張夢露，陳婉淑，韓 冰

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院血液內(nèi)科，北京100730

獲得性再生障礙性貧血(aplastic anemia，AA)大多數(shù)為自身免疫性T淋巴細胞攻擊造血干細胞及祖細胞(hematopoietic stem/progenitor cell，HSPC)所致。人們很早就發(fā)現(xiàn)，AA患者可出現(xiàn)克隆造血(clonal hematopoiesis，CH)，其中，可導致糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphatidylinositol，GPI)錨定蛋白缺失的PIGA基因突變十分常見，此突變可以維持AA的造血，這可能與免疫攻擊下的生存選擇有關(guān)[1-2]。此外，AA的發(fā)生與特定的組織相容性抗原有關(guān)。10%～17%的AA患者出現(xiàn)6號染色體上包含人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)等位基因的區(qū)域缺失，這些發(fā)生6號染色體短臂雜合性丟失(6pLOH)或體細胞突變(somatic mutation，SM)的細胞通過克隆性擴張維持造血[3-6]。然而，一些常見于其他髓系腫瘤的SM也可見于AA，在長時間骨髓衰竭(bone marrow failure，BMF)背景下，部分突變基因可以獲得選擇優(yōu)勢，甚至與AA患者不良的預后有關(guān)[1-2]。

獲得性AA與骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome，MDS)都是造血干細胞(HSC)異常的克隆性疾病，也都是骨髓衰竭綜合征(bone marrow failure syndrome，BMFS)之一。兩者都可表現(xiàn)為血細胞減少，造血功能衰竭，然而在臨床表現(xiàn)上兩者又有較大差別。部分AA患者在病程中轉(zhuǎn)變?yōu)镸DS；而部分MDS患者還會向急性髓細胞性白血病(acute myelogenous leukemia，AML)轉(zhuǎn)化。但在一些不典型病例中，獲得性AA與MDS難以區(qū)分[1]。近年來，由于分子檢測技術(shù)的進步，人們對這些疾病的分子發(fā)病機制逐漸有了一定的了解。從分子角度進行分析，有助于找到疾病轉(zhuǎn)化的內(nèi)在聯(lián)系，鑒別這兩種疾病，從而更精確地判斷預后。

本文將綜述近年來關(guān)于獲得性AA體細胞性改變(SM與細胞遺傳學改變)的文獻，闡述這些改變的意義，并分析其與MDS的分子聯(lián)系，以說明體細胞性改變在疾病轉(zhuǎn)化中的可能作用。

AA的體細胞突變

70～79歲的正常人群中，約有10%檢測到SM，并隨年齡增長進一步增加。這種與年齡相關(guān)的克隆造血(CH)稱為不明潛能的克隆造血(clonal hematopoiesis of indeterminate potential，CHIP)[7]。雖然AA中SM頻率可以隨年齡增加，但在兒童期發(fā)病的AA患者中，大于60%的患者都存在SM。因此，AA患者的SM并不總與年齡相關(guān)[3，8]。一些突變是一過性的，可能與疾病狀態(tài)相關(guān)；但另一些突變卻有致病性，并對疾病結(jié)局有預測作用。AA中也有一些CHIP相關(guān)SM，如DNMT3A和TET2突變[2]。然而，AA中出現(xiàn)這些SM時結(jié)局卻與CHIP大相徑庭。一方面可能與診斷時克隆大小的差異有關(guān)；另一方面，也可能與BMF背景下克隆的選擇性擴張相關(guān)[9]。

全外顯子組測序(whole exome sequencing，WES)研究表明，AA的平均等位基因變異分數(shù)(variable allele frequency，VAF)約為10%，遠低于MDS(約30%)[2]。與WES相比，靶向二代測序(next generation sequencing，NGS)對較低VAF的SM檢出率更高。眾多NGS研究顯示，AA中SM頻率為5.3%～73%[2-3，8，10-12]。而在各類MDS患者中，細胞信號通路(RNA剪接、DNA轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導和表觀遺傳學調(diào)控等)中基因的SM頻率高達78%～89%(平均每個患者存在3個SM)[13]。

AA中最常見的5個突變基因為PIGA、BCOR、BCORL1、DNMT3A和ASXL1。PIGA和BCOR/BCORL1突變者對免疫抑制劑治療(immunsuppressive theray，IST)反應更好，總生存期(overall survival，OS)及無進展生存期(progression free survival，PFS)更長；而DNMT3A和ASXL1突變在AA和MDS/AML中都較常見，當其在AA中出現(xiàn)時，可能與克隆演變和預后不良相關(guān)。與MDS相比，AA中PIGA、BCOR和BCORL1突變頻率更高，TET2、剪接因子基因、JAK2、RUNX1和TP53突變頻率更低[2]。

