趙玉卉, 郭 瑞, 楊阿麗, 秦 鵬, 金 輝,魏甲乾, 冉永紅， 陳志榮, 路等學(xué)*

(1.甘肅省科學(xué)院 生物研究所，甘肅 蘭州 730000；2.中國科學(xué)院 蘭州化學(xué)物理研究所 中國科學(xué)院西北特色植物資源化學(xué)重點實驗室，甘肅 蘭州 730000；3.定西市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，甘肅 定西 743000；4.溫州醫(yī)科大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，浙江 溫州 325000)

羊肚菌(Morchellaspp.)屬子囊菌門(Ascomycota)盤菌綱(Pezizomycetes)盤菌目(Pezizales)羊肚菌科(Moechellaceae)羊肚菌屬(Morchella)，因其外形似羊肚而得名[1]。羊肚菌富含蛋白質(zhì)、大量人體必需氨基酸，多種維生素和高含量的鐵、鋅以及多種礦質(zhì)元素[2-3]，具有抗射線、抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞作用以及降血壓、降血脂、調(diào)節(jié)免疫力的功效[4]。羊肚菌經(jīng)濟(jì)價值和科研價值高，人工栽培一直是研究的熱點。2012年后，我國羊肚菌大田種植技術(shù)取得重要進(jìn)展，在全國范圍內(nèi)得到推廣，種植面積陡增。經(jīng)過10多年的發(fā)展，出菇不穩(wěn)定、不出菇、產(chǎn)量不高等問題依然普遍存在，且有新的問題不斷出現(xiàn)，如病蟲害[5-8]和連作障礙[9-10]等問題。究其原因是羊肚菌基礎(chǔ)理論的研究不夠，羊肚菌的生活史、菌核的機(jī)理、分生孢子的作用等有待進(jìn)一步研究；羊肚菌是一種土生菌，不覆土羊肚菌無法出菇，可見土壤中含有特定刺激其結(jié)實的有益因子[11]。土壤中除了營養(yǎng)物質(zhì)，豐富的土壤微生物對其生長有一定的影響。已有研究者對羊肚菌內(nèi)生細(xì)菌、根際土壤細(xì)菌多樣性等進(jìn)行了研究[12-15],結(jié)果表明羊肚菌根際土壤的細(xì)菌多樣性指數(shù)和豐度比非根際土壤的高。關(guān)于羊肚菌根際土壤真菌群落方面的研究較少，何培新等[16]對羊肚菌內(nèi)生真菌進(jìn)行了研究，結(jié)果表明粗柄羊肚菌的內(nèi)生真菌中，毛殼屬是3個發(fā)生地的共有內(nèi)生真菌，其他內(nèi)生真菌均為發(fā)生地特異種類。有研究顯示真菌群落中，高豐度的孔球孢屬(Gilmaniella)似乎與室內(nèi)紅褐羊肚菌(Morchellarufobrunnea)的結(jié)實有關(guān)，而優(yōu)勢菌群頭束霉屬(Cephalotrichum)與不出菇有關(guān)[17]。土壤理化性質(zhì)與土壤酶是影響土壤微生物群落數(shù)量、結(jié)構(gòu)的主要因素之一[18]，但羊肚菌根際土壤理化性質(zhì)及酶活性與真菌群落相互關(guān)系的研究未見相關(guān)報道。本研究采用高通量測序技術(shù)，對甘肅不同地區(qū)羊肚菌根際土壤真菌群落組成、多樣性等結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行系統(tǒng)研究，并結(jié)合土壤理化性質(zhì)和酶活性，分析羊肚菌根際微生態(tài)各要素之間的相互關(guān)系，以期揭示根際微生態(tài)系統(tǒng)對羊肚菌生態(tài)適應(yīng)的內(nèi)在機(jī)制，并為羊肚菌的人工種植及生態(tài)功能研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 根據(jù)羊肚菌在甘肅省不同區(qū)域的分布情況，設(shè)置9個采樣點，在相同經(jīng)緯度分別設(shè)置DS、DC采樣點和LC、LK采樣點。原因是DS、LC采樣點的羊肚菌屬黑色系，而DC、LK采樣點的羊肚菌屬黃色系，其他采樣點羊肚菌均為黑色系，具體信息見表1。每個采樣點內(nèi)設(shè)置3個10 m×10 m樣方，作為平行重復(fù)，每個樣方內(nèi)選取長勢良好的羊肚菌，用干凈的鐵鏟采集子實體及其半徑5 cm、深度0～5 cm的土壤，從距離羊肚菌根際最近的位置用無菌毛刷收集土壤，混合土樣，低溫帶回實驗室，放入-80 ℃冰箱冷凍備用。

