辣椒素改善實(shí)驗(yàn)小鼠急性肺損傷氧化應(yīng)激的研究

李利玲 劉 歡 廖慧敏 胡金鑫 劉鳳曉 趙 棋 高 強(qiáng)

(1 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)沙，410208；2 中南大學(xué)，長(zhǎng)沙，410083)

內(nèi)毒素所致肺損傷發(fā)生比較迅速，挽救的時(shí)間窗口比較短暫，同時(shí)肺損傷也是內(nèi)毒素小鼠死亡的主要原因之一。各種因素導(dǎo)致的急性肺損傷(Acute Lung Injury，ALI)共同病理改變?yōu)閺V泛嚴(yán)重的肺泡損傷和間質(zhì)性肺水腫，肺泡腔內(nèi)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，灌洗液中的炎癥介質(zhì)明顯增多，肺泡上皮細(xì)胞凋亡或死亡[1-2]。內(nèi)皮細(xì)胞學(xué)說(shuō)則認(rèn)為內(nèi)皮或上皮細(xì)胞的凋亡，直接造成了肺泡上皮或內(nèi)皮屏障功能障礙，血管通透性增加，肺水腫加劇[3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用腹腔注射內(nèi)毒素方法制造白化的家鼠亞系(Bagg Albino，Laboratory-bred Strain of the House Mouse，BALB/c)小鼠ALI模型，用辣椒素干預(yù)后硫代巴比妥酸(Thiobarbituric Acid，TBA)化學(xué)比色法檢測(cè)小鼠丙二醛(Malondiachehyche，MDA)水平；一氧化氮還原酶法測(cè)定氮氧化物(Nitrogen Oxide,NOX)水平；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)檢測(cè)各組小鼠肺組織腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)水平，以及在光鏡下觀察各組小鼠肺組織病理學(xué)改變，以期為辣椒素干預(yù)內(nèi)毒素所致ALI小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)改善提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 120只無(wú)特定病原體(Specefic Pathogen Free，SPF)級(jí)BALB/c小鼠，4～6周齡，雄性，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自武漢蜂鳴生物科技有限公司，動(dòng)物購(gòu)買(mǎi)許可證號(hào)SCXK(湘)2018-0003，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(湘)2018-0004。倫理審批號(hào)：HN.No20180930b1000120，于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)動(dòng)物房中飼養(yǎng)，給食顆粒飼料，自由飲水，動(dòng)物房溫度(25±1)℃，相對(duì)濕度40%～70%，自然晝夜光照。

1.1.2 藥物 辣椒素(上海源葉生物科技有限公司，貨號(hào)：B2069)和脂多糖(福州奧研實(shí)驗(yàn)器材有限責(zé)任公司，貨號(hào)：HX100003929)。

1.1.2 試劑與儀器 一氧化氮(Nitric Oxide，NO)測(cè)定試劑盒(硝酸還原酶法，南京建成生物工程研究所，貨號(hào)A012)和MDA測(cè)定試劑盒(TBA法，南京建成生物工程研究所，貨號(hào):YBA003-1)，TNF-α ELISA試劑盒(欣博盛生物科技有限公司，貨號(hào):EMC102a)、IL-1β ELISA試劑盒(欣博盛生物科技有限公司，貨號(hào):EMC001b)，4%多聚甲醛組織固定液(長(zhǎng)沙國(guó)昌生物技術(shù)有限公司，貨號(hào):AR1069)。倒置顯微鏡(OLYMPUS公司，日本，型號(hào):CX23)，全自動(dòng)石蠟切片機(jī)(SLEE公司，德國(guó)，CUT6062型號(hào))等，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Thermo公司，美國(guó)，型號(hào):Multiskan Sky)，攤片機(jī)(SKU公司，美國(guó)，型號(hào):KD-PⅢ)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(崢嶸儀器公司，型號(hào):DHP260)等。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將小鼠120只采用隨機(jī)數(shù)字法分為4組：正常對(duì)照組，辣椒素對(duì)照組，內(nèi)毒素急性肺損傷組，辣椒素+內(nèi)毒素干預(yù)組，每組30只。