理解基因的功能一定程度上有助于了解疾病轉(zhuǎn)化的機制。例如，PIGA突變導致HLA等位基因功能缺失，使得突變細胞能夠逃避免疫攻擊[1]；而DNMT3A突變時，細胞由于失去分化能力而在骨髓中積累[14]；ASXL1突變通過改變組蛋白修飾，在白血病發(fā)病中起到關(guān)鍵作用，并增加了MDS轉(zhuǎn)化的易感性[15]。

AA中最常見的體細胞性改變與其免疫發(fā)病機制有關(guān)

AA中最常見的2種體細胞性改變是PIGA突變[產(chǎn)生陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)克隆]和HLA等位基因的缺失，它們的出現(xiàn)提示患者的BMF可能由免疫介導，且對IST反應較好。雖然PNH克隆擴張的具體機制仍不清楚，PIGA突變的PNH克隆可以逃避T細胞介導的自身免疫攻擊，而一定程度上挽救其BMF[1]。HLA Ⅰ類等位基因的選擇性丟失有兩種發(fā)生機制[3-5，8，16]。一種是6p染色體臂主要組織相容復合物(major histocompatibility complex，MHC)區(qū)域的有絲分裂重組，以消滅HSC上攜帶致病性HLA等位基因的單倍體型。這是一種拷貝數(shù)不變的雜合性丟失(CN-LOH)，在約11%的AA患者中發(fā)生[2，4-5]。另一種機制是HLAⅠ類等位基因的功能喪失型突變。通過聯(lián)合靶向NGS和單核苷酸多態(tài)性陣列(SNP-A)可以檢測到17%的AA患者存在上述兩種機制造成的HLA丟失[3]。這些HLA等位基因的丟失不是隨機的，通常發(fā)生于小部分導致AA易感的等位基因[3-5，16]。缺失HLAⅠ類等位基因的克隆可以擴張，通過逃避自身反應性CD8+T細胞的識別，為HSPC帶來生長優(yōu)勢[3，6，16]。PIGA和HLA等位基因的缺失是免疫介導的BMF的疾病特征，它們在MDS患者中相對少見，且與AA免疫發(fā)病機制相關(guān)[1]。

Babushok等[3]的研究顯示，攜帶HLAⅠ類風險等位基因的患者發(fā)生MDS相關(guān)CH的風險更高，從而提示了HLAⅠ類介導的自身免疫在AA中的作用。尤其在成年人中，相較于未攜帶者，攜帶HLAⅠ類風險等位基因的AA患者MDS相關(guān)驅(qū)動突變和染色體重排更多[3]?？梢酝茰y，類似于已知的AA發(fā)病率的種族差異，未來可能發(fā)現(xiàn)人群中與遺傳有關(guān)的免疫變異造成的AA長期結(jié)局的差異。

含有8三體的HSC表達高水平WT-1(Wilm tumor gene 1)抗原，誘導CD8+T細胞對WT-1多肽產(chǎn)生應答，通過旁觀者效應抑制非8三體的HSC[17]。同樣，del(13q)克隆在IST后擴增，雖然這一免疫逃逸過程還有待進一步研究[18]，但8三體和del(13q)都與較高的IST反應率及更好的PFS和OS相關(guān)。最近有研究表明，IST前MDS患者8三體的克隆負荷大于AA患者，AA患者的8三體克隆動態(tài)演變方式較為多樣，且在IST后8三體克隆未發(fā)生明顯擴增。另外，8三體克隆的增減對AA及MDS患者IST療效無明顯影響[19]。

除HSC外，增殖過程中細胞毒性T細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)也可能在調(diào)控生存和免疫的基因中積累SM[20]。STAT3基因在40%的大顆粒性T淋巴細胞(T-LGL)白血病患者中發(fā)生突變，并有助于在不明原因的血細胞減少患者中診斷該病[21]。STAT3突變也可能存在于小部分AA患者中，且預示著對IST的反應較好[22]。