1.1.2 試劑與儀器 土壤DNA提取試劑盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit(OMEGA公司)；土壤酶活試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)。pH計(PHS-3C，上海越平)；紫外分光光度計(TU-1950，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；高頻紅外碳硫測定儀(COREY-200，德陽市科瑞儀器設(shè)備廠); 自動定氮儀(K12，上海晟聲自動化分析儀器有限公司);電感耦合等離子體直讀光譜儀(ICAP-7400，賽默飛世爾科技有限公司); 原子熒光光譜儀(AFS-2000，北京海光儀器有限公司)；離子色譜儀(Aquion，賽默飛世爾科技有限公司); 火焰原子吸收儀(Z-2000，日本日立公司)。

表1 野生羊肚菌采樣地信息表

1.2 方法

1.2.1 土壤理化性質(zhì)及酶活性測定 土壤pH值采用酸度計測定[19]，以去除CO2的純水為浸提劑，V水∶V土=2.5∶1；土壤溫度使用土壤溫度計測定；采用重鉻酸鹽法[20]測定土壤有機(jī)質(zhì)含量；采用重鉻酸鉀硫酸消化法[21]測定土壤全氮含量；全碳使用高頻紅外碳硫測定儀測定；銨態(tài)氮采用自動定氮儀測定；硝態(tài)氮采用離子色譜儀測定；有效磷采用紫外分光光度計測定；速效鉀采用火焰原子吸收儀測定；土壤微量元素(Fe、Ca、Mg)含量采用電感耦合等離子體直讀光譜儀測定；Se測定采用原子熒光光譜儀測定。土壤含水量采用烘干法測定，用0.1 g 精度的天平稱取土樣重量，記作土樣濕質(zhì)量重M，105 ℃烘干土樣6～8 h至恒重，記作土樣干質(zhì)量重Ms。土壤含水量(%)=((烘干前鋁盒及土樣質(zhì)量-烘干后鋁盒及土樣質(zhì)量)/(烘干后鋁盒及土樣質(zhì)量-烘干空鋁盒質(zhì)量))×100%。土壤多酚氧化酶活性采用沒食子素比色法測定；土壤過氧化物酶活性采用鄰苯三酚比色法測定；土壤脲酶活性采用靛酚藍(lán)比色法測定；脫氫酶活性采用三苯基四氮唑氯化物(TTC) 比色法測定；土壤堿性磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法測定；芳基硫酸酯酶活性采用對-硝基苯酚比色法測定；谷氨酰胺酶活性采用氨比色法測定；β-葡萄糖苷酶活性采用對-硝基苯酚比色法測定。

1.2.2 土壤樣品總DNA提取與Mi-Seq測序 對采集到的羊肚菌根際土壤樣品，利用土壤DNA提取試劑盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit對土壤總基因組DNA進(jìn)行提取，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度。擴(kuò)增區(qū)域為ITS1-2，通用引物ITS1F：CCCTACACGACGCTCTTCCG-ATCTN (barcode) CTTGGTCATTTAGAGGAAGTA-

