突出核磁共振波譜儀應(yīng)用的藥學(xué)波譜課程 改革與實踐

王耀楠 熊瑜 劉子涵 高岐 馮琦琦 張筱宜 王玉記

1.首都醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)中心實驗室，北京 100069；3.國家知識產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作北京中心，北京 100160；4.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院，北京 101100

藥學(xué)是連接健康科學(xué)和化學(xué)科學(xué)的醫(yī)學(xué)行業(yè)。藥物小分子化學(xué)結(jié)構(gòu)的鑒定、藥物分子構(gòu)效關(guān)系的研究等化學(xué)科學(xué)相關(guān)知識在藥學(xué)人才培養(yǎng)中占有重要地位。藥物分子是由不同的原子按照一定的規(guī)律排布連接而成，將自旋量子數(shù)不為零的原子置于外加磁場中，原子核的核磁矩會沿著磁場方向排布，此時使用外加的射頻脈沖照射原子核，原子核會吸收射頻脈沖的能量，從低能級躍遷至高能級，核磁矩方向會發(fā)生偏轉(zhuǎn)[1]。當把外加的射頻脈沖去掉時，原子核會從高能級弛豫到低能級，核磁矩會恢復(fù)至初始的方向，并將吸收的能量以發(fā)射電磁波的形式釋放，這種現(xiàn)象稱為核磁共振現(xiàn)象，發(fā)射出電磁波的頻率與原子核在分子中的化學(xué)環(huán)境密切相關(guān)，通過解析核磁共振譜圖即可得出與分子結(jié)構(gòu)相關(guān)的信息，核磁共振譜儀已成為鑒定藥物分子結(jié)構(gòu)的必需設(shè)備。目前已有多所高校在本科生的實驗教學(xué)中引入核磁共振譜儀[2-4]，培養(yǎng)學(xué)生使用大型科研儀器的能力。

以核磁共振譜儀為代表的大型儀器在人才培養(yǎng)中的作用日趨重要[5-9]。核磁共振原理相對來說比較復(fù)雜，學(xué)生在學(xué)習(xí)過程中對核磁共振原理的理解有一定困難。核磁共振現(xiàn)象是在實驗過程中發(fā)現(xiàn)的，實驗課程是學(xué)習(xí)核磁共振知識的有效方法。借助于波譜解析課程的教學(xué)改革項目，多所高校在關(guān)于核磁共振的教學(xué)上取得了一些效果[10-13]。還有高校意識到了綜合素質(zhì)對人才培養(yǎng)的重要性，開設(shè)了綜合性的實驗課程，但這些課程彼此之間關(guān)聯(lián)性較弱，學(xué)生只是借助核磁共振譜儀完成了一項獨立的課題[14-17]。為了便于學(xué)生掌握使用核磁共振技術(shù)解析分子結(jié)構(gòu)的技能，首都醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)專業(yè)在人才培養(yǎng)中設(shè)置了兩種不同層次的課程供學(xué)生進行核磁共振譜儀等大型科研儀器設(shè)備的學(xué)習(xí)。本文將從課程的基本設(shè)置、具體實施、效果評價3 個方面探討核磁共振譜儀對藥學(xué)人才培養(yǎng)的意義。

1 層次遞進的課程設(shè)置

首都醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)專業(yè)在人才培養(yǎng)中設(shè)置了藥物的波譜解析和藥學(xué)專業(yè)實驗課程。這兩門課程在層次上是遞進的關(guān)系，藥物的波譜解析為藥學(xué)專業(yè)課程，是學(xué)習(xí)核磁共振譜儀的基礎(chǔ)，在本科三年級的第一學(xué)期開展；藥學(xué)專業(yè)實驗課程為擴展性的應(yīng)用課程，在本科四年級第一學(xué)期開展。

