基于分子對接分析復方一枝黃花噴霧劑抗HIV-1蛋白酶和組織蛋白酶 L的研究

朱海燕 莊田畋 楊 欣 危 英* 李 星 陳 梅 夏 文 周 英

1.貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550025；2.貴州百靈制藥股份有限責任公司，貴陽 安順 550001

復方一枝黃花噴霧劑由一枝黃花、貫眾、山銀花、連翹、荊芥、艾納香、薄荷制成的噴霧劑[1]。由貴州百靈企業(yè)集團制藥股份有限公司生產，主要功效為清熱解毒，宣散風熱，清利咽喉。用于上呼吸道感染，急、慢性咽炎，口舌生瘡，牙齦腫痛，口臭[2]。已有文獻[3-5]報道一枝黃花、山銀花、貫眾、連翹等中藥具有抗病毒的作用。但是復方一枝黃花噴霧劑對HIV-1蛋白酶和Cathepsin L蛋白酶活性的影響尚未研究。目前，在藥物研發(fā)的過程中，很多中藥及復方的活性化合物的篩選依靠分子對接完成，優(yōu)化的小分子與蛋白通過計算機模擬打分，快速有效地發(fā)現(xiàn)小分子活性成分[6]。分子對接技術已經應用到很多領域，得到的結果較為理想[7]。因此本研究采用藥物分子設計模擬 SYBYL 2.1.1 軟件的Surflex-Dock和模塊完成復方一枝黃花噴霧劑藥效物質與HIV-1蛋白酶和Cathepsin L蛋白酶的分子對接分析，為發(fā)現(xiàn)及開發(fā)抗病毒藥物提供理論依據。

1 數(shù)據庫及軟件

中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據庫和分析平臺TCMSP(http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/.tcmspsearch)；SwissADME(http://www.swissadme.ch/)；蛋白質晶體結構數(shù)據庫RCSB (http://www. rcsb. org/pdb )；SYBYL 2.1.1(Tripos)處理器為Inter(R) Core(TM) i5-7500 CPU@3.4GHz，64位操作系統(tǒng)，軟件已授權。

2 實驗方法

2.1 復方一枝黃花噴霧劑活性成分篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據庫和分析平臺(TCMSP)相關指標[8]：口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)、分子量(Molecular Weight ,MW)、類藥性(Drug Likeness,DL)篩選丹參化學成分，OB通過OBioavail模型對進行預測，DL通過Tanimoto 系數(shù)通過藥物之間的Tanimoto進行計算。一般認為OB大的化學成分具有好的口服生物利用度，DL≥0.18 的分子具有較好的類藥性?；谥兴幭到y(tǒng)TCMSP在Herb name中進行查找復方一枝黃花噴霧劑的化學成分。相關參數(shù)設置為：OB≥40%，DL≥0.18，MW≤500，保存為mol2 格式。

2.2 復方一枝黃花噴霧劑小分子能量優(yōu)化 復方一枝黃花噴霧劑基于Tripos力場對小分子配體進行結構優(yōu)化，獲得合理構象。點擊File > Import File，F(xiàn)iles of type選molecule，在Directory選擇小分子所在的文件位置，然后在Selection 列表中點擊需導入的分子；設置Force Field為Tripos，Charges為Gasteiger-Huckel電荷；設置最大重復次數(shù)(Max. Iterations)為10000；設置Gradient為0.005；設置Color Option為Force。

2.3 分子對接 采用藥物分子設計模擬 SYBYL 2.1.1 軟件的Surflex-Dock模塊完成分子對接研究。從蛋白質晶體結構數(shù)據庫RCSB (http://www.rcsb.org/pdb ) 獲取HIV-1蛋白酶(PDB ID:1QBS)和Cathepsin L蛋白酶(PDB ID:3OF9)。建立存放需要對接的蛋白和小分子的文件夾，Surflex-dock使用原型分子(即protomol)來表示蛋白結合口袋，本研究基于原配體小分子確定活性口袋。對接模式選擇標準對接。對接完成后，一個分子會產生很多種構象。軟件默認是按Total_Score打分值進行排序[9]。

2.4 化合物與靶標蛋白相互作用分析 Ligplot作為經典的配體與蛋白二維相互作用作圖軟件，應用較廣泛，氫鍵和疏水作用基于HBPLUS程序計算，以2D的形式展示結構，方便觀察。本研究基于Ligplot1.4.5版本，小分子與蛋白Merg為PDB格式保存，導入Ligplot軟件中，可以研究多個配體在同一個受體中的結合、單個配體與不同受體的結合或者不同配體在不同受體中的結合，并自動計算形成的氫鍵、疏水作用和結構比對[10]。

2.5 關鍵化學成分的ADME/T性質 基于SwissADME和TCMSP進行初期藥物開發(fā)毒性篩選。相關參數(shù)包括有溶解度，血腦屏障穿透性，氫鍵受體數(shù)(H-bond acceptors，HBA)，可旋轉鍵數(shù) (rotatable bonds，RBN)，血屏障穿透性 (blood-brain barrier，BBB)，氫鍵供體數(shù) (H-bonddonors，HBD)，Caco-2 細胞通透性 (Caco-2 cell permeabilic)等。

3 實驗結果

3.1 復方一枝黃花噴霧劑活性成分 基于TCMSP和文獻篩選出復方一枝黃花噴霧劑活性成分，其中一枝黃花11個化學成分，貫眾7個化學成分，薄荷10個化學成分，荊芥11個，連翹23個化學成分，山銀花6個化學成分，艾納香6個化學成分。共收集復方一枝黃花噴霧劑活性成分74個。