A,ITS2-R引物：GTGACTGGAGTTCCTTGGCACC-CGAGAATTCCAGCTGCGTTCTTCATCGATGC。擴(kuò)增體系：15 μL×Taq2 master Mix,1 μL Bar- PCR primer F(10 μmol/L), 1 μL primerR(10 μmol/L),Genomic DNA 10～20 ng，加H2O補(bǔ)足至30 μL。擴(kuò)增條件為94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s、45 ℃ 20 s、65 ℃ 30 s 5個循環(huán)，94 ℃ 20 s、55 ℃ 20 s、72 ℃ 30 s 20個循環(huán)，72 ℃ 5 min。第二輪擴(kuò)增引入Illuminn橋式PCR兼容引物。擴(kuò)增體系：15 μL 2×Taqmaster Mix,1 μL Bar-PCR primerF(10 μmol/L), 1 μL primerR(10 μmol/L),PCR products(上一輪)20 ng，加H2O補(bǔ)足至30 μL。擴(kuò)增條件為95 ℃ 3 min，94 ℃ 20 s、55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s 5個循環(huán)，72 ℃ 5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后回收純化，應(yīng)用Illumina MiSeq 2×300 bp平臺進(jìn)行宏基因組測序。測序服務(wù)和生物信息分析工作由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 Illumina Mi-seqTM得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA堿基識別 (Base Calling) 分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列(Sequenced Reads)，稱之為 Raw Data或Raw Reads。Miseq測序序列中含有barcode序列，以及測序時加入的引物和接頭序列，首先需要去除引物接頭序列，再根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對的reads 拼接 (merge) 成一條序列，然后按照barcode標(biāo)簽序列識別并區(qū)分樣品得到各樣本數(shù)據(jù)，最后對各樣本數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控過濾，得到各樣本有效數(shù)據(jù)(clean reads)。用Usearch 5.2.236軟件對所有樣品的全部clean reads序列進(jìn)行OTUs聚類(97%的一致性)。用Qiime 中的 BLAST方法與 RDP數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析，OTUs 的豐度初步表明樣品的物種豐度。獲得的數(shù)據(jù)提交GenBank，登錄號：DS(SRR11905350、SRR11905361、SRR11905362)， DC(SRR11905340、SRR11905341、SRR11905342), TB (SRR11905337、SRR11905338、SRR11905339), LC(SRR11905336、SRR11905359、SRR11905360)， LK(SRR11905356、SRR11905357、 SRR11905358)， ZQ(SRR11905353、SRR11905354、SRR11905355), DB(SRR11905349、SRR11905351、SRR11905352)， LQ(SRR11905346、SRR11905347、SRR11905348)， LX(SRR11905343、SRR11905344、SRR11905345)。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 采用QIIME計算的指數(shù)，利用軟件R進(jìn)行稀釋度曲線繪制；利用Mothur 軟件進(jìn)行單個樣品的α多樣性分析(Alpha Diversity)，

基于OTU的結(jié)果，對Shannon、Chao1、ACE指數(shù)進(jìn)行計算，用以進(jìn)行生物多樣性分析。用RDP classifier分析方法，基于Bergey′s taxonomy，采用Na?ve Bayesian assignment算法對每條序列在不同層級水平上計算其分配到此rank中的概率值。用Qiime 中的 BLAST方法與 Unite數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析，各組樣品在不同水平上的分類比較柱形圖、單個樣品的群落分布柱形圖使用R軟件獲得。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生羊肚菌根際土壤理化性質(zhì)及酶活性

由表2可知，ZQ、DB、LQ、LX采樣點羊肚菌根際土壤呈酸性，DS、DC、TB、LC、LK采樣點羊肚菌根際土壤呈堿性，pH范圍6.46～8.19。大量元素隨海拔升高有逐漸增加的趨勢，DB采樣點含量最高，DC采樣點含量最低，各采樣點微量元素變化各異。9個采樣點中，土壤多酚氧化酶(PPO)、過氧化物酶(POD)、脲酶(UE)、芳基硫酸酯酶(ASF)隨海拔升高而降低；而β-葡萄糖苷酶(β-GC)、脫氫酶(DHA)、堿性磷酸酶(AKP)隨著海拔升高而升高；β-葡萄糖苷酶的酶活性在DB采樣點顯著高于其他采樣點；谷氨酰胺酶(GLS)在各采樣點變化不大。

表2 野生羊肚菌采樣點根際土壤理化性質(zhì)及酶活性

續(xù)表2

2.2 野生羊肚菌根際土壤真菌群落豐度

9個羊肚菌根際土壤樣品，以大于97%相似性聚類得到21 846個真菌OTU，統(tǒng)計結(jié)果見表3。各樣品測序覆蓋度在98.92%以上，樣品稀釋曲線顯示，隨著測序樣品數(shù)目的增加，9個樣品的OTUs稀釋曲線趨于平緩，表明本實驗測序的數(shù)據(jù)量漸進(jìn)合理，能較全面地反映測序樣品的真菌群落組成，數(shù)據(jù)量的增多對于發(fā)現(xiàn)新的OTU數(shù)目的貢獻(xiàn)變小(圖1)。

