造血祖細胞激酶1蛋白激酶在腫瘤中的研究進展

苗 雷，左 銳，季曉君，周秋華，馬昌友，吳 艦，徐 丹

(南京正大天晴制藥有限公司，江蘇 南京 210046)

造血祖細胞激酶1(hematopoietic progenitor kinase 1, HPK1)又稱MAP4K1，是一種造血特異性蛋白絲氨酸-蘇氨酸激酶，是哺乳動物Ste20相關蛋白激酶MAP4K家族的成員。HPK1由1個N端激酶結(jié)構(gòu)域和4個富含脯氨酸的基序組成，這些基序能夠與含SH3結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)結(jié)合；在C末端也有1個Cirton同源結(jié)構(gòu)域，可能作為調(diào)節(jié)域且可能參與大分子相互作用[1-2]；中央結(jié)構(gòu)域還包含1個caspase-3切割位點。HPK1是一種免疫調(diào)節(jié)抑制激酶，主要在淋巴器官/組織中表達，包括骨髓、淋巴結(jié)、胸腺、脾臟、胎盤、胎肝；在造血室中，HPK1在所有類型的細胞中表達，如造血祖細胞、T細胞、B細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞和肥大細胞[3-4]。作為免疫因子，HPK1在免疫反應中發(fā)揮重要作用，能夠?qū)APK家族中的MAP3K信號轉(zhuǎn)導至MAP2K，引起c-Jun N末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)的活化，JNK激酶與Th1/Th2分化、細胞增殖與凋亡等多種T細胞反應相關[5]。自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、銀屑病關節(jié)炎，患者外周血單核細胞和T細胞中的HPK1表達水平下調(diào)[6-7]，表明HPK1可能通過調(diào)控T細胞介導的免疫反應在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。本文將主要描述HPK1在多種腫瘤中的研究進展，如乳腺癌[8-9]、肺癌[10]、胰腺癌[11]、膀胱癌[12]、結(jié)腸癌[13]等。

1 HPK1信號通路

HPK1是T細胞受體(T cell receptor, TCR)的負調(diào)控因子[14]。當TCR激活后，HPK1被Gads和Grb2等銜接蛋白募集到TCR復合物，Lck/Zap70在Tyr381位點磷酸化HPK1，為SLP76(一個分子量76 ku，含有SH2結(jié)構(gòu)域的白細胞磷蛋白)創(chuàng)造一個對接點[15]。HPK1的完全激活需要Ser171和Thr165位點的磷酸化，Ser171可通過PKD1的途徑被磷酸化，而Thr165似乎是一個自磷酸化位點。完全激活的HPK1導致SLP76在Ser376殘基位點被磷酸化，14-3-3蛋白(與磷酸絲氨酸/蘇氨酸結(jié)合的第一信號分子)的募集[16]和TCR復合物的降解，從而抑制TCR信號傳導。HPK1介導的T細胞信號的負調(diào)控也可通過前列腺素E2受體以PKA依賴的方式交替觸發(fā)。

HPK1可與許多接頭蛋白結(jié)合，如SLP76家族，Gads、HIP-55、GRB2家族，LAT、CRK家族等，活化造血干細胞的SAPK/JNK信號途徑，從而對TCR通路進行負向調(diào)節(jié)。HPK1能負調(diào)控樹突狀細胞的活化和T細胞與B細胞反饋[6,17]；與TCR負反饋調(diào)控類似的機制，B細胞受體(B cell receptor, BCR)也將HPK1作為負反饋機制控制B細胞激活。在腫瘤中，TCR由于HPK1的激活而被抑制，從而造成了免疫逃逸，因此，抑制HPK1可增強T細胞活性，從而提高抗腫瘤免疫。

近期有學者研究發(fā)現(xiàn)，HPK1通過NF-κB-Blimp1信號軸來調(diào)控T細胞的功能[18]。RNA-Seq分析發(fā)現(xiàn)，在HPK1敲除的T細胞中，PRDM1(Blimp1基因編碼的蛋白)和GATA3表達顯著降低，TBX21表達增加。在B16-F10小鼠移植瘤模型中，PRDM1在HPK1敲除的T細胞中表達顯著降低，而GATA3的表達水平則與野生型T細胞無明顯差別。因此，HPK1是一種關鍵的TCR近端激酶，在T細胞活化時通過促進Blimp1的表達來調(diào)節(jié)腫瘤浸潤性T細胞的功能障礙(例如T細胞衰竭，Th1細胞無力，激活誘導T細胞死亡等)，而HPK1基因敲除能促進小鼠T細胞的抗腫瘤反應，從而抑制腫瘤生長。