1.1 藥物的波譜解析

藥物的波譜解析是藥學(xué)專業(yè)的必修課程，與藥學(xué)相關(guān)的中藥或化學(xué)等專業(yè)也會開設(shè)此課程，其他開設(shè)這門課程的高等院校在教學(xué)活動中進行了各種教學(xué)改革，以提升教學(xué)效果[3,4]，首都醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院在總結(jié)并借鑒了各校優(yōu)秀教學(xué)措施的基礎(chǔ)上，以各種藥物的分子結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，開設(shè)有藥學(xué)專業(yè)特色的波譜解析課程[10,13]。學(xué)生可以系統(tǒng)性的學(xué)習(xí)與分子結(jié)構(gòu)相關(guān)的四大譜學(xué)知識，掌握解析分子結(jié)構(gòu)的技能。課程分為理論和實驗兩部分，理論課和實驗課各占54 學(xué)時，其中由于核磁共振部分的理論相對復(fù)雜，在學(xué)時分配上有所倚重，占總學(xué)時的三分之一。實驗課程與理論課程緊密相連，學(xué)生在實驗課程中可以通過真實的上機測試圖譜，驗證理論課學(xué)習(xí)的內(nèi)容。

1.2 藥學(xué)專業(yè)綜合實驗

藥學(xué)專業(yè)實驗是涵蓋藥物設(shè)計、合成、分析、評價等全流程的綜合性實驗課程，學(xué)生可以在這門課程中學(xué)習(xí)藥物臨床前研究的整個過程。整個實驗課程的流程設(shè)計按照新藥研發(fā)的步驟開展，學(xué)生需要在判定合成的化合物結(jié)構(gòu)正確之后才可以進行分析以及評價部分的實驗。通過化合物結(jié)構(gòu)鑒定的過程，學(xué)生進一步鞏固了核磁共振譜儀等大型分析儀器的操作，并且還掌握了圖譜分析的相關(guān)知識。

2 注重實操的課程實施方案

藥學(xué)是一門實驗性較強的學(xué)科，對于波譜解析這種理論知識點繁多且抽象，知識點關(guān)聯(lián)較少的課程，更需借助實驗課程來加深對理論課內(nèi)容的學(xué)習(xí)。

2.1 多測多練，夯實學(xué)習(xí)基礎(chǔ)

在藥物的波譜解析課程中，實驗課程的設(shè)置與理論課程同步進行，每周均安排有實驗課程與理論課程相匹配，學(xué)生分成4 組，每組人數(shù)不超過10 人，分別進行紫外光譜、紅外光譜、核磁共振波譜及質(zhì)譜的實驗，每組均安排專門的教師進行帶教實驗，這種小班教學(xué)的模式使得每個同學(xué)都有上機測試譜圖的機會，教師會詳細介紹儀器的原理和參數(shù)，學(xué)生可以根據(jù)教師的講解親自上機測試。提供給學(xué)生測試的樣品均為常用藥物的原料藥成分，在學(xué)習(xí)儀器操作技能的同時，還可以根據(jù)測試的藥物圖譜驗證理論課學(xué)習(xí)的知識點。

為了增強學(xué)習(xí)效果，在實驗時又將每組學(xué)生分為兩個小組，小組內(nèi)的同學(xué)在上機測試時互相交流，可加深對儀器參數(shù)的理解；由于組內(nèi)同學(xué)所測化合物的結(jié)構(gòu)相近，在譜圖解析時互相討論，還可加深對知識點的理解。以氨基酸衍生物為例，在小組內(nèi)分配化合物時，教師會選擇結(jié)構(gòu)類似的纈氨酸和異亮氨酸的衍生物，以及苯丙氨酸和酪氨酸的衍生物進行配對結(jié)構(gòu)分析，研究結(jié)構(gòu)上的變化如何在譜圖上體現(xiàn)。如圖1 所示，左側(cè)為纈氨酸芐酯的氫譜，右側(cè)為異亮氨酸芐酯的氫譜，兩個化合物結(jié)構(gòu)上的差異在于異亮氨酸比纈氨酸多了一個亞甲基，其余部分的結(jié)構(gòu)類似，在異亮氨酸的氫譜中可以明顯看到在化學(xué)位移1.25 和1.41 處多了兩個積分面積為1的信號峰，且由于兩個化合物結(jié)構(gòu)中甲基臨位結(jié)構(gòu)上的差異，在纈氨酸的氫譜中，化學(xué)位移0.95 和0.92的兩個積分為3 的兩重峰均為甲基信號峰，而在異亮氨酸的結(jié)構(gòu)中，化學(xué)位移0.88 處積分為3 的甲基信號為兩重峰，化學(xué)位移0.85 處積分為3 的甲基信號峰為三重峰。