圖1 野生羊肚菌根際土壤真菌OTU稀疏度曲線圖Fig.1 Curve of fungi OTU thinning in rhizosphere soil of wild morels

表3 野生羊肚菌根際土壤測序結(jié)果及Alpha多樣性分析

2.3 不同采樣點真菌多樣性及相關(guān)性分析

Shannon指數(shù)反應(yīng)群落的多樣性受樣品群落中物種豐富度和物種均勻度的影響，Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)反映樣品中群落的豐富度。9個采樣點羊肚菌根際土壤真菌Alpha分析結(jié)果見表3，Shannon指數(shù)分析結(jié)果為DB>LC>DS>TB>LX >ZQ>DC>LQ>LK； Chao1指數(shù)分析結(jié)果為LK>ZQ>LC>DB>TB>DS>LX>DC>LQ;ACE指數(shù)分析結(jié)果為ZQ>LC>DB>TB>DS>LX>LQ>DC>LK;DB、LC采樣點羊肚菌根際土壤真菌多樣性最高，Shannon指數(shù)分別為5.01和4.61； LK、ZQ 、LC采樣點根際土壤真菌豐富度最高。

在97%相似度下得到每個樣品的OTU個數(shù)，利用Python繪制韋恩圖，展示出多樣品間相同的和特有的OTU數(shù)以及重疊情況,如圖2所示，9個采樣點共有的OTU數(shù)32個，特有的OTU數(shù)較多。

2.4 野生羊肚菌根際土壤真菌群落組成分析

不同采樣點羊肚菌根際土壤在門水平的物種組成結(jié)果見圖3，9個采樣點中共檢測到18個門的真菌。采樣點DS、TB、LC、LK、ZQ、DB、LQ、LX優(yōu)勢菌門為子囊菌門，DC采樣點優(yōu)勢菌門為擔(dān)子菌門，其次是子囊菌門；除DC采樣點，其他采樣點子囊菌門的占比均在45%以上，LK、LQ子囊菌門的占比達(dá)到96%以上；未分類真菌在LK采樣點占比最低為0.38%，在LC采樣點占比最高為23.38%；在所有采樣點中擔(dān)子菌和子囊菌的占比最高的是LQ采樣點，為98.13%，最低的是ZQ采樣點，為60.94%。

圖2 不同采樣點真菌多樣性的相關(guān)性分析Fig.2 The similarity analysis of fungal diversity among samples

圖3 野生羊肚菌根際土壤真菌在門水平上的分類比較Fig.3 Taxonomic comparison of fungal in rhizosphere soil of wild morels at phylum level

不同采樣點羊肚菌根際土壤在綱水平的物種組成結(jié)果見圖4，9個采樣點中共檢測到55個綱的真菌。DS、DC、TB、LC采樣點共有的優(yōu)勢菌綱是座囊菌綱(Dothideomycetes)和糞殼菌綱(Sordariomycetes)；DC、ZQ、DB、LQ、LX采樣點的共有優(yōu)勢菌綱是傘菌綱(Agarico-mycetes)；LK、LQ采樣點共有的優(yōu)勢菌綱是占比很高的盤菌綱(Pezizomycetes)；DB、LQ、LX、LC采樣點共有的優(yōu)勢菌綱是錘舌菌綱(Leotiomycetes)；ZQ采樣點獨有的優(yōu)勢菌綱是散囊菌綱(Euroti-omycetes)。

圖4 野生羊肚菌根際土壤真菌在綱水平上的分類比較Fig.4 Taxonomic comparison of fungal in rhizosphere soil of wild morels at class level