1.2.2 給藥方法 正常對(duì)照組：小鼠腹腔注射生理鹽水，分別于干預(yù)后22 h、4 h、6 h時(shí)麻醉處死；辣椒素對(duì)照組：先給小鼠皮下注射辣椒素1.0 mg/kg，30 min后腹腔注射生理鹽水，分別于干預(yù)后2 h、4 h、6 h時(shí)麻醉處死；急性肺損傷組：給小鼠腹腔注射內(nèi)毒素10.0 mg/kg，構(gòu)建ALI模型，分別于干預(yù)后2 h、4 h、6 h分批麻醉處死；辣椒素干預(yù)組：先小鼠皮下注射辣椒素1.0 mg/kg，30 min后腹腔注射內(nèi)毒素10.0 mg/kg，分別于干預(yù)后2 h、4 h、6 h分批麻醉處死。以上各組處死后取肺組織，固定于4%多聚甲醛中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 比色法檢測(cè)MDA含量 按照實(shí)驗(yàn)分組，取10%肺組織勻漿，用二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid，BCA)法測(cè)定其蛋白含量，采用比色法，檢測(cè)肺組織MDA水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。機(jī)體產(chǎn)生的氧自由基能通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化物的分解產(chǎn)物MDA引起細(xì)胞損傷。因而測(cè)試MDA的量常?？砷g接地反映出細(xì)胞損傷的程度。過(guò)氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中的MDA可與TBA縮合，形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰。實(shí)驗(yàn)取樣品100 μL，按比例加入試劑一、試劑二、試劑三，旋渦混勻器混勻，95 ℃水浴40 min，3 500～4 000 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min，取上清100 μL，532 nm處，測(cè)各管光密度(Optical Density，OD)值。見(jiàn)表1。

1.2.3.2 NO還原酶法檢測(cè)NOX水平 按照實(shí)驗(yàn)分組，摘眼球取血，離心取血清，用NO還原酶法測(cè)定NOX水平，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。取血清原液100 μL，按步驟加入樣本一100 μL，樣本二200 μL，混合試劑，37 ℃水浴60 min，再加入R3、R4，抽提室溫靜置40 min，3 500～4 000 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min，取上清160 μL，加入顯色劑，靜置10 min，550 nm測(cè)各管OD值。見(jiàn)表2。

1.2.3.3 ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-1β水平 按照實(shí)驗(yàn)分組，取10%肺組織勻漿，用BCA法測(cè)定其蛋白含量，采用QuantiCyto? ELISA試劑盒雙抗夾心法檢測(cè)肺組織TNF-α和IL-1β水平，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作?？剐∈骉NF-α和IL-1β單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)本中的TNF-α和IL-1β與單抗結(jié)合，洗滌，加入生物素化的抗小鼠TNF-α和IL-1β抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的親和素，洗滌，加入顯色底物，洗滌，加終止液，若陽(yáng)性則顯黃色，陰性無(wú)色，在450 nm處測(cè)OD(光密度)值。見(jiàn)表3～4。

1.2.4 病理學(xué)觀察 按照實(shí)驗(yàn)分組，將肺組織于4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，進(jìn)行切片和HE染色，在放大400倍光鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。

2 結(jié)果

2.1 辣椒素干預(yù)前后小鼠肺組織MDA、NOX、TNF-α、IL-1β比較 與正常對(duì)照組比較，內(nèi)毒素組小鼠肺組織MDA水平明顯升高(P<0.05)，辣椒素對(duì)照組則變化不明顯(P>0.05)，與內(nèi)毒素組比較，辣椒素+內(nèi)毒素干預(yù)組小鼠肺組織MDA水平在2 h、4 h、6 h明顯降低(P<0.05)。與正常對(duì)照組比較，內(nèi)毒素組小鼠肺組織NOX水平明顯升高(P<0.05)，辣椒素對(duì)照組則無(wú)明顯變化(P>0.05)，與內(nèi)毒素組比較，辣椒素+內(nèi)毒素干預(yù)組肺組織NOX水平在4 h、6 h明顯降低(P<0.05)。與正常對(duì)照組比較，內(nèi)毒素組小鼠肺組織TNF-α、IL-1β水平明顯升高(P<0.05)，辣椒素對(duì)照組則變化不明顯(P>0.05)，與內(nèi)毒素組比較，辣椒素+內(nèi)毒素干預(yù)組小鼠肺組織在4 h、6 h TNF-α、IL-1β水平明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠肺組織MDA、NOX、TNF-α、IL-1β水平變化及辣椒素干預(yù)結(jié)果

2.2 各組小鼠肺組織病理學(xué)改變 光鏡下，正常對(duì)照組、辣椒素組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔內(nèi)無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)出血或有少量出血，肺間質(zhì)無(wú)明顯滲出；急性肺損傷組2 h損傷不明顯，但4 h、6 h可見(jiàn)肺泡腔大小不等，部分肺泡壁斷裂呈氣腫狀，部分增寬，肺泡毛細(xì)血管擴(kuò)張，部分肺泡內(nèi)可見(jiàn)出血，肺間質(zhì)水腫，可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；與急性肺損傷組比較，辣椒素干預(yù)組肺泡壁增厚、毛細(xì)血管擴(kuò)張、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及肺間質(zhì)水腫程度均明顯減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 不同組別不同處理時(shí)間小鼠肺組織病理學(xué)變化(HE染色，×400)

3 討論

ALI是呼吸系統(tǒng)疾病中最常見(jiàn)的導(dǎo)致死亡的原因之一，同時(shí)ALI也是肺炎和急性呼吸窘迫綜合征(Acute Respiratory Distress Syndrome，ARDS)等其他疾病發(fā)展的重要風(fēng)險(xiǎn)因素[4-5]。由于其病情發(fā)展迅速同時(shí)病死率較高，其發(fā)病機(jī)制仍處于探討之中，同時(shí)缺乏明確的治療手段，因此目前在呼吸疾病中越來(lái)越受到重視。

