張艷，馮萬(wàn)宇，徐馨，薛沾枚，劉雪松，張備，李平，吳憲，陳亮，史同瑞

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，齊齊哈爾 161005）

奶牛發(fā)生乳房炎后不僅其產(chǎn)奶量、乳汁品質(zhì)均有不同程度下降、治療費(fèi)用增加，而且炎性乳汁還危害著公共衛(wèi)生和消費(fèi)者的健康，重癥乳房炎患牛因產(chǎn)乳量的明顯減少甚至失去泌乳能力而被淘汰，因此，做好奶牛乳房炎精確診斷與早期預(yù)警對(duì)乳房炎防控具有重要意義。長(zhǎng)期以來(lái)，一些學(xué)者一直致力于奶牛乳房炎的診斷研究，一些新的診斷方法不斷涌現(xiàn)。但臨床應(yīng)用中仍是采用乳汁體細(xì)胞診斷方法較為普遍，若新技術(shù)可以發(fā)揮其作用或新技術(shù)可以與傳統(tǒng)技術(shù)結(jié)合起來(lái)，對(duì)奶牛隱性乳房炎的早期診斷將更為準(zhǔn)確，能更好地服務(wù)于養(yǎng)殖業(yè)。因此，本文綜述了近年來(lái)有關(guān)奶牛乳房炎診斷的研究成果，旨在為奶牛乳房炎診斷提供技術(shù)參考。

1 乳汁體細(xì)胞診斷

1.1 乳汁體細(xì)胞診斷方法原理

牛奶體細(xì)胞（somatic cell）為免疫細(xì)胞及其他細(xì)胞的統(tǒng)稱。健康奶牛乳汁中的體細(xì)胞數(shù)（SCC）較少，主要由巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞等組成，其中，巨噬細(xì)胞占60%～88%，主要起保護(hù)功能并發(fā)起炎性反應(yīng)，淋巴細(xì)胞占10%～30%，中性粒細(xì)胞占1%～15%，上皮細(xì)胞約小于7%。當(dāng)奶牛發(fā)生乳腺感染時(shí)，炎癥因素能夠?qū)е氯橹械捏w細(xì)胞數(shù)急劇增多，而且乳汁內(nèi)的體細(xì)胞種類及其數(shù)量發(fā)生很大的變化[1]，其中中性粒細(xì)胞占絕大多數(shù)，占95%～99%。由于乳腺炎病原、病癥，以及感染階段的不同，乳汁中體細(xì)胞種類與數(shù)量也存在著明顯的差異，其中，尤為以中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的變化明顯[2,3]。一般情況下，乳汁中巨噬細(xì)胞的增多預(yù)示乳房發(fā)生慢性炎癥、非化膿性炎癥；淋巴細(xì)胞的增多預(yù)示為慢性炎癥或發(fā)生病毒性感染；中性粒細(xì)胞增多則預(yù)示為急性炎癥及炎癥早期[4,5]。

1.2 乳汁體細(xì)胞診斷方法的應(yīng)用

奶牛乳汁體細(xì)胞數(shù)能相對(duì)準(zhǔn)確地反映乳腺炎癥的嚴(yán)重程度，并被廣泛作為奶牛乳房炎的診斷指標(biāo)。國(guó)際乳品聯(lián)盟（IDF）推薦使用體細(xì)胞檢測(cè)和細(xì)菌學(xué)檢測(cè)作為判定奶牛乳房炎的方法。隨著奶牛生產(chǎn)性能測(cè)定技術(shù)（DHI）在國(guó)內(nèi)牧場(chǎng)的逐漸普及，體細(xì)胞數(shù)的快速檢測(cè)在奶牛乳房炎診斷，特別是隱性乳房炎診斷中發(fā)揮了重要作用。在十二烷基磺酸鈉等陰離子表面活性劑和堿性物質(zhì)的作用下，脂類物質(zhì)乳化，乳中體細(xì)胞細(xì)胞膜被破壞，并釋放出細(xì)胞DNA，DNA與其作用使乳汁產(chǎn)生沉淀或形成凝膠狀。根據(jù)沉淀或凝膠的多少，能夠間接判定體細(xì)胞數(shù)的數(shù)量[1]，從而診斷乳房的感染嚴(yán)重程度。根據(jù)此原理相繼建立了顯微鏡直接計(jì)數(shù)法、體細(xì)胞儀計(jì)數(shù)法、熒光電子細(xì)胞計(jì)數(shù)法、粒子計(jì)數(shù)法、白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)法等直接計(jì)數(shù)檢驗(yàn)法，以及加利福尼亞乳房炎試驗(yàn)、苛性鈉凝乳試驗(yàn)法、過(guò)氧化物酶試驗(yàn)等體細(xì)胞間接檢驗(yàn)法，并用于隱性乳房炎的診斷。