不同采樣點羊肚菌根際土壤在科水平的物種組成結(jié)果見圖5，9個采樣點中共檢測到350個科的真菌。在科水平，不同采樣點的優(yōu)勢菌科差異較大，DS、TB、LC采樣點，存在共同的優(yōu)勢菌科亞隔孢殼科小雙腔菌科(Didymellaceae)；所有采樣點中，均存在一定量的unclassified，說明羊肚菌根際土壤存在一些未知的真菌；DS采樣點的優(yōu)勢菌科為小雙腔菌科(Didymellaceae)(23.03%)、暗殼腔菌科(Phaeosphaeriaceae)(10.63%)、unclassified_Fungi(9.75%)、unclassified(5.96%)；DC采樣點的優(yōu)勢菌科為未分類的木耳目(unclassified_Auriculariales)(40.54%)、unclassified (7.65%)、格孢腔菌科(Sporormiaceae)(7.26%)、綠核蟲草(Cordycipitaceae)(5.21%)；TB采樣點優(yōu)勢菌科為unclassified(11.96%)、小雙腔菌科(Didymellaceae)(10.15%)、球腔菌科(Mycosphaerellaceae)(9.49%)，枝孢霉科(Cladosporiaceae)(7.66%)；LC采樣點的優(yōu)勢菌科為 unclassified_Fungi(17.11%)、unclassified_Leotiomycetes(13.58%)、小雙腔菌科(Didymellaceae)(8.56%)、unclassified (7.27%)；LK采樣點的優(yōu)勢菌科為盤菌科(Pezizaceae) (94.58%)、unclassified_Rozellomycota(2.31%)；ZQ采樣點的優(yōu)勢菌科為曲霉科(Aspergillaceae)(19.18%)、unclassified(14.07%)、unclassified_GS11(13.13%)；蠟傘科(Hygrophoraceae)(12.36%)；DB采樣點的優(yōu)勢菌科為蠟殼耳科(Sebacinaceae)(16.36%)、unclassified(14.96%)、晶杯菌科(Hyaloscyphaceae)(8.34%)、unclassified_Fungi(7.10%)；LQ采樣點的優(yōu)勢菌科為羊肚菌科(Morchellaceae)(89.96%)、莢胞腔菌科(Sporormiaceae)(0.98%)；LX采樣點的優(yōu)勢菌科為柔膜菌科(Helotiaceae)(18.97%)、unclassified(7.86%)、unclassified_Ascomycota(7.81%)、unclassified_Leotiomycetes(6.82%)。

不同采樣點羊肚菌根際土壤在屬水平的物種組成結(jié)果見圖6，9個采樣點中共檢測到775個屬的真菌。DS采樣點Paraboeremia(15.56%)、unclassified_phaeosphaeriaceae未分類的暗殼腔菌科(10.45%)、unclassified_Fungi(9.75%)、Nothophoma(6.25%)；DC未分類的木耳屬類unclassified_Auriculariales(40.54%)、unclassified(7.65%)、光黑殼屬(Preussia)(7.08%)、白僵菌屬(Beauveria)(5.13%)；TB采樣點未分類的木耳屬類unclassified_Auriculariales(20.31%)、Paraboeremia(7.78%)、unclassified_Fungi(6.86%)、unclassified(6.81%)；LC采樣點未分類的真菌unclassified_Fungi(17.11%)、未分類的錘舌菌綱(unclassified_Leotiomycetes)(13.58%)、unclassified(6.27%)、被孢霉屬(Mortierella)(5.68%)；LK采樣點盤菌屬(Peziza)(94.58%)、未分類的羅茲菌門unclassified_Rozellomycota(2.31%)；ZQ采樣點青霉屬(Penicillium)(19.17%)、unclassified(14.07%)、unclassified_GS11(13.13%)、濕傘屬(Hygrocybe)(12.31%)；DB采樣點蠟殼菌屬(Sebacina)(16.35%)、unclassified(14.96%)、未分類的真菌門類unclassified_Fungi(7.10%)、Gyoerffyella(6.24%)；LQunclassified_Morchellaceae(89.34%)、LXunclassified_Helotiaceae(17.51%)、unclassified(7.86%)、unclassified_Ascomycota(7.81%)。

圖5 野生羊肚菌根際土壤真菌在科水平上的分類比較Fig.5 Taxonomic comparison of fungal in rhizosphere soil of wild morels at family level

圖6 野生羊肚菌根際土壤真菌在屬水平上的分類比較Fig.6 Taxonomic comparison of fungal in rhizosphere soil of wild morels at genus level

