不同形式的Tau蛋白均會刺激線粒體，例如磷酸化的Tau蛋白或截短的Tau蛋白會破壞線粒體膜電位，引起氧化應激并促進過氧化物累積以及減弱細胞Ca2+緩沖能力[32]。

4.3 針刺在AD中對線粒體自噬的影響

目前有關(guān)針刺通過調(diào)節(jié)線粒體自噬機制抑制AD后磷酸化Tau蛋白或Aβ的文獻較少。李趙龍等[33]應用腎腦相濟針刺法，通過針刺AD小鼠百會、腎俞和太溪等穴發(fā)現(xiàn)，針刺可通過激活LC3和BNIP3等蛋白表達促進AD神經(jīng)細胞線粒體自噬，同時結(jié)合實驗中Aβ表達下調(diào)可知，針刺可能通過促進線粒體自噬使細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)和功能異常線粒體含量下降，繼而減少Aβ與線粒體酶Aβ結(jié)合醇脫氫酶之間相互作用的機會，從而抑制神經(jīng)細胞內(nèi)Aβ毒性。

5 討論

阿爾茨海默病在中醫(yī)屬“癡呆”范疇，臨床以行為功能或神志異常為主要特征，目前多認為該病是以各種原因所致的腦髓失養(yǎng)、神機失用為主要病機[34]?，F(xiàn)代醫(yī)學中，雖然AD發(fā)病機制尚不清楚，但包括遺傳、飲食和激素等多種因素似乎與AD發(fā)病均有關(guān)聯(lián)。通過本研究對自噬在AD中的綜述可發(fā)現(xiàn)，自噬是一把雙刃劍，例如在調(diào)節(jié)病理產(chǎn)物Aβ代謝方面，自噬既可通過包裹并降解形成Aβ的前體物質(zhì)β分泌酶來促進前者生成，當Aβ生成過多后也可通過形成自噬小體降解的方式將其清除，以調(diào)節(jié)細胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)，表明自噬在AD發(fā)病過程中可能是保護因素，也有可能是誘發(fā)因素。有關(guān)自噬促進Aβ等AD代謝產(chǎn)物的證據(jù)較少，但這些結(jié)果是否僅是個別現(xiàn)象，是否在實驗中有其他因素干預，或該結(jié)果的出現(xiàn)是否隱藏其他尚未發(fā)現(xiàn)的機制所調(diào)控目前尚不得知。但通過目前針刺對AD動物實驗的干預發(fā)現(xiàn)，針刺對AD后自噬的影響大多是積極的，針刺可通過激活AD后不同自噬類型抑制Aβ和Tau蛋白等AD關(guān)鍵病理產(chǎn)物表達，繼而促進神經(jīng)功能恢復，這些結(jié)果為AD的針刺治療效果提供有力證據(jù)，進一步闡明了針刺發(fā)揮上述臨床療效的作用機制，同時也為該病的治療提供新思路。

本研究較全面地對目前主要幾種自噬發(fā)生機制，以及它們和AD的關(guān)系和針刺通過干預上述幾種自噬機制在AD中發(fā)揮的臨床效果作以綜述，但因篇幅所限，文章僅對每種自噬的關(guān)鍵機制參與AD發(fā)病過程加以闡述，上述機制并非自噬參與AD發(fā)病的全部。而且目前有關(guān)針刺在AD中通過干預個別種類自噬機制發(fā)揮調(diào)節(jié)神經(jīng)功能的研究也較少見，因此針刺是否通過干預如分子伴侶介導自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激等機制發(fā)揮促進AD后神經(jīng)功能恢復的作用也只是通過觀察針刺在其他類型疾病中干預同種分子機制的實驗結(jié)果進行推理。以后筆者還將對不同類型自噬機制參與AD發(fā)病過程進行逐一探討。