2 HPK1與腫瘤

HPK1會影響Fas介導的細胞凋亡，caspase-3介導HPK1在Asp385位點被切割，將HPK1從NF-κB的激活因子轉(zhuǎn)變?yōu)镹F-κB的抑制劑，從而有利于細胞的凋亡[1]。在不同癌癥患者中，HPK1與多種T細胞衰竭信號(CD3E、TIGIT、PDCD1、CTLA4、HAVCR2及LAG3)呈正相關。同時，HPK1的表達水平與多種腫瘤患者的生存時間呈負相關，如腦低級別膠質(zhì)瘤、腎透明細胞癌、胰腺癌以及浸潤性乳腺癌等，HPK1低表達的患者具有更長的生存期[18]。此外，研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)HPK1的轉(zhuǎn)錄可抑制人結(jié)腸癌細胞中的腫瘤進展[13]。

HPK1的過表達和敲除研究發(fā)現(xiàn)，HPK1負調(diào)控T細胞中MAP激酶信號通路和AP-1的轉(zhuǎn)錄[1]。多項研究表明，HPK1在減弱T細胞、B細胞和樹突狀細胞的免疫應答中發(fā)揮非冗余作用，使得HPK1成為一個有吸引力的腫瘤免疫治療靶點[2]。

2.1 HPK1與乳腺癌2020年，全球乳腺癌的新發(fā)病例數(shù)超過肺癌位列第一，占比達11.7%[19]。乳腺癌是全球癌癥死亡的第5大原因之一，約占女性癌癥病例的1/4和死亡病例的1/6。已證實乳腺癌與BRCA1、BRCA2、PTEN、p53等基因相關[20]，HPK1在乳腺癌中的研究亦有報道。

在乳腺癌中，HPK1的功能與其他腫瘤似乎存在差異，HPK1的過表達能夠抑制腫瘤細胞的增殖與遷移。都闖等[8]通過檢測102例乳腺癌患者的癌組織和癌旁組織(距癌邊緣>5 cm)中p-Akt和HPK1的蛋白表達情況，發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中p-Akt和HPK1表達水平呈負相關。因此，p-Akt的高表達可提高癌細胞下游p16蛋白的表達，增強癌細胞的浸潤和黏附能力；HPK1表達缺失則導致殺傷性T淋巴細胞活力不足，導致乳腺癌的進展。王磊等[9]通過對91例乳腺癌組織和85例乳腺腺瘤組織中Kif2a和HPK1的表達研究，發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中Kif2a表達量高于乳腺腺瘤組織，而HPK1表達量低于乳腺腺瘤組織；進一步相關性分析發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中Kif2a表達量與多種癌基因(DEK、iASPP-SV、Stat3、MDM2、Fra-1)和耐藥基因(ESR1、MDR1、P-gp、MRP1、GST-π)呈正相關，而HPK1表達量與上述癌基因和耐藥基因呈負相關。因此認為乳腺癌組織中Kif2a基因的異常高表達和HPK1基因的異常低表達會影響癌基因和耐藥基因的表達，影響乳腺癌的惡性進展。

研究表明[21]，HPK1在乳腺癌組織和細胞中均低表達，而HPK1過表達則可抑制乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231的細胞增殖和遷移，并誘導凋亡，可使MCF-7乳腺癌細胞周期阻斷在G0/G1期。動物實驗證實，HPK1過表達可抑制人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231裸鼠移植瘤的生長，提高其生存率。機制研究發(fā)現(xiàn)，HPK1過表達會引起JNK、p53、caspase-3、PTEN蛋白的表達上調(diào)，MMP-9、MMP-2和Ki-67蛋白的表達下調(diào)。