隨著研究深入，一些新的診斷方法相繼出現(xiàn)。安朋朋等研究了體細(xì)胞分型指數(shù)（DSCC）的變化規(guī)律，以及乳房炎致病菌對(duì)DSCC的影響。DSCC是指淋巴細(xì)胞與嗜中性粒細(xì)胞總數(shù)占體細(xì)胞數(shù)的比例，結(jié)果顯示，體細(xì)胞評(píng)分與DSCC存在極顯著相關(guān)性，且隨著體細(xì)胞評(píng)分值的升高，DSCC波動(dòng)范圍逐漸減?。活^胎牛、4胎以上奶牛的DSCC值顯著高于2至3胎牛；細(xì)菌感染陽(yáng)性樣品DSCC（77.21%）極顯著高于陰性樣品（69.33%），但傳染性致病菌感染與環(huán)境性致病菌感染的樣品間DSCC無(wú)顯著差異，由此表明，DSCC對(duì)于診斷乳房炎具有一定價(jià)值[5]。劉建營(yíng)等研究SCC和DSCC之間的關(guān)系，結(jié)果表明，隨著SCC的不斷升高，DSCC也會(huì)不斷提升，二者呈正相關(guān)，DSCC＞57.24%時(shí)，奶牛發(fā)生乳房炎的幾率較大[6]。谷淑華等調(diào)查了SCC和DSCC在河南奶牛健康管理中的應(yīng)用情況。他們重新定義奶牛健康狀況并將奶牛分為：健康組、疑似或初期乳房炎組、乳房炎組、慢性或持續(xù)性乳房炎組，然后進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果顯示，與其他各組相比健康組的產(chǎn)奶量、乳脂率和乳蛋白含量最高，隨著時(shí)間與胎次的增加，乳房炎組和慢性或持續(xù)性乳房炎組患牛數(shù)量持續(xù)增加，綜合看出，未來(lái)若能制定出更佳配套的管理措施，此方法在奶牛乳房健康監(jiān)測(cè)中將發(fā)揮巨大的作用[7]。

2 乳汁酶學(xué)診斷

2.1 乳汁酶學(xué)診斷方法原理

在奶牛乳腺發(fā)生病原性感染后，致病病原會(huì)引起乳腺組織發(fā)生一系列的炎性變化，并動(dòng)員大量免疫細(xì)胞至乳腺組織內(nèi)，其中90%為嗜中性多形核白細(xì)胞，大量嗜中性多形核白細(xì)胞進(jìn)入炎性乳腺，并吞噬入侵的病原，致使體細(xì)胞數(shù)持續(xù)升高。奶牛發(fā)生乳房炎時(shí)，乳腺內(nèi)的炎性細(xì)胞釋放的炎性成分將造成乳腺微血管的通透性增加，破壞血乳屏障，血液中的體細(xì)胞、溶酶體酶和急性期蛋白等成分滲入至牛乳中，并導(dǎo)致N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶（NAG）等一些酶的生物活性升高。

2.2 乳汁酶學(xué)診斷方法的應(yīng)用

NAG存在于乳腺組織和白細(xì)胞中，當(dāng)乳腺細(xì)胞受到損傷或白細(xì)胞數(shù)升高時(shí)，NAG活性會(huì)顯著升高[8]，因此，NAG活性與奶牛隱性乳房炎發(fā)生密切相關(guān)，其活性能夠反映乳腺是否存在感染的風(fēng)險(xiǎn)。NAG能夠預(yù)示分泌型細(xì)胞的狀態(tài)及乳腺發(fā)病程度，目前，已有商業(yè)化的NAG測(cè)定試劑盒，并用于隱性乳房炎的診斷中[9～11]。劉小倩等在研究長(zhǎng)期飼喂高精料可否致奶牛發(fā)生內(nèi)源性乳房炎的試驗(yàn)中，應(yīng)用ELISA試劑盒測(cè)定了乳及乳腺組織中NAG、堿性磷酸酶（AKP）、髓過(guò)氧化物酶（MPO）及脂多糖（LPS）等炎性指標(biāo)，試驗(yàn)表明，牛乳中NAG、AKP活性顯著上升，LPS含量極顯著升高，其他指標(biāo)差異不顯著。結(jié)果說(shuō)明，NAG、LPS和AKP可作為隱性乳房炎的診斷指標(biāo)[8]。印度學(xué)者建立了一種斑點(diǎn)試驗(yàn)，根據(jù)奶樣中胰蛋白酶抑制劑的檢測(cè)結(jié)果診斷隱性乳房炎，該方法敏感性和特異性分別為88.2%和89.8%。Ball等通過(guò)檢測(cè)NAG判斷是否為隱性乳房炎。葛影影等研究奶牛血清因子、生理生化指標(biāo)與奶牛乳房炎的關(guān)系，結(jié)果表明，牛血清因子、生理生化指標(biāo)與奶牛乳房炎的發(fā)生密切相關(guān)，其中，IL-1β、IL-8、白蛋白（ALB）水平和NAG活性的顯著變化與乳房炎的感染和發(fā)生關(guān)系密切[12]。