AA與增殖相關(guān)的SM及其結(jié)局

全基因組分析發(fā)現(xiàn)71%～85%的AA患者造血細胞中存在CH[2-3，8]，這一發(fā)現(xiàn)揭示了AA與CH的緊密聯(lián)系。約1/3檢測到SM的AA患者有多個獨立的突變，有時這些突變甚至發(fā)生在同一基因[2，9]。與健康對照相比，AA患者在JAK-STAT信號通路(SOCS7，STAT3，PTPN2)，MAPK信號通路(KRAS，PTPN5，TP53)，以及其他關(guān)鍵的癌癥存活途徑中發(fā)生的SM更多。這些SM可產(chǎn)生增殖優(yōu)勢，對交叉反應的HSC觸發(fā)免疫抗腫瘤監(jiān)測，促進免疫逃逸，或引發(fā)二次突變打擊，因此與疾病發(fā)病機制密切相關(guān)[8]。

SM的發(fā)生和疾病持續(xù)時間關(guān)系密切。對AA患者晚期并發(fā)癥的前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，AA患者MDS/AML轉(zhuǎn)化率隨疾病持續(xù)時間增加而升高。IST后5～6年MDS/AML的轉(zhuǎn)化率為2%～4%，隨訪10年后上升至15%～26%[23]。雖然AA進展為繼發(fā)性MDS(sMDS)是AA的晚期并發(fā)癥，但IST 6個月后通常就會發(fā)生SM。即使VAF很低，許多患者在診斷時的骨髓標本中已能發(fā)現(xiàn)SM[2]，在診斷時就檢測到SM的患者疾病進展所需的時間更短[10]。隨訪7～8年后，40%有預后不良SM的患者進展為sMDS，比無此類突變患者的MDS轉(zhuǎn)化率(15%～25%)高，更高于PIGA、BCOR、BCORL1突變的患者(<5%)[2，12]。

此外，SM的發(fā)生還與AA患者的端粒長度縮短有關(guān)，這種端?？s短可能是造血應激造成的，而非引起先天性BMF的如TERT和TERC等端粒維持基因突變造成的[10]。多個研究評估了AA患者克隆演變中的端粒磨損。所有患者中白細胞端粒長度處于最低25%部分的初治患者的疾病更嚴重，細胞遺傳學演變更頻繁，生存更差[10，24-25]。治療初期AA患者的白細胞端?？傞L度反映了淋巴細胞的端粒長度，而淋巴細胞端粒較短與T淋巴細胞激活和進入S期相關(guān)[26]。另外，淋巴細胞端粒長度較短還是AA對IST反應不佳的預測因子，并且與復發(fā)有關(guān)[27]。具有7單體或SM的患者端粒長度更短，在細胞遺傳學改變發(fā)生前端粒磨損率更高。此外，一旦端粒達到一個臨界長度，端粒磨損本身也可能導致染色體不穩(wěn)定[10，24，26]。

JAK2/JAK3、RUNX1、TP53、SMD1和TET2等不太常見的突變也可能出現(xiàn)。通過NGS和基于SNP-A的核型分析，在<3%的AA患者中還發(fā)現(xiàn)了SRSF2、U2AF1、ERBB2、MPL等罕見突變[2]。與細胞遺傳學異常一樣，AA患者的結(jié)局可能受到特定SM的影響。DNMT3A、ASXL1、JAK2/JAK3及RUNX1突變的患者IST反應和OS較差。DNMT3A或ASXL1突變的AA患者中約40%可能進展為MDS，這遠高于在無此突變的AA患者中觀察到的MDS發(fā)病率(約10%)[2，9]。

亞克隆的結(jié)局并不完全相同，有的克隆大小變化不大；有的(如ASXL1或DNMT3A突變的克隆)會在病程中顯著擴張，甚至可以作為MDS/AML進展前的預測指標。典型的如ASXL1，DNMT3A，RUNX1和U2AF1突變的克隆在克隆演變的患者中就趨于增大[2，28]。

需要注意的是，由于AA患者的HSC減少，CH在部分AA中僅反映了受外部壓力損害減少的干細胞池中的寡克隆造血，有些會在造血恢復后消失，因此必須與本質(zhì)上有缺陷的惡性/前惡性克隆(如MDS/AML)的真正克隆/亞克隆擴張相區(qū)分。盡管某些SM高度可疑，但由于對克隆選擇對理解尚不明確，且對這些SM的預測也并不一致，因此大多數(shù)專家不建議將克隆疾病的存在或克隆的大小作為治療決策的決定因素[29]。

AA向MDS轉(zhuǎn)化時的SM和細胞遺傳學改變

與sMDS/AML轉(zhuǎn)化相關(guān)的危險因素包括疾病持續(xù)時間較長，AA發(fā)病時年齡較大，端粒磨損增加，存在不良預后SM和細胞遺傳學改變，以及發(fā)生多個SM(尤其是發(fā)生在病程早期和VAF較高的SM)[30]。

