戴傳超， 張 偉

(南京師范大學 生命科學學院，江蘇 南京 210023)

花生是我國重要的油料作物，2019年種植面積達到460萬hm2，年產量達到1 752萬t[1]，占我國油料種植面積的35%。我國花生種植面積居世界第二位，產量居世界第一位，是少數(shù)具有比較優(yōu)勢的產業(yè)[2]。在大豆受到國外轉基因品種沖擊的情況下，花生對于保障我國油料安全顯得尤為重要。我國花生產區(qū)分布廣，全國大部分地區(qū)都能種植，其中華北平原地區(qū)和南方丘陵紅壤地區(qū)是主要產區(qū)。由于很多地區(qū)花生需要連作種植，因此緩解連作障礙是需要解決的問題?；ㄉB作障礙的產生，與病原菌富集、土壤微生物區(qū)系的惡化、土壤化感物質的積累、養(yǎng)分虧缺等有關[3-4]。緩解花生連作障礙也和上述因素的調控有關。微生物因素是導致花生連作障礙的重要因素，近年來，采用有益微生物緩解花生連作障礙取得了較好的效果。闡明有益微生物緩解花生連作障礙的機理，是該技術進一步發(fā)展和應用的關鍵。

1 有益微生物分解化感物質

化感作用指的是植物(包括微生物)向周圍環(huán)境中釋放化學物質(化感物質)，對另一種植物(包括微生物)生長和發(fā)育產生影響的作用[5-6]。許多植物根系可以產生化感物質，比如水稻、小麥、大豆和花生等。這些植物釋放化感物質抑制周圍其他植物的生長，有些情況下也會對自身的生長和發(fā)育產生不利影響，這也被稱為化感自毒作用[7]。目前，已知化感物質主要包括：①酚類，如苯甲酸、對羥基苯甲酸；②香豆素類，如香豆素、補骨脂素；③醌類，如高粱醌、胡桃醌；④黃酮類，如木犀草素、六羥黃酮；⑤萜類，如麥角固醇、桉樹腦；⑥生物堿，如小檗堿。植物釋放化感物質的途徑主要包括：①通過揮發(fā)性氣體的方式釋放；②通過根系分泌物的形式釋放；③植物殘茬降解產生的化感物質釋放[7]?；形镔|通過影響細胞膜通透性、光合活性、礦質元素吸收、DNA和蛋白質合成，從而抑制植物生長和發(fā)育[8-9]。

花生連作土壤中積累了大量的酚酸類化感物質，且隨著連作種植年限的增加而增加。李培棟等[10]研究發(fā)現(xiàn)，連作10 a的花生土壤中，三種主要酚酸類物質，對羥基苯甲酸、香草酸和香豆酸的含量達到11.09 mg/kg干土，顯著高于連作3和6 a的土壤，該濃度下的酚酸會顯著降低花生幼苗的株高和根長。除了對花生植株造成直接的傷害外，酚酸類物質的積累還會刺激土傳病原菌的生長和繁殖，加重花生的病害[11]。因此，降低連作土壤中化感物質，有助于花生的生長發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)花生相關微生物隨植物凋落物進入土壤，并在土壤中作為腐生菌發(fā)揮植物殘茬降解的功能。因此，花生相關微生物具有降解土壤化感物質的潛力。

目前，研究人員已經分離到多種能夠降解酚酸類化感物質的微生物，主要包括：①細菌：芽胞桿菌(Bacillussp.)、假單胞菌(Pseudomonassp.)、根瘤菌(Rhizobiasp.)、伯克霍爾德菌(Burkholderiasp.)、紅球菌(Rhodococcussp.)；②真菌：白腐真菌(Phanerochaetesp.)、擬莖點霉(Phomopsissp.)、鐮刀菌(Fusariumsp.)[12]。例如，惡臭假單胞菌(PseudomonasputidaKT2240)具有降解沒食子酸的能力，且gal基因簇在降解過程發(fā)揮著重要作用[13]。黃孢原毛平革菌可以有效降解常見酚酸：香草酸、阿魏酸和對羥基苯甲酸。該菌與三種酚酸共培養(yǎng)3 d，降解率分別達到98.39%、97.88%和58.20%[14]。南京師范大學微生物資源與生態(tài)課題組(本課題組)前期在探究連作障礙中酚酸類物質的微生物降解時發(fā)現(xiàn)，一株廣譜植物內生真菌楓香擬莖點霉(Phomopsisliquidambaris)可以有效降解酚類和黃酮類化感物質，包括對羥基苯甲酸、阿魏酸、芥子酸、木犀草素、白藜蘆醇[15-19]。同時，研究發(fā)現(xiàn)原兒茶酸是多種酚酸降解過程中普遍存在的中間代謝產物。原兒茶酸隨后在原兒茶酸3,4-雙加氧酶的催化下，進入三羧酸循環(huán)。此外，將楓香擬莖點霉施加至連作花生土壤中，可有效降低花期后土壤中對羥基苯甲酸、香草酸和香豆酸的含量[11]，并顯著提高花生的產量。