2.2 HPK1與肺癌肺癌是2020年全球第二大最常見的癌癥，也是癌癥死亡的主要原因，新發(fā)病例數(shù)占比達11.4%，死亡數(shù)達18.0%[19]。

非小細胞肺癌具有免疫原性差的特點，可能與腫瘤環(huán)境中存在前列腺素2(prostaglandin E 2,PGE2)等免疫抑制因子相關。PGE2被證實能激活HPK1，而在HPK1基因缺失的小鼠模型中，PGE2誘導的Lewis肺癌細胞的生長明顯受到抑制。研究人員將3LL細胞靜脈注射到野生型或HPK1-/-小鼠中，免疫組化發(fā)現(xiàn)HPK1-/-小鼠的腫瘤灶中存在CD3+淋巴細胞浸潤，野生型小鼠腫瘤灶中未檢測到，進一步發(fā)現(xiàn)CD4+和CD8+T細胞均有浸潤；再將野生型或HPK1-/-的T細胞與3LL細胞一起轉(zhuǎn)移到T細胞缺陷的RAG-/-宿主中，發(fā)現(xiàn)接受HPK1-/-T細胞的小鼠肺部腫瘤病灶數(shù)量和大小均顯著減少。腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocyte, TILs)的存在以及T細胞轉(zhuǎn)移到T細胞缺陷小鼠體內(nèi)的實驗結(jié)果表明腫瘤排斥反應是T細胞介導的。進一步分析表明可能是由于HPK1敲除的T細胞能夠耐受PGE2介導的對T細胞增殖、IL-2產(chǎn)生和凋亡的抑制。因此得出結(jié)論，PGE2通過HPK1抑制T細胞介導的抗腫瘤反應[10]。

55 ku的HPK1相互作用蛋白(HPK1-interaction protein of 55 ku, HIP-55)，又稱DBNL、SH3P7和mAbp1，是一種多域結(jié)合蛋白，對器官發(fā)育和免疫反應至關重要，能夠調(diào)控心血管功能、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)元形態(tài)等[22]。HIP-55是適當?shù)募毎L控制所必需的，有研究顯示，HIP-55在肺癌細胞系和肺癌患者的腫瘤組織中上調(diào)，增強HIP-55的表達可促進肺癌細胞的增殖、集落形成、遷移和侵襲，而沉默HIP-55可逆轉(zhuǎn)這些效應。實驗證明，14-3-3蛋白參與HIP-55對HPK1-JNK信號通路的調(diào)節(jié)。機制上，HIP-55調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生的機制可能是通過其與HPK1的相互作用，HIP-55介導的腫瘤發(fā)生活性似乎部分通過拮抗HPK1的功能介導。HIP-55與HPK1的相互作用可成為一種針對HIP-55介導的癌癥的新策略，比如抑制HIP-55或破壞HIP-55與HPK1的相互作用[23]。

2.3 HPK1與胰腺癌胰腺癌惡性程度高，通常預后不良，5年生存率不足10%，被稱為“癌中之王”，2020年全球新發(fā)病例占比為2.6%，死亡人數(shù)與新發(fā)病例數(shù)幾乎一樣，是男女癌癥死亡的第7大原因[19]。

有研究表明，HPK1在胰腺癌組織中丟失，HPK1蛋白表達的缺失與胰腺上皮內(nèi)瘤變(pancreatic intraepithelial neoplasia, PanIN)的進展和侵襲性胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinomas, PDA)的發(fā)展顯著相關，可能有助于胰腺癌的腫瘤發(fā)生[24]。該研究同時表明，PDA中的HPK1蛋白表達缺失是通過蛋白酶體途徑實現(xiàn)的，這需要HPK1激酶活性來降解。HPK1在胰腺癌中穩(wěn)定p21和p27并導致細胞周期停滯，進一步證明HPK1可能在PDA中作為腫瘤抑制基因發(fā)揮作用。

Song等[11]研究發(fā)現(xiàn)，HPK1是一種腫瘤抑制因子，通過靶向Axl進行內(nèi)吞轉(zhuǎn)運和溶酶體降解下調(diào)AXL蛋白表達及其下游信號通路。HPK1優(yōu)先通過其C端結(jié)構(gòu)域與Axl相互作用，并導致Axl的下調(diào)，HPK1介導的Axl降解依賴于HPK1激酶活性。此外，還發(fā)現(xiàn)HPK1增加了Axl與原癌基因c-Cbl的結(jié)合，促進Axl泛素化并加速Axl內(nèi)化，通過內(nèi)體運輸?shù)饺苊阁w進行降解。在人類PanIN病變中，Axl蛋白表達與HPK1表達呈負相關，HPK1的低表達和AXL的高表達與胰腺導管腺癌患者的低生存率顯著相關。

一項使用HPK1-M46轉(zhuǎn)基因小鼠的研究表明，HPK1的免疫抑制功能需要HPK1激酶活性，激酶結(jié)構(gòu)域的失活增強了抗腫瘤免疫反應和抗PD-L1功效。說明使用選擇性小分子抑制劑結(jié)合免疫檢查點抑制劑治療，靶向免疫細胞中的HPK1激酶活性可能是有效癌癥治療的替代策略[2]。然而，HPK1激酶活性是胰腺癌中HPK1介導的致癌酪氨酸受體AXL降解及其下游信號通路抑制所必需的，因此，HPK1在腫瘤細胞中與腫瘤微環(huán)境中免疫細胞的相互作用和激活中的作用還有待研究[11]。