2.5 野生羊肚菌土壤真菌群落結(jié)構(gòu)與土壤環(huán)境因子相互關(guān)系

對9個采樣點野生羊肚菌根際土壤真菌群落進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見圖7。真菌群落受主坐標(biāo)成分PCA1與PCA2的影響分別達(dá)到67%和16%。DS、LC、DB、DC、LX、TB采樣點真菌群落在PCA2軸上，ZQ采樣點距離PCA2軸很近，表明這6個采樣點的真菌群落結(jié)構(gòu)相似，受主成分PCA2的影響；LQ 采樣點在PCA1軸上，距離PCA2軸較遠(yuǎn)，受主成分PCA1的影響較大；LK采樣點距離PCA2軸較遠(yuǎn)，受主成分PCA1的影響較大；LQ和LK兩個采樣點的真菌群落與其他6個采樣點的真菌群落差異較大，LQ和LK采樣點真菌群落的差異最大。

通過RDA分析，探明土壤環(huán)境因子與羊肚菌根際土壤真菌群落的相關(guān)關(guān)系，結(jié)果見圖8。第一、二排序軸累計解釋率分別為 55.2%和29.7%， 累計解釋率達(dá)到84.9%，說明第一、二排序軸能較好地反映真菌群落與土壤理化性質(zhì)、酶活性之間的相關(guān)關(guān)系。主要的真菌類群中，子囊菌門與速效鉀、谷氨酰胺酶、脲酶、硝態(tài)氮、堿性磷酸酶箭頭方向一致，說明子囊菌與速效鉀、谷氨酰胺酶、脲酶、硝態(tài)氮、堿性磷酸酶和脫氫酶正相關(guān)；Rozellomycota和Olpidiomycota與硒、鐵、有效磷、氨態(tài)氮、脫氫酶呈正相關(guān)，與鈣、多酚氧化酶、鎂、pH呈負(fù)相關(guān)；壺菌門、unclassified_Fungi、Mortierellomycota與脫氫酶、堿性磷酸酶、硝態(tài)氮呈負(fù)相關(guān)。子囊菌門在LK與LQ采樣點優(yōu)勢明顯；LC、DS采樣點相聚較近，真菌菌群結(jié)構(gòu)相近；DC、DB采樣點相距較近，真菌菌群結(jié)構(gòu)相近；ZQ采樣點的真菌群落組成與其它采樣點差異較大。

圖7 野生羊肚菌土壤真菌群結(jié)構(gòu)PCA分析Fig.7 PCA analysis of soil fungal community structure of wild morels

圖8 野生羊肚菌根際土壤門水平真菌群落與環(huán)境因子的相關(guān)性RDA分析Fig.8 RDA analysis of the correlation between the fungal community and environmental factors in the rhizosphere soil phylum of wild morels紅色箭頭代表土壤酶活和理化性質(zhì)在水平面上的相對位置，箭頭與排序軸的夾角不同，則其余弦值不同，即二者的相關(guān)性強(qiáng)度也不同。夾角越小，相關(guān)性越大；箭頭的長度越長，代表該環(huán)境因子發(fā)揮的作用越大；藍(lán)色箭頭代表門水平上的物種分布，箭頭越長代表物種在樣品中的影響越大；黑色圓點代表不同采樣點。各真菌編號代表： F1：子囊菌門；F2：擔(dān)子菌門；F3：unclassified；F4：unclassified_Fungi；F5：Rozellomycota；F6：Mortierellomycota；F7：Cercozoa；F8：Glomeromycota；F9：壺菌門；F10：Olpidiomycota；AN：氨態(tài)氮；AP：有效磷；QAP：速效鉀；N：硝態(tài)氮；SH：含水率；ST：土壤溫度；TC：全碳；OM：有機(jī)質(zhì)；PPO：多酚氧化酶；POD：過氧化物酶；UE：脲酶；ASF：芳基硫酸酯酶；β-GC：β-葡萄糖苷酶；DHA：脫氫酶；AKP：堿性磷酸酶；GLS：谷氨酰胺酶The red arrow represent the relative position of soil physical and chemical properties and enzyme activity on the horizontal plane, the angle between the arrow and the sort axis is different, the correlation strength is also different, the smaller the angle, the greater the correlation; The longer the length of the arrow, the greater the effect of the environmental factor; The blue arrow represents the species distribution at the class level, and the longer the arrow, the greater the impact of the species in the sample.F1:Ascomycota;F2:Basidiomycota;F3:unclassified;F4:unclassified_Fungi;F5:Rozellomycota;F6:Mortierellomycota;F7:Cercozoa;F8:Glomeromycota;F9:Chytridiomycota;F10:Olpidiomycota;AN:Ammonia nitrogen;AP:Available phosphorus;QAP:Rapidly available potassium;N:Nitrate;SH:Soil humidity;ST:Soil temperature;TC:Total carbon;OM:Organic material;PPO:Polyphenol oxidase;POD:Peroxidase;UE:Urease;ASF:Arylsulfatase;β-GC:β-glucosidase;DHA:Dehydrogenase;AKP:Alkaline phosphatase;GLS:glutaminase