酚酸類物質的降解主要涉及到酚酸脫羧酶、羥化酶和加氧酶。目前，對于酚酸類物質降解過程中的關鍵酶和關鍵基因調控的研究也取得重要進展。Yoshida等[20]鑒定出根瘤菌(Rhizobiumsp. strain MTP-10005)參與龍膽酸代謝相關的基因簇，包括graRDAFCBEK、graA、graB、graC和graD。酶學實驗表明graD、graA、graC和graB分別編碼一個間苯二酚羥化酶(EC 1.14.13.x)的還原酶(GraD)和氧化酶(GraA)組分，馬來酰乙酸還原酶(GraC)(EC 1.3.1.32)和偏苯三酚1,2-雙加氧酶(GraB)(EC 1.13.11.37)。Chen等[15]發(fā)現(xiàn)對羥基苯甲酸羥化酶、3,4-二羥基苯甲酸脫羧酶、鄰苯二酚1,2-雙加氧酶是楓香擬莖點霉降解對羥基苯甲酸所需的關鍵酶。Wang等[18]指出楓香擬莖點霉在降解木犀草素時，原兒茶酸3,4-雙加氧酶和偏苯三酚1,2-雙加氧酶是降解過程中的關鍵酶。

2 有益微生物改變花生根際微生物區(qū)系

土壤微生物區(qū)系的失衡是導致花生連作減產的重要原因之一。化感物質可以作為病原真菌的碳源[11]，因此，連作土壤微生物群落呈現(xiàn)出病原真菌豐度增加，有益真菌減少，以及病原細菌增加等特征。Li等[21]報導連作種植顯著增加結莢期和成熟期時花生根際土壤中尖孢鐮刀菌、淡色生赤核菌、莖點霉等病原真菌的豐度，降低木霉等有益真菌的豐度。相似地，花生連作根際土壤中的細菌(特別是有益細菌)多樣性降低，細菌群落功能簡化[22-23]。通常而言，土壤中細菌和放線菌種群多樣性越高，其限制病原菌生長和繁殖的能力就越強。因此，連作花生土壤微生物區(qū)系的改善主要是降低土傳病原真菌的豐度和/或增加有益微生物的豐度。目前，修正連作花生土壤微生物區(qū)系的措施主要包括輪作換茬、施加有機肥、土壤消毒和使用有益微生物制劑，比如菌根菌、根際促生細菌(Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)。

田間試驗表明使用微生物制劑可以有效地緩解農作物的連作障礙。封海勝等[24]報道生物菌劑的施加可以顯著增加花生生長和莢果產量。Ma等[25]報道施加粘質沙雷氏菌RZ-21可以增加花生連作土壤細菌數(shù)量，降低真菌，特別是鐮刀菌的數(shù)量，從而增加花生莢果數(shù)目。粘細菌(Corallococcussp. strain EGB)固體發(fā)酵菌劑通過調控土壤微生物區(qū)系，從而降低土壤尖孢鐮刀菌的豐度[26]。叢枝菌根真菌(Arbuscualr mycorrhizal fungi, AMF)已經被廣泛用作微生物制劑，可以有效地改善根際微環(huán)境，增加植物營養(yǎng)物質攝取和脅迫耐受能力。在土壤中施加AMF菌劑不僅可以增加有益微生物的數(shù)量，還可以降低土傳病原菌的豐度。因此，AMF菌劑也被用來緩解花生連作障礙。例如，崔利等[27]研究報道摩西管柄囊霉(Funneliformismosseae)可以降低花生根際曲霉、鐮刀菌和赤霉菌豐度，增加細菌Gaiella豐度，從而提高花生產量和品質。