髓過(guò)氧化物酶（MPO）是PMN、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞釋放的嗜天青顆粒的主要成分，是氧依賴性殺菌系統(tǒng)的重要組成部分。AKP是機(jī)體防御感染的因子之一[10]。薛永康等探索了奶牛隱性乳房炎的早期診斷指標(biāo)，結(jié)果表明，乳清中血清觸珠蛋白（HP）、血清淀粉樣蛋白A（SAA）、α-1酸性糖蛋白（AGP）、C反應(yīng)蛋白（CRP）等的含量與乳酸脫氫酶（LDH）、葡萄糖苷酶（NAG）、過(guò)氧化氫酶（CAT）等的活性均可輔助診斷奶牛隱性乳房炎。瑞典學(xué)者制備了奶牛MPO單克隆抗體，建立了針對(duì)牛乳MPO的MPO-ELISA方法[13]。牛國(guó)慶等研究了以MPO作為診斷奶牛乳房炎的檢測(cè)效果，結(jié)果顯示，乳樣中SCC水平與MPO含量呈正相關(guān)，采用ELISA檢測(cè)乳樣中MPO水平可以快速、簡(jiǎn)便地對(duì)奶牛乳房炎做出早期診斷[14]。

組蛋白去甲基化酶（HDMs）是可以脫去組蛋白甲基化的一類酶。王晶晶利用脂多糖構(gòu)建了體內(nèi)和體外大腸桿菌源性的臨床型乳腺炎模型，測(cè)定了HDMs表達(dá)水平，結(jié)果顯示，模型構(gòu)建成功后HDMs家族的兩類去甲基化酶——賴氨酸特異性去甲基化酶1（LSD1）、十字形結(jié)構(gòu)域蛋白3（JMJD3）基因及蛋白表達(dá)量均顯著提升[15]。

3 血清學(xué)炎性蛋白指標(biāo)診斷

3.1 血清學(xué)炎性蛋白指標(biāo)診斷方法原理

炎癥會(huì)激發(fā)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生急性炎性反應(yīng)，在炎癥過(guò)程中急性期蛋白含量將顯著升高。奶牛發(fā)生隱性乳房炎后，HP、AGP、SAA等會(huì)隨著炎癥的發(fā)展而增加，且CRP也與SCC具有一定相關(guān)性。在急性炎癥反應(yīng)期，動(dòng)物在肝臟中合成血清淀粉樣A蛋白（SAA）、結(jié)合珠蛋白（Hp）等急性期蛋白來(lái)抵御感染。Eckersall等報(bào)道，急性反應(yīng)期最顯著的特征是肝臟中合成急性期蛋白水平升高，其中SAA、HP是目前認(rèn)為最敏感的指標(biāo)。