2.4 HPK1與膀胱癌膀胱癌是全球第10大常見的癌癥，2020年大約有57.3萬新發(fā)病例，占所有癌癥新發(fā)病例數(shù)的3.0%，約21.3萬人死亡。男性中更為常見，發(fā)病率和死亡率約為全球女性的4倍，是男性第6大常見癌癥和第9大癌癥死亡原因[19]。

Hsa-miR-96位于人類7號染色體上，長度22nt。Hsa-miR-96的靶基因，包括IRS1和HPK1。Wang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱尿路上皮癌中，hsa-miR-96的表達水平高于正常組織，且無性別差異。hsa-miR-96的下調(diào)顯著影響膀胱癌T24細胞的表型，抑制細胞的增殖與遷移并促進細胞的凋亡。與對照相比，hsa-miR-96的下調(diào)會導致T24細胞中IRS1和HPK1的mRNA水平和蛋白水平顯著降低，MAP2K2的表達無差異，表明hsa-miR-96可能通過上調(diào)IRS1和HPK1水平來影響膀胱癌T24細胞的生長。

2.5 HPK1與其他腫瘤據(jù)報道，HPK1還與其他幾種腫瘤相關。HPK1高拷貝數(shù)與接受奧沙利鉑為基礎化療的III期結(jié)直腸癌患者的復發(fā)和生存一致相關，強調(diào)HPK1在調(diào)節(jié)奧沙利鉑反應中的重要作用及其作為以奧沙利鉑為基礎的化療療效的生物標志物的潛力[25]。

HPK1在高三尖杉酯堿(homoharringtonine，HHT)誘導的抗性AML細胞系中高度表達。HPK1在AML細胞中的過表達誘導了AML細胞對HHT的抵抗。HPK1的過度表達是預測AML預后不良的獨立風險因素。體外研究顯示，HPK1通過MAPK和DNA損傷/修復途徑調(diào)控細胞周期，揭示HPK1是開發(fā)AML治療方法的一個潛在目標[26]。

3 靶向HPK1的藥物研發(fā)現(xiàn)狀

腫瘤免疫逃逸有兩種機制[27]，其一是腫瘤細胞下調(diào)其抗原加工/遞呈機制，如主要組織相容性復合體(MHC)I、蛋白酶體亞基潛伏膜蛋白(LMP)2和LMP7、抗原加工相關的轉(zhuǎn)運蛋白(TAP)和tapasin，以阻止被T細胞識別，造成腫瘤免疫逃逸；另一機制是腫瘤細胞向腫瘤微環(huán)境分泌免疫抑制因子，如TGF-β、IL-8、IL-10、VEGF、ROS等，抑制T細胞功能和/或樹突細胞的成熟，導致腫瘤抗原向T細胞交叉遞呈缺陷。

腫瘤細胞通過促進其PD-L1和B7-1/2分別與T細胞上的免疫檢查點蛋白PD-1和CTLA-4結(jié)合，或者增加PD-L1和PD-1的表達，均可導致T細胞衰竭[28]。HPK1誘導腫瘤浸潤性T細胞障礙，減弱T細胞、B細胞和樹突狀細胞的免疫應答，是一個潛在的腫瘤免疫治療靶點，且可與PD1/PD-L1聯(lián)用。但截至目前，尚無HPK1相關藥物上市，進展較快的在研藥物處于臨床Ⅰ或Ⅰ/Ⅱ期，均為腫瘤免疫治療。

2021年3月，百濟神州宣布其開發(fā)的高活性、高選擇性HPK1小分子抑制劑BGB-15025 的Ⅰ期臨床試驗(NCT04649385)，已完成首例患者給藥。該臨床試驗采取BGB-15025單用和與PD-1單克隆抗體替雷利珠單抗聯(lián)用，治療晚期實體瘤患者。根據(jù)開發(fā)公司公布的臨床前數(shù)據(jù)，BGB-15025可增加PMBC中IL-2的產(chǎn)生；CT26WT同源模型中聯(lián)用PD-1抗體，低至1 mg·kg-1也可表現(xiàn)出顯著的聯(lián)用效果：68%的腫瘤體積小于100 mm3，28%達到無瘤狀態(tài)；初步毒理研究還表明BGB-15025治療窗較寬，約20～50倍。