綜合已有研究的報道，我們認為有益微生物菌劑修正連作花生根際微生物群落的機制可能包括降解化感物質、改變花生根系分泌物組分、拮抗土傳病原菌的繁殖和擴散等。植物根部釋放化感物質，如酚酸類物質不僅對植物造成直接的損傷，還作為碳源促進病原菌在土壤里的存活和繁殖。例如，酚酸類物質刺激鐮刀菌的生長和毒素的產生[28-29]。因此，改變花生根系分泌物的組成，減少根際土傳病原菌的豐度，降低病害發(fā)生的幾率，可一定程度上緩解花生連作障礙。Xie等[11]報道楓香擬莖點霉通過降解土壤中酚酸類物質對羥基肉桂酸、香草酸和對羥基苯甲酸，降低土壤中鐮刀菌的豐度，緩解花生根腐病害。此外，楓香擬莖點霉定殖在花生根內，改變花生根系分泌物組分，增強花生根瘤菌的趨化和繁殖，增加根際細菌，包括根瘤菌的豐度[30-31]。有益細菌組成的生防菌劑通過產生抗生素、溶菌酶、鐵載體等殺死土傳病原菌，達到降低病害的效果。例如，粘細菌(Corallococcussp. strain EGB)通過分泌胞外酶β-1,6-葡聚糖酶GluM，降解真菌細胞壁，從而殺死真菌降低植物病害[32]。根際促生細菌通過產生鐵載體，與病原菌競爭鐵，從而降低病原菌數(shù)量[33]。因此，通過微生物菌劑改善連作土壤微生物群落和降低花生病害，是緩解花生連作障礙的一項經濟有效的措施。但微生物菌劑的使用效果會受到田間溫度、濕度和土著微生物的影響。因此，針對不同地區(qū)、氣候、土壤環(huán)境和作物，開發(fā)相應的微生物菌劑是必要的。此外，連作花生微生物群落的解析和改善都集中于根際土壤環(huán)境，對于花生地上部分組織(葉和花)微生物的探究還不足。最近有研究報導葉際微生物的紊亂會引起葉片病害，降低植物的光合活性[34]。因此，未來的研究應關注連作花生葉際微生物群落的變化，以及開發(fā)針對葉部病害的微生物菌劑。

3 有益微生物促進花生抗病

連作種植導致土壤中病原菌積累，引起花生病害是導致連作花生產量下降的重要原因。其中由病原真菌，包括鐮刀菌、炭疽病菌、齊整小核菌等引起的根腐病、葉斑病、莖腐病是主要的花生病害。病原菌的積累主要是因為土壤化感物質的積累，以及拮抗微生物的減少。目前，降低花生病害的措施主要有土壤熏蒸消毒、施加生防菌、合理的間作等。土壤殺菌劑的使用可以有效地控制土傳病病原菌密度，降低花生病害。但是，土壤熏蒸劑的使用會帶來環(huán)境污染和人體健康等新的問題。合理的間作是降低花生病害的有效措施。田間試驗表明間作可以提高作物根際土壤細菌數(shù)量和多樣性，同時改善土壤理化性質和土壤養(yǎng)分循環(huán)[35-36]。

利用微生物防治花生病害，就是將生防菌以一定的形式施加到連作土壤中，分解土壤有害物質、促進養(yǎng)分循環(huán)、改善土壤酶活和土壤微生物群落結構，降低土壤中病原真菌密度，誘導植物系統(tǒng)免疫，降低花生病害，增加花生產量。微生物防治連作花生病害主要的機制包括拮抗土壤病原菌、調節(jié)土壤微生物群落和誘導植物系統(tǒng)防御等。拮抗土壤病原菌和調節(jié)土壤微生物群落在上節(jié)中已闡述。因此，本節(jié)重點討論微生物誘導植物系統(tǒng)(Induced Systemic Resistance，ISR)，抵抗花生病害。這個過程是由生防菌的效應子蛋白或揮發(fā)物觸發(fā)，增強宿主植物的免疫力，從而降低病原菌的發(fā)病率和嚴重程度[37-38]。一些信號分子，比如茉莉酸(Jasmonic acid)、乙烯(Ethylene)和水楊酸(Salicylic acid)參與其中[37]。Madhaiyan等[39]報道接種一株甲基桿菌通過系統(tǒng)誘導花生防御相關的苯丙氨酸解氨酶、β-1,3-葡聚糖酶和過氧化物酶，從而抵抗由黑曲霉和白絹病菌引起的葉斑病。相似地，Kishore等[40-41]報道預先噴施一株能降解幾丁質的粘質沙雷氏菌(SerratiamarcescensGPS5)和一株不能降解幾丁質的銅綠假單胞菌(PseudomonasaeruginosaGSE18)可以增強花生幾丁質酶、β-1,3-葡聚糖酶、過氧化物酶和苯丙氨酸解氨酶的活性，并降低花生晚斑病和莖腐病。有益真菌在防治花生病害方面也有一定的研究?；ㄉN子用木霉(TrichodermaharzianumITEM3636，TrichodermalongibrachiatumITEM3635)處理降低腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)引起的根腐病害[42]。植物內生真菌楓香擬莖點霉通過誘導抗氧化酶、胼胝質沉積、細胞木質化和植物抗毒素積累來抵抗葉斑病和根腐病[43]。進一步的研究表明楓香擬莖點霉預接種通過SA-依賴的防御信號途徑來激活花生病程相關蛋白，達到抵抗病原菌的效果[44]。