此前已有研究表明氧自由基損傷是ALI的一個(gè)重要因素，其細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化的降解產(chǎn)物主要就是MDA，其大小可以間接反映細(xì)胞氧化損傷的程度[6]。降低ALI細(xì)胞和大鼠模型中MDA和NO的水平，抑制SOD活性，可明顯減輕內(nèi)毒素所致的肺組織病理改變[7]，本研究中小劑量辣椒素作用于ALI模型小鼠后可降低血清MDA水平，可以在一定程度上減輕ALI造成的氧化應(yīng)激損傷。

Wu等[8]研究發(fā)現(xiàn)辣椒素對(duì)小鼠體內(nèi)的2種NO合酶均有促進(jìn)作用。而Demirbilek等[9]采用不同劑量辣椒素干預(yù)膿毒癥大鼠，發(fā)現(xiàn)小劑量辣椒素可以抑制大鼠血清NOX水平，但具體機(jī)制不明。唐婧等[10-11]研究不同處理因素對(duì)脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞后相關(guān)炎癥介質(zhì)表達(dá)的影響，明確辣椒素的抗炎效應(yīng)表明辣椒素具有抗炎的作用，并發(fā)現(xiàn)瞬時(shí)受體辣椒素電位1(Transient Receptor Potential Vanilloid 1，TRPV1)是辣椒素在治療ALI/急性呼吸窘迫綜合征作用中的新靶點(diǎn)。南超等[12]初步研究過(guò)辣椒素對(duì)小鼠ALI氧化應(yīng)激的影響，測(cè)定了辣椒素作用下肺組織SOD、MDA以及血紅素氧合酶等的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)辣椒素有改善小鼠ALI氧化應(yīng)激的作用，但沒(méi)有進(jìn)一步測(cè)定NOX、TNF-α、IL-1β等與氧化應(yīng)激相關(guān)關(guān)鍵因子的表達(dá)變化，因此本研究的完成對(duì)于進(jìn)一步探索辣椒素改善小鼠ALI氧化應(yīng)激的作用就顯得特別有意義。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)NOX水平變化趨勢(shì)為急性肺損傷組>辣椒素加急性肺損傷組>辣椒素組>正常對(duì)照組。血漿NOX水平的升高可能與多器官衰竭的發(fā)生有關(guān)，小劑量的辣椒素降低了ALI小鼠血漿中的NOX水平，其可能的機(jī)制是小劑量的辣椒素干預(yù)可能使小鼠產(chǎn)生較小數(shù)量的細(xì)胞因子，例如TNF-α、IL-1β等，從而減少NOX產(chǎn)生。

目前的主流觀點(diǎn)認(rèn)為，內(nèi)毒素注射入人體后會(huì)導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome，SIRS)，刺激機(jī)體釋放炎癥介質(zhì)，從而引發(fā)瀑布樣級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使肺泡上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，間隙增大，大分子物質(zhì)透過(guò)血管進(jìn)入肺間質(zhì)及肺泡內(nèi)，從而引起肺部一系列的病理生理改變[13-14]。內(nèi)毒素引起ALI動(dòng)物肺泡腔和間質(zhì)中性粒細(xì)胞募集、肺泡壁變薄和蛋白水腫液聚集在肺泡腔[15-16]；上皮細(xì)胞在動(dòng)物注入內(nèi)毒素后迅速凋亡并先于其他組織損傷發(fā)生[17]。

在實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)腹腔注射辣椒素觀察其對(duì)內(nèi)毒素所致ALI小鼠的改善作用，結(jié)果顯示，辣椒素能夠降低實(shí)驗(yàn)小鼠中血清的炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β的水平，同時(shí)提高抗炎癥介質(zhì)水平，說(shuō)明了辣椒素可以調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)及抗炎癥介質(zhì)的平衡，從而減輕炎癥反應(yīng)，發(fā)揮對(duì)肺組織的保護(hù)作用。

本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，辣椒素能調(diào)控炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β等的釋放，減輕內(nèi)毒素所致肺損傷的炎癥程度，降低ALI小鼠肺組織MDA和NOX水平，從而阻斷肺損傷繼續(xù)進(jìn)展為ALI/ARDS，因而小劑量辣椒素對(duì)ALI有一定的保護(hù)作用。目前已有研究人員從磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-Kinase，PI3K)、蛋白激酶B(Protein Kinase B，PKB)以及核因子κB等信號(hào)通路對(duì)黃酮類(lèi)等對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠ALI的保護(hù)作用機(jī)制進(jìn)行了研究[18-20]。下一步我們擬繼續(xù)對(duì)辣椒素改善實(shí)驗(yàn)小鼠ALI氧化應(yīng)激的機(jī)制進(jìn)一步研究。