3 討 論

土壤中微生物的種類、群落結(jié)構(gòu)對生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能具有重要的影響，土壤微生物與植物的互作已有很多的研究，而關(guān)于大型真菌與微生物互作的研究很少。本研究通過對甘肅不同地區(qū)羊肚菌根際真菌群落組成進(jìn)行系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)子囊菌門和擔(dān)子菌門在9個采樣地的真菌類群中均占優(yōu)勢地位，有研究顯示[22-23]子囊菌門是真菌豐度最高的真菌類群，在偏堿與偏酸性的土壤中均能大量生存，對土壤的適應(yīng)性較強(qiáng)，這與本研究的結(jié)果一致；在綱、科、屬水平土壤真菌群落組成差異明顯，這與閻威文等[24]的研究結(jié)果一致。閻威文等的研究顯示野生羊肚菌根際土壤真菌優(yōu)勢菌屬為被孢霉屬(Mortierella)，我們的研究結(jié)果中，只有在LC采樣點被孢霉屬是優(yōu)勢真菌群落之一。毋校輝[25]對四川8個地區(qū)羊肚菌種植根際土壤的高通量測序結(jié)果顯示有兩個采樣點的優(yōu)勢真菌類群為被孢霉屬，閻威文等[24]研究顯示栽培羊肚菌根際土壤真菌優(yōu)勢菌屬為紅菇屬(Russula)。由此可見，無論是野生羊肚菌還是栽培羊肚菌，其根際土壤真菌群落的差異均較大，另外，根際土壤的采集時間不同，真菌群落組成也有差異。

研究表明，土壤微生物多樣性以及群落組成結(jié)構(gòu)受土壤理化性質(zhì)的影響顯著[26]。本研究中，羊肚菌在偏酸與偏堿的環(huán)境均可生長，pH值隨海拔的增加而減小。RDA分析結(jié)果顯示，除pH值外，有效磷、Ca、Se含量與真菌群落相關(guān)性較大，其他土壤理化性質(zhì)對根際土壤真菌群落的影響很??；尤其是土壤中的大量元素與真菌群落相關(guān)性小，其原因有待進(jìn)一步分析。有研究表明土壤微生物群落的空間變異因土壤化學(xué)性質(zhì)的不同而異[27]，各地區(qū)土壤化學(xué)性質(zhì)存在差異，致使其土壤原始菌群不同，使各地羊肚菌生長受侵?jǐn)_程度不同，說明了羊肚菌栽培中土壤選擇的重要性。

土壤酶是生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)以及能量轉(zhuǎn)化過程中重要的參與者[28]，其主要來源為微生物。脫氫酶發(fā)揮的作用較大，脫氫酶能酶促脫氫反應(yīng)，起著氫的中間傳遞體的作用；多酚氧化酶與優(yōu)勢真菌群落結(jié)構(gòu)呈負(fù)相關(guān)，能將土壤中芳香族化合物氧化成醌，是表征對土壤中污染物凈化能力的指標(biāo)之一[29]；磷酸酶是表征土壤碳、氮、磷等元素循環(huán)的因素之一，堿性磷酸酶與優(yōu)勢真菌群落子囊菌有顯著的相關(guān)性，其他酶活性對真菌群落的影響不大。通過比較，認(rèn)為土壤酶活性對真菌群落的影響較理化性質(zhì)影響大。

羊肚菌人工種植的過程中，羊肚菌利用的碳源主要來源于外援營養(yǎng)袋，羊肚菌菌絲在地下如何代謝、與微生物的相互作用及如何積累營養(yǎng)物質(zhì)支持出菇還不清楚，進(jìn)一步開展野生羊肚菌菌絲生長期、原基形成期、子囊果成熟期土壤微生物組成與環(huán)境因子的相關(guān)性研究，能夠為人工種植羊肚菌提供理論參考。