4 有益微生物促進花生結瘤固氮

作為豆科植物，花生可以與土壤中的根瘤菌，主要是慢生根瘤菌建立共生關系，形成根瘤結構，固定空氣中的氮氣?；ㄉ?根瘤菌結瘤固氮為花生生產提供了大部分的氮素?；ㄉ透鼍慕Y瘤固氮過程分為相互作用雙方的識別、結瘤的起始、根瘤的發(fā)育和衰老[42，45]。在進入花生根組織之前，根瘤菌必須在根表面定殖。這個過程包括根瘤菌向根部的移動，兩者相互識別，最后黏附在根上。根系分泌物中的糖、氨基酸和有機酸等被證明可以誘導慢生根瘤菌向花生根部的趨化運動[30-31]。其中，黃酮類物質包括芹菜素、木犀草素、染料木黃酮可以誘導慢生根瘤菌結瘤基因的表達，誘導結瘤因子(nodulation factors)的合成[30-31]。結瘤因子被宿主植物細胞膜上的特定受體識別，激活共生信號通路(Symbiosis signaling pathway)。與研究較為透徹的根瘤菌根毛侵染方式不同，慢生根瘤菌侵染花生的模式是較為古老的裂隙侵染[42，46]。根瘤菌穿過細胞壁，進入皮層細胞，隨后根瘤菌快速繁殖和分化，形成根瘤。

連作種植土壤可以認為是多種生物和非生物脅迫的綜合環(huán)境。已有研究報導花生連作種植降低根部根瘤數(shù)目和固氮能力[47]。因此，提高花生結瘤和固氮能力是增加連作花生產量的有效措施。目前，外源有益微生物促進連作花生結瘤和固氮的可能機制包括：①增加土壤根際中花生根瘤菌的豐度；②產生植物激素促進花生根系發(fā)育和根瘤發(fā)育；③促進花生對于營養(yǎng)元素的吸收；④產鐵載體；⑤增加花生對于病原菌的抗性。Zhang 等[48]發(fā)現(xiàn)楓香擬莖點霉可以形成菌絲網絡，協(xié)助慢生根瘤菌擴散至花生根際，促進花生起始結瘤。同時，該研究表明根瘤菌的趨化和運動被系統(tǒng)誘導，根瘤菌的主動運動與此誘導有關。此外，Xie等[30]和Wang等[31]發(fā)現(xiàn)楓香擬莖點霉作為內生菌定殖花生，可以增加根系分泌可溶性糖、氨基酸、有機酸、酚酸和黃酮等物質，這些分泌物可以導致慢生根瘤菌趨化性并促進其生長。因此，楓香擬莖點霉一方面降解土壤酚類化感物質，弱化其對于花生根瘤菌趨化的干擾，另一方面作為菌絲通道以及改變根系分泌物組分，增加根瘤菌在根際的富集。此外，楓香擬莖點霉被報道可以增加根瘤內部可培養(yǎng)有益細菌的數(shù)量，在促進結瘤和固氮中可能發(fā)揮著一定的作用[49]。已有研究報道有益微生物通過產生生長素促進植物根系發(fā)育，增強結瘤。接種產生長素的楓香擬莖點霉可以促進花生結瘤[50]。值得注意的是，Zhang等[50]證明生長素不僅可以通過增加花生側根形成，為結瘤提供更多位點，而且還直接作用于結瘤過程，即促進根瘤維管束形成和增強根瘤的碳代謝。Li等[51]報道與輪作相比，連作花生根部生長素信號相關的基因顯著下調。因此，產生長素微生物的存在可一定程度緩解連作對于根系發(fā)育和結瘤的抑制效應。盡管結瘤固氮為宿主提供大量的氮素，但是其過程需要宿主植物提供大量的營養(yǎng)物質，例如碳、磷和鐵[52]。許多有益微生物具有溶磷和產鐵載體的能力。磷和鐵對于植物的光合作用和根瘤的形成和發(fā)育是必須的。比如，鐵的不足使得結瘤起始延遲，以及根瘤的固氮活性下降[53-54]。溶磷和產鐵微生物通過為植物提供磷和鐵，一方面促進光合作用，為結瘤提供碳源，另一方面促進根瘤的形成和發(fā)育。由土傳病原真菌引起的花生病害是限制連作花生產量的主要原因[21]。連作花生常見的病害包括由真菌引起的根腐病、莖腐病、葉斑病、銹斑病和炭疽病，以及由細菌引起的青枯病等。這些病害抑制植物的生長發(fā)育，降低根瘤的數(shù)目和固氮。同時，根際處的病原菌可以與根瘤菌競爭生存空間和營養(yǎng)物質，降低根瘤菌的數(shù)量。有益微生物通過直接地拮抗或是間接通過ISR，降低花生病害，促進結瘤和固氮。值得注意的是，大部分篩選出來的有益微生物同時具備產生長素、溶磷、產鐵載體和拮抗病原菌活性的能力。此外，由于微生物和微生物之間的相互作用可以進一步提高其促植物生長活性，一些研究開始嘗試構建合成微生物群落(Syncom)來協(xié)助植物抵抗外界脅迫[55-56]。目前還鮮見合成微生物群落在連作花生結瘤和增產方面的研究。因此，合成微生物的建構以及對于連作花生結瘤和固氮能力的評價會是未來研究的方向之一。