圖1 纈氨酸和異亮氨酸的核磁共振氫譜（局部）圖

對于苯丙氨酸和酪氨酸來說，結(jié)構(gòu)上的差異主要在結(jié)構(gòu)中的苯環(huán)部分，從圖2 可以看出，左側(cè)酪氨酸芐酯的氫譜中，化學(xué)位移9.43 處的信號峰代表酚羥基的信號，同時在化學(xué)位移6.96 和6.68 處的兩個二重峰的耦合常數(shù)均為8Hz，積分面積均為2，這些均是明顯的苯環(huán)對位取代的信號峰，這些在右側(cè)的苯丙氨酸芐酯中均未觀察到。

圖2 酪氨酸芐酯和苯丙氨酸芐酯的核磁共振氫譜（局部）圖

通過以上簡單的兩個例子，同學(xué)們復(fù)習(xí)了理論課上學(xué)到的化學(xué)位移、耦合常數(shù)和積分面積3 個與氫譜相關(guān)的知識點。類似的結(jié)構(gòu)相似化合物還有很多，學(xué)生在譜圖解析時通過彼此討論，互相比對，印證理論課上學(xué)到的知識點，這樣就能激發(fā)學(xué)習(xí)核磁共振相關(guān)知識的興趣，提升學(xué)習(xí)的效果。

2.2 自主上機，加強實際應(yīng)用

為了讓學(xué)生對所學(xué)知識融會貫通并對藥物臨床前研究的所有環(huán)節(jié)有所了解，藥學(xué)院以自身的科研成果為基礎(chǔ)，設(shè)計了涵蓋藥物設(shè)計、合成、分析、評價等全流程的綜合性實驗課程[18]。在這個實驗課程中，學(xué)生需要從藥物設(shè)計的原理出發(fā)，根據(jù)計算機藥物輔助設(shè)計的計算結(jié)果，從氨基酸原料開始先導(dǎo)化合物的合成，并利用核磁共振、質(zhì)譜、紅外光譜等設(shè)備對合成的目標產(chǎn)物進行鑒定，確定合成的結(jié)果正確之后再進行藥劑學(xué)方面的工作，制備納米脂質(zhì)體，最后選擇合適的動物模型，對制備好的劑型進行生物活性評價。本課程在大四的第一學(xué)期開設(shè)，學(xué)生需要獨立完成全部實驗內(nèi)容。在此之前，學(xué)生已經(jīng)修完了藥物化學(xué)、藥物分析、藥劑學(xué)以及藥理學(xué)的專業(yè)課程，在完成實驗的過程中，學(xué)生會綜合用到學(xué)過的專業(yè)知識，核磁共振在這里是作為目標產(chǎn)物鑒定的主要工具，學(xué)生需要根據(jù)波譜解析課程中學(xué)習(xí)的知識，完成樣品制備、上機測試以及譜圖分析的全過程。

本實驗課程用到的化合物之一，是多肽和小分子藥物。作為北京市重點實驗室的科研成果，合成路線成熟，學(xué)生們只需按照實驗講義的操作步驟即可順利完成，但在處理完化學(xué)反應(yīng)、完成純化之后需對反應(yīng)產(chǎn)物進行鑒定，就必須要用到核磁共振譜儀才能實現(xiàn)。前期在波譜解析課程中已經(jīng)學(xué)習(xí)過樣品的制備以及上機測試的內(nèi)容，因此在這個綜合實驗課程中，教師只需從旁監(jiān)督，協(xié)助學(xué)生即可完成實驗。本實驗的關(guān)鍵步驟是在最后一步的合環(huán)反應(yīng)，合環(huán)前后的化合物的氫譜，見圖3。

圖3 方框中標出的化學(xué)位移1.39 和1.25 處，積分面積為3 的兩個單峰，對應(yīng)分子結(jié)構(gòu)中利用丙酮和兩個氮原子反應(yīng)生成的五元環(huán)上連接的兩個甲基，由于五元環(huán)與左側(cè)的平面結(jié)構(gòu)相連，連接的兩個甲基處于環(huán)的不同平面，造成了化學(xué)位移上的差異。此外，從氫譜上還可以觀察到更多的信息，如結(jié)構(gòu)中的其他氫原子的信號，分別向低場和高場移動，需要對信號進行歸屬后再具體分析。在歸屬的過程中，僅依靠氫譜圖提供的信息并不能對信號進行完全的指認，比如處在飽和六元環(huán)上的兩個亞甲基上的氫原子，它們分別處在環(huán)上碳原子的平伏鍵和直立鍵，化學(xué)位移差異較大，對它們的精確歸屬需借助核磁共振二維譜的信息。這也能激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)二維譜的興趣。