3.2 分子對接分析

3.2.1 復方一枝黃花噴霧劑化合物與HIV-1蛋白酶分子對接分析 目前FDA上市的抗HIV-1蛋白酶抑制劑已達10個，包括：Saquinavir(沙奎那韋，SQV)、Ritonavir(利托那韋，RTV)、Indinavir(茚地那韋，IDV)等。本研究將選擇SQV和RTV為陽性對照藥。SQV和RTV與HIV-1蛋白酶對接得分為7.1和11.8(T_Score)。根據陽性藥對接結果，本研究選擇T_Score>7為閾值，復方一枝黃花噴霧劑74個活性成分，其中26個活性成分與HIV-1蛋白酶結合得分大于7(表1)。其中化學成分Diosmetin和Harmonyl與HIV-1蛋白酶結合的最好。

表1 復方一枝黃花噴霧劑化合物與HIV-1蛋白酶分子對接分析表

3.2.2 復方一枝黃花噴霧劑化合物與組織蛋白酶L分子對接分析 SID 26681509 是人組織蛋白酶 L (human cathepsin L) 抑制劑。研究將SID 26681509作為陽性對照，分子對接的結果顯示，SID 26681509與Cathepsin L 結合得分為10.4(T_Score)，與SID 26681509對比，尚未發(fā)現(xiàn)復方一枝黃花噴霧劑的化學成分與Cathepsin L 結合得分超過10.4，但是復方一枝黃花噴霧劑與Cathepsin L結合T_Score≥7的化學成分有5個，后面也會重點研究這些化合物的體內活性。其中化學成分2-Methoxybenzyl-2,3,6-trimethoxybenzoate和Supraene與組織蛋白酶 L結合的最好。

表2 復方一枝黃花噴霧劑化合物與組織蛋白酶 L分子對接分析表

3.3 相互作用分析 化學成分Diosmetin和Harmonyl與HIV-1蛋白酶結合的最好，化學成分2-Methoxybenzyl-2,3,6-trimethoxybenzoate和Supraene與組織蛋白酶 L結合的最好，通過Ligplot1.4.5軟件進行相互作用分析，結果以氫鍵、疏水作用輸出，篩選關鍵的氨基酸位點。結果由圖1顯示，Diosmetin與HIV-1蛋白酶相互作用形成四個氫鍵(Gly27、Gly48、Gly49、Arg8)，Harmonyl與HIV-1蛋白酶相互作用形成兩個氫鍵(Arg8、Asp30)；結果由圖2顯示，2-Methoxybenzyl-2,3,6-trimethoxybenzoate和Supraene與組織蛋白酶L相互作用有很大的相似性，與Asp72、Met71、Leu70等氨基酸殘基類型及相對位置相同。

圖1 Diosmetin (A)和Harmonyl(B)與HIV-1蛋白酶相互作用的關鍵氨基酸圖

圖2 2-Methoxybenzyl-2,3,6-trimethoxybenzoate(A)和Supraene(B)與組織蛋白酶 L相互作用的關鍵氨基酸圖

3.4 復方一枝黃花噴霧劑關鍵活性成分理化性質分析 通過分子對接分子發(fā)現(xiàn)復方一枝黃花噴霧劑16個化學成分與HIV-1和Cathepsin L分子對接得分均大于5，雖然尚未超過陽性藥，但是可能與HIV-1和Cathepsin L具有潛在的結合，因此對復方一枝黃花16個化學成分進行ADMET性質分析，為體內實驗做準備。BBB<-0.3 的化合物被認為是非穿透性(BBB-)，從-0.3到0.3的中等穿透性(BBB±)，并且 >0.3表示強穿透力(BBB+)。Caco-2細胞模型作為一個標準的小腸滲透篩選模型已經被越來越廣泛的接受。根據Lipinski規(guī)則，小分子應該具備H-bond acceptors<5，H-bond donors<10，Rotatable bonds<10。如果過多參數(shù)不符合，會影響藥物的溶解性及腸吸收能力，16個化學成分，具有較好的口服吸收利用度，基本遵循Lipinski規(guī)則(表3)。

表3 復方一枝黃花噴霧劑關鍵活性成分

4 討論

人類的健康與生存受到病毒的嚴重威脅，其中病毒蛋白酶可將前體蛋白剪切修飾得到成熟蛋白[11]。人類免疫缺陷病毒(HIV)感染可導致獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)，導致全身免疫功能衰竭并產生并發(fā)癥[12]?？笻IV-1藥物目前有整合酶抑制劑(INIs)、逆轉錄酶抑制劑(RTIs)、蛋白酶抑制劑(PIs)等，抗HIV-1蛋白酶抑制劑已經有10個[13]。組織蛋白酶L分布廣泛，如細胞質、細胞核和細胞外基質中，參與蛋白質降解及維持細胞內蛋白平衡，與多種病理生理過程相關。已經有相關研究[14]表明抑制組織蛋白酶L過度激活已成為治療相關炎癥性疾病的重要靶標。目前，已經篩選出多種類型的抗 HIV-1天然化合物，但是作用于HIV-1整合酶和蛋白酶的比較少。進一步研究開發(fā)新的組織蛋白酶L和HIV-1抑制劑藥物，具有廣闊發(fā)展前景。 復方一枝黃花噴霧劑由一枝黃花、貫眾、山銀花、連翹、荊芥、艾納香、薄荷制成的噴霧劑。收集復方一枝黃花噴霧劑化學成分，有望從中篩選出抗HIV-1蛋白酶和Cathepsin L的抑制劑，通過分子對接發(fā)現(xiàn)復方一枝黃花噴霧劑有潛在的抗HIV-1和Cathepsin L的化學成分，在今后的研究中，我們將選擇篩選出的有效的抗HIV-1和Cathepsin L化學成分進行體內研究，進一步驗證其篩選結果。