5 有益微生物促進花生養(yǎng)分吸收

土壤養(yǎng)分失衡是花生連作障礙發(fā)生的重要原因。由于花生對于養(yǎng)分的選擇性吸收，導致土壤有效養(yǎng)分失衡，特別是微量元素的缺乏。有效養(yǎng)分的失衡一方面導致花生生長發(fā)育不足、抗病能力下降，造成花生果空殼，另一方面會引起微生物區(qū)系的改變[57]。微量元素是植物生長發(fā)育過程不可缺少的元素，它們參與植物體內幾乎所有新陳代謝過程，缺乏時可嚴重影響作物產量和品質?；ㄉv果的形成需要從土壤中攝取大量的鈣、硼和鉬。連作土壤缺乏鈣、硼和鉬，導致大量花生果空殼[58]。土壤中鐵的缺乏可導致花生結瘤不足[53]，以及植物防御能力下降[59]。有益微生物已經被證明可促進植物養(yǎng)分吸收，增加植物對于脅迫的耐受能力。盡管在連作土壤中施加足夠的氮、磷、鉀、鐵、硼、鉬等元素，花生總干物質和莢果產量仍隨著連作年限的增加而降低[60]。因此，提高連作花生對于土壤養(yǎng)分的吸收尤為重要。

有益微生物，主要是有益真菌被報道能促進植物對于養(yǎng)分的吸收。真菌與宿主植物建立共生關系，形成大量根外菌絲，一方面擴大根的吸收范圍，攝取土壤養(yǎng)分和水，提供給宿主植物；另一方面分泌含碳化合物活化菌絲周圍細菌[61-62]。AMF與苜蓿建立共生后，根外菌絲釋放果糖，提高解磷細菌磷酸酶活性，促進植物對于磷的吸收。Labidi等[63]發(fā)現(xiàn)在碳酸鈣脅迫下，AMF共生能夠促進植物根部吸收鐵、鋅和銅。有趣的是，Xie等[64]和蘇春淪等[65]發(fā)現(xiàn)在連作種植條件下，內生真菌楓香擬莖點霉接種可促進花生對于大量元素氮、磷、鉀和微量元素鉬、鐵和硼的吸收，改善花生的生理代謝水平，提高花生的產量和品質。進一步的研究發(fā)現(xiàn)楓香擬莖點霉提高了花生根中鐵轉運基因FRO1和IRT1，以及鉬轉運基因MOT1的表達[65]。考慮到鉬鐵元素在花生結瘤中的重要性，因此，楓香擬莖點霉介導的連作花生結瘤固氮增強可能部分歸因于鉬鐵元素吸收的增加。有意思的是，在干旱脅迫下，楓香擬莖點霉接種重構了花生根際叢枝菌根真菌群落，增加了巨孢囊霉屬，從而幫助花生抵抗干旱[66-67]。因此，我們認為楓香擬莖點霉促進連作花生對于養(yǎng)分吸收的部分原因可能是其重構了根際叢枝菌根群落。

6 展 望

花生連作障礙是生產中迫切需要解決的問題。由于不同地區(qū)土壤特性、氣候原因，解決花生連作障礙需要采取針對性的措施。闡明形成連作障礙的原因，篩選微生物緩解連作障礙，并從理論上進行闡述，是緩解花生連作障礙的重要手段。由于單一微生物功能往往有限，而形成花生連作障礙的原因是多方面的，因此采用多種微生物協(xié)同作用，將是未來緩解花生連作障礙的重要措施。目前在這個領域還需要更多的有針對性的研究。