圖3 合環(huán)前的化合物與合環(huán)后的化合物的核磁共振氫譜（局部）圖

3 以靈活運用為目標的教學(xué)效果評價

將學(xué)到的知識靈活運用，是學(xué)習(xí)的最終目標。教學(xué)效果評價的方式分為3 個層面。第1 個層面是以習(xí)題為主要形式，除了如磁矩、磁化矢量、弛豫等原理性的知識點以外，對于其他關(guān)于實際應(yīng)用的知識點，如化學(xué)環(huán)境如何影響化學(xué)位移，連接方式如何影響信號峰的裂分和耦合等內(nèi)容，以應(yīng)用為目標進行考核。除了期末考試之外，在學(xué)期中間也安排有階段性的考核，針對前期所講授的內(nèi)容進行教學(xué)效果評價。階段性考核的形式以譜圖解析的練習(xí)題為主，在解析圖譜的過程中強化對知識點的理解并增強學(xué)生的解譜能力，注重對學(xué)習(xí)過程的考核，避免學(xué)生期末進行突擊式的復(fù)習(xí)而忽視對知識的運用，督促其將學(xué)習(xí)的精力放在日常的課業(yè)中。

效果評價的第2 個層面，是以小組協(xié)作的方式開展，在平時的實驗課程中，除了每個人自己測試并解析的圖譜以外，每個小組會分配一個固定的未知化合物進行圖譜測試，在4 次實驗課結(jié)束后，這個未知化合物的全套圖譜都將測試完成，最后1 次課程會以小組匯報演講的形式解析未知化合物的結(jié)構(gòu)，小組成員需要分工協(xié)作并互相討論，確定化合物結(jié)構(gòu)后再以演講的形式介紹團隊解析的結(jié)果。在這個過程中，小組內(nèi)的每個成員都需要集思廣益，為本組分配的化合物結(jié)構(gòu)解析獻言獻策，除了核磁共振提供的信息之外，還需要借助質(zhì)譜、紅外等譜圖提供的信息進行確認。最終的展示環(huán)節(jié)也是對同學(xué)們演講能力的一個提升，切實踐行全方位培養(yǎng)藥學(xué)人才的育人理念。

效果評價的第3 個層面，是重點考察對知識的運用能力，依托于藥學(xué)專業(yè)實驗中對目標化合物鑒定的過程。由于此實驗的定位是需要每個同學(xué)獨立完成的綜合性實驗，實驗過程緊湊且連續(xù)，需要根據(jù)合成目標化合物鑒定的結(jié)果開展后續(xù)實驗，如果鑒定過程出現(xiàn)問題，勢必會影響后續(xù)分析及評價的實驗部分。核磁共振提供的信息對化合物的鑒定尤為重要，這就需要學(xué)生留意從樣品制備到上機測試以及最終獲取核磁共振譜圖的所有細節(jié)，任何一個環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題均會影響最終的實驗結(jié)果。能夠獨立操作核磁共振譜儀進行譜圖采集并進行譜圖解析、鑒定合成的化合物，順利完成最終實驗的同學(xué)，也就完成了核磁共振相關(guān)知識運用能力的考核。

4 結(jié)語

藥物的波譜解析和藥學(xué)專業(yè)實驗課程，在課程設(shè)置的層次上逐步遞進，在教學(xué)內(nèi)容的把控上將理論知識與上機操作置于同等重要的地位，在教學(xué)效果的評價上注重對學(xué)生知識運用能力的考核。藥學(xué)專業(yè)的本科生在學(xué)習(xí)藥物的波譜解析和藥學(xué)專業(yè)實驗課程后，對于核磁共振波譜儀等大型儀器均能夠熟練操作，初步具備了未知化合物結(jié)構(gòu)解析的能力。核磁共振譜儀在藥學(xué)人才的培養(yǎng)中發(fā)揮了重要作用。