3.2 血清學(xué)炎性蛋白指標(biāo)診斷方法的應(yīng)用

HP又稱觸珠蛋白，是一種酸性糖蛋白。健康牛血清HP濃度低于20mg/L，乳房炎牛2d內(nèi)升至2g/L。HP還可作為子宮炎、腸炎、肺炎等的指征。SAA在急性炎癥刺激下，血清SAA1、SAA2水平在5～6h升高約1000倍。AGP又稱類黏蛋白，蔣磊選取健康奶牛和不同發(fā)病程度隱性乳房炎患牛，采用α1-酸性糖蛋白ELISA試劑盒測(cè)定各組乳清樣品中α1-酸性糖蛋白的含量，結(jié)果顯示，隱性乳房炎組奶牛乳清中α1-酸性糖蛋白的含量顯著或極顯著高于健康組奶牛，且隨著奶牛隱性乳房炎病情的加重及乳中體細(xì)胞數(shù)的增加，乳清中α1-酸性糖蛋白的含量呈現(xiàn)出遞增趨勢(shì)，乳腺炎癥引發(fā)的乳腺損傷及乳中體細(xì)胞數(shù)增加與乳清中α1-酸性糖蛋白的含量呈正相關(guān)性[16]。蘇傳友等研究表明，高體細(xì)胞數(shù)可以上調(diào)牛乳中蛋白含量，如α-1-微球蛋白、間-α-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4和抗菌肽4等，可以根據(jù)血清中蛋白含量的變化對(duì)奶牛的早期乳腺炎進(jìn)行判斷[17]。劉海燕等研究證實(shí)，乳房炎期間乳清中轉(zhuǎn)鐵蛋白和白蛋白含量升高，而α乳清蛋白和β乳球蛋白含量降低[18]。宋潔等研究表明，奶牛血清中α乳蛋白與體細(xì)胞計(jì)數(shù)相關(guān)性為0.60，血清中乳蛋白可作為乳房炎診斷依據(jù)[19]。汪悅等研究發(fā)現(xiàn)，奶牛血清或乳汁中結(jié)合珠蛋白、血清淀粉樣蛋白和α-酸性糖蛋白等在乳房炎診斷中具有重要價(jià)值[20]。

4 致病菌PCR診斷

4.1 致病菌PCR診斷方法原理

奶牛乳腺炎的誘發(fā)因素有很多，微生物因素、飼養(yǎng)管理因素和自身免疫因素等均可以引起。其中，微生物如鏈球菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌等均可通過(guò)乳腺管進(jìn)入乳房?jī)?nèi)并大量滋生，導(dǎo)致奶牛乳房炎。大量的研究表明通過(guò)PCR方法單一或多重檢測(cè)致病菌可早期診斷奶牛乳房炎。

4.2 致病菌PCR診斷方法的應(yīng)用

王宇等建立了能夠同時(shí)檢測(cè)奶牛乳房炎無(wú)乳鏈球菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌等致病菌的多重PCR方法，結(jié)果表明，建立的快速診斷方法對(duì)3種致病菌的最低檢測(cè)限量分別為8×104cfu/mL、4×104cfu/mL和1.5×105cfu/mL[21]。鄧凱偉等還建立了能夠同時(shí)檢測(cè)奶牛乳房炎大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙雷氏菌等致病菌的多重PCR方法[22]。夏振海等采用TaqMan探針-熒光定量PCR技術(shù)快速篩查生鮮乳中含有的主要致病菌，結(jié)果從檢測(cè)乳樣中分離到大腸桿菌、黏質(zhì)沙雷氏菌、金黃色葡萄球菌、克雷伯氏菌、乳房鏈球菌和無(wú)乳鏈球菌等致病菌[23]。張莉莉等建立了奶牛乳房炎致病菌多重Taq-Man熒光PCR檢測(cè)方法，結(jié)果表明，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和無(wú)乳鏈球菌3種致病菌陽(yáng)性質(zhì)粒DNA最低檢測(cè)限量為103拷貝數(shù)/μL、102拷貝數(shù)/μL和104拷貝數(shù)/μL，且特異性好，與沙門氏菌、肺炎克雷伯菌和鮑曼不動(dòng)桿菌等無(wú)交叉反應(yīng)[24]。王仕成建立了奶牛乳房炎致病菌4重PCR診斷方法，結(jié)果顯示，方法對(duì)金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌、停乳鏈球菌、大腸桿菌陽(yáng)性質(zhì)粒DNA最低檢測(cè)限量為1pg/μL、1pg/μL、100fg/μL、1pg/μL，方法的重復(fù)性好、特異性高[25]。夏穎等建立了同時(shí)檢測(cè)奶牛乳房炎致病菌的3重PCR檢測(cè)方法，結(jié)果顯示，方法對(duì)金黃色葡萄球菌、無(wú)乳鏈球菌和綠膿桿菌陽(yáng)性質(zhì)粒DNA最低檢測(cè)限量為10-3mg/L，與大腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、表皮葡萄球菌和巴氏桿菌不存在交叉反應(yīng)，方法的特異性高、重復(fù)性好[26]。

5 小結(jié)

隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，養(yǎng)殖條件逐步改善，但奶牛乳房炎一直是對(duì)奶牛養(yǎng)殖業(yè)影響巨大的疾病之一。傳統(tǒng)的診斷方法已經(jīng)可以較為準(zhǔn)確地診斷出奶牛乳房炎，不過(guò)人們還是不斷探究新的技術(shù)力求可以更早地對(duì)奶牛隱性乳房炎作出判斷，相信隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，會(huì)有更多的先進(jìn)手段被應(yīng)用，以降低奶牛乳房炎造成的經(jīng)濟(jì)損失。