AA和MDS突變譜的比較提示，盡管大多數(shù)AA中發(fā)現(xiàn)的SM不會引發(fā)MDS，但特定基因中的SM可能與sMDS的發(fā)生有關(guān)[31]。早期檢測出有害克隆有助于更好地識別高危克隆演變患者，并盡快采用干細胞移植。需要注意的是，AA中的SM通常具有較低的VAF值，但VAF與疾病結(jié)局的相關(guān)性并不絕對，即增大的有害克隆不一定預示著MDS/AML的進展；在骨髓恢復過程中，突變的克隆可能只是短暫出現(xiàn)，然后被再擴張的正常HSC池稀釋[2，29]。這些證據(jù)表明，CH高度動態(tài)可變，且不一定對疾病結(jié)局具有最終決定作用。

診斷AA時的年齡是MDS相關(guān)突變CH的最強預測因子之一。相較于成年人(<80%)，MDS和血液惡性腫瘤相關(guān)的驅(qū)動突變率在兒科AA患者中(≤60%)略低[2-3，8]。在一項AA克隆造血的研究中，82名20歲以下的AA患者中，有22%發(fā)現(xiàn)了MDS相關(guān)突變，這明顯低于357名成年AA患者使用同樣的高靈敏度NGS分析時顯示的39%[32-33]。類似的結(jié)果也出現(xiàn)在較小的北美隊列中，該研究采用WES分析，顯示在兒童時期發(fā)病的AA中MDS相關(guān)SMs的比率明顯較低。與成年發(fā)病的AA不同，兒童患者的CH主要由HLA缺失、PIGA突變以及兒童特有突變組成[3]。MDS相關(guān)改變隨年齡的增加與HSPC突變的隨機積累相一致，MDS相關(guān)驅(qū)動突變的克隆擴張也與年齡有關(guān)[7]

AA中最常見的體細胞性改變(PIGA和HLA等位基因的體細胞缺失)以及BCOR/BCORL1突變，與sMDS無顯著聯(lián)系。這些改變在較為穩(wěn)定對中小型克隆中出現(xiàn)(如BCOR，BCORL1突變)，或者與一些獨立克隆的擴張有關(guān)(如PIGA，HLA等位基因的體細胞缺失)[2-3，6，16]。

與AA患者總體相比，其中進展為MDS的患者，在其處于AA時期時MDS相關(guān)SMs發(fā)生率更高(44%～65%比20%～25%)[10，12，31]。一些研究組在AA患者中發(fā)現(xiàn)了MDS相關(guān)的高風險SM，特別是高VAF值的ASXL1、RUNX1和剪接因子基因突變[2，10，12，31]，而常見的與衰老相關(guān)的SM(如TET2突變)卻并未顯著影響MDS進展的風險[12，31]。另一項研究顯示，攜帶RUNX1和剪接因子基因等突變的AA患者惡性轉(zhuǎn)化率增加[2，10，12，31]。與健康人不同的是，AA中ASXL1突變明顯提示不良預后[2，10，12，31]，而在健康人群中卻沒有這樣的提示作用[32]。

此外，細胞遺傳學異常也有重要的提示作用。Negoro等[31]的研究中，約1/3 的AA患者沒有MDS相關(guān)SM，但仍進展為sMDS，這些患者絕大部分都有7號染色體全部或部分缺失。有文獻顯示，診斷時存在7號染色體異常和復雜細胞遺傳學改變者克隆演變率更高[34]。AA后sMDS的細胞遺傳學異常中，最典型的變化是7單體/del(7q)[35]，能在20%～60%進展為MDS的AA患者中檢測到。原發(fā)性MDS中的7單體通常與TP53突變和復雜核型有關(guān)；而AA后sMDS中7單體則表現(xiàn)為孤立或結(jié)合了SM(最常見的是RUNX1和ASXL1突變)的細胞遺傳異常[2，10，12，31]。

AA的SM和細胞遺傳學異常在預測IST的療效和患者長期生存方面具有重要意義。盡管目前的檢測手段可以發(fā)現(xiàn)與疾病潛在進展有關(guān)的SM，但由于其隨著病程的動態(tài)變化及意義未確定性等因素，在疾病進展中的意義仍難以完全預測。但密切連續(xù)監(jiān)測SM，并結(jié)合臨床來評估預后仍可能指導治療[35]。未來可開發(fā)包括SM、細胞遺傳異常、端粒磨損和外周血計數(shù)等預后特征的信息風險評分系統(tǒng)[36]，可能會對更好地識別高危克隆演變患者有所幫助，從而及早地進行異基因干細胞移植。