2020年9月，由Treadwell Therapeutics公司開發(fā)的新型、口服強效HPK1激酶抑制劑CFI-420411的Ⅰ/Ⅱ期臨床研究(NCT04521413)，將進行首次患者給藥，擬采取單用或聯(lián)合帕博利珠單抗在實體瘤患者中的療效。專利中(WO2016205942)示例性化合物A1對HPK1的IC50小于0.05 μmol·L-1。CT26結(jié)腸癌細胞系異種移植模型研究顯示，每日給藥一次劑量為75 mg·kg-1和150 mg·kg-1g的A1分別使腫瘤生長抑制44%和64%，21 d存活率分別為25%和37.5%；抗PD-1抗體單用TGI為34%，21 d存活率為12.5%，與150 mg·kg-1的A1聯(lián)用可使TGI增至86%，21 d存活率提高至87.5%，顯示出良好的體內(nèi)抗腫瘤活性。以上兩種藥物的臨床前實驗數(shù)據(jù)均提示，HPK1抑制劑與抗PD-1抗體聯(lián)用可能是一個較好的方案。

西安宇繁的XYF-19 CAR-T細胞，正在開展在復發(fā)或難治性CD19+血液系統(tǒng)惡性腫瘤的安全性研究，利用慢病毒載體向T細胞插入CD19特異性嵌合抗原受體，用CRISPR基因編輯消除內(nèi)源性HPK1，目前也處于Ⅰ期臨床(NCT04037566)。開發(fā)人員的研究報道，HPK1敲除的CD19 CRA-T細胞能降低瘤內(nèi)T細胞衰竭標志物PD-1、TIM-3和LAG-3表達水平，促進細胞因子IL-13、IL-2的分泌，從而提高抗腫瘤作用[18]。

此外，還有一些對HPK1有較好抑制活性的化合物被報道。GNE-1858是一種ATP競爭性抑制劑，能夠以劑量依賴性方式抑制HPK激酶結(jié)構(gòu)域的所有3種變異。在SLP76磷酸化實驗中，對野生型HPK1和活性模擬突變體HPK1-TSEE的抑制作用相同，IC50均為1.9 nmol·L-1，對HPK1-SA的殘余激酶活性的IC50為4.5 nmol·L-1[14]。選擇性小分子抑制劑CompK，能夠顯著改善人類T細胞的功能，增強TCR識別病毒和腫瘤相關抗原的能力以及CD8+T細胞對腫瘤的溶解活性，與抗PD-1有顯著協(xié)同作用；動物研究顯示，CompK聯(lián)合PD-1抗體治療表現(xiàn)出免疫應答的提高和極好的抗腫瘤療效；該研究還發(fā)現(xiàn)HPK1激酶的抑制可通過調(diào)節(jié)人類樹突狀細胞及其相關網(wǎng)絡來促進抗腫瘤免疫[29]。

4 小結(jié)

相較于傳統(tǒng)的手術、放療和常規(guī)化療，尋找合適的靶點來實現(xiàn)抗腫瘤免疫治療成為具有前景的手段之一。HPK1作為一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，負調(diào)控TCR/BCR信號以及樹突狀細胞介導的免疫反應，已被證實與多種癌癥的發(fā)生、進展相關聯(lián)，是一個適合腫瘤治療干預的靶點。但在不同癌癥中，HPK1所發(fā)揮的作用似乎有所差別，如在乳腺癌、胰腺癌中，其可能發(fā)揮抑癌作用，而在已開展臨床試驗的藥物中，除XYF-19 CAR-T細胞治療明確表示適應癥為血液瘤外，另兩項針對實體瘤的適應癥尚不知曉，因此，在開發(fā)靶向HPK1藥物過程中需注意篩選相應的腫瘤適應癥。

MAP4K家族中除HPK1(MAP4K1)外，還有MAP4K2、MAP4K3、MAP4K4、MAP4K5和MAP4K6五個成員。其中，MAP4K3又稱為GLK激酶，它和HPK1都與SLP-76結(jié)合，但在TCR信號通路中作用相反[30]：SLP-76介導GLK激酶的激活，活化的GLK與PKCθ相互作用并激活PKCθ，導致T細胞活化；而HPK1磷酸化SLP-76的Ser-376，誘導激活的SLP-76的蛋白酶體降解，導致TCR信號的衰減。因此，在藥物開發(fā)中要注意篩選出對GLK激酶具有選擇性的HPK1抑制劑。