改性豆渣對(duì)高脂血癥大鼠生理和腸道菌群的影響

向沁雪，田 瑞，吳 波，孫國根，陳麗梅，莫開菊,*

（1.湖北民族大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.風(fēng)濕性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（湖北民族大學(xué)），湖北 恩施 445000；3.恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院，湖北 恩施 445000）

豆渣中膳食纖維相對(duì)含量達(dá)到62.5%，而不被人體消化部分占90.64%，不溶性成分又占不被消化的94.92%[1]，因此大豆膳食纖維主要是不溶性成分。大豆不溶性膳食纖維具有與有毒重金屬結(jié)合的能力[2]，以及預(yù)防肥胖[3]、控制體質(zhì)量的效果[4]。

目前，肥胖已成為世界性公共衛(wèi)生問題。肥胖、高血脂不僅與遺傳有關(guān)，更與生活習(xí)慣、營養(yǎng)偏頗等因素有關(guān)，是心腦血管疾病、高血壓、糖尿病、腫瘤等多種疾病的誘發(fā)因素。脂質(zhì)主要是食物在腸道被消化吸收入血液，此外饑餓時(shí)從脂肪組織或肝臟中也可動(dòng)員一部分脂質(zhì)吸收入血液，通過血液循環(huán)被運(yùn)輸?shù)饺砀魈帯７逝终咝枰ㄟ^控制飲食，減少高熱量和高脂肪類食品的攝入。膳食纖維具有預(yù)防及輔助治療過度肥胖和高血脂癥等疾病的作用。

本實(shí)驗(yàn)采用不同方法改性豆渣膳食纖維，考察其調(diào)節(jié)大鼠血脂和減肥的功效，以期為豆渣膳食纖維的深度開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF級(jí)Wistar雄性大鼠（3 月齡）70 只，體質(zhì)量150～200 g，飼養(yǎng)于相對(duì)濕度40%～60%、溫度為（22±2）℃環(huán)境中，所有大鼠飲水和攝食自由，飼喂普通飼料。生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（遼）2020-0001。

原豆渣：普通豆渣用純凈水洗過濾至水清澈，以去除豆渣中的蛋白質(zhì)；改性豆渣：原豆渣經(jīng)烘干后按料液比1∶9加入1.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）NaOH溶液或1.5% Na2HPO4溶液，在溫度32 ℃、壓力20.68 MPa的超臨界CO2條件下改性4 h，然后反復(fù)洗滌去除可溶性成分，離心留取不溶性殘?jiān)?，烘干，作為改性豆渣[5]，用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

脂肪乳配方：10%（相對(duì)含量，下同）膽固醇、1%甲基硫氧嘧啶、20%豬油、20%吐溫-80、2%膽酸鈉、30%丙二醇和17%蒸餾水。

血脂康膠囊 北京北大維信生物科技有限公司；乙醚 國藥集團(tuán)化學(xué)有限公司；BL539A多聚甲醛Biosharp生物科技公司；血脂測(cè)定試劑盒 濰坊三維生物工程集團(tuán)有限公司；D3142 DNA提取試劑盒 廣州美基生物科技有限公司；液氮 武漢華星工業(yè)技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

NanoDrop微量分光光度計(jì) 美國賽默飛世爾科技公司；TG16-WS離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；DYY-6C電泳儀 北京六一生物科技有限公司；TMS-1024i全自動(dòng)生化分析儀 美生實(shí)業(yè)有限公司；ETC 811聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司；QuantiFluorTM熒光計(jì) 普洛麥格（北京）生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

實(shí)驗(yàn)周期共76 d，適應(yīng)期3 d，建模期26 d，干預(yù)期45 d，后期處理2 d。

1.3.1 大鼠造模及分組

大鼠造模及分組方法根據(jù)文獻(xiàn)[6-8]加以整合及完善。適應(yīng)期后，將大鼠分為高脂飲食（high fat diet，HF）組60 只和空白對(duì)照（control check，CK）組10 只，用10 mL/（kg·d）劑量的脂肪乳灌胃建模，以HF的體質(zhì)量和4 項(xiàng)血脂指標(biāo)（總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C））與CK組比較，差異顯著，判定模型成功。

建模成功后，對(duì)高脂飲食組進(jìn)行二次分組，共分為5 組，每組12 只大鼠，分別是高血脂對(duì)照（hyperlipidemia control，HC）組、藥物對(duì)照（positive drug control，DC）組、未改性豆渣（bean dregs contrast，BC）組和Na2HPO4改性豆渣（disodium hydrogen phosphate modified bean dregs，DB）組及NaOH改性豆渣（sodium hydroxide modified bean dregs，SB）組。

1.3.2 大鼠建模及干預(yù)期喂養(yǎng)

灌胃劑量分別為藥物對(duì)照組灌胃血脂康溶液，劑量為30 mg/（kgmb·d）、豆渣灌胃組分別灌胃不同處理豆渣，劑量1 g/（kgmb·d），高血脂對(duì)照組灌胃蒸餾水，劑量為10.0 mL/（kgmb·d）。

建模期和干預(yù)期：飼喂普通飼料，自由進(jìn)食記錄每日攝食量，每3 d稱體質(zhì)量。

1.3.3 血脂指標(biāo)檢測(cè)

4 項(xiàng)血脂指標(biāo)檢測(cè)：建模完成后及干預(yù)期每15 d測(cè)定血脂水平，將大鼠剪尾取血，取0.3 mL血液于肝素鈉負(fù)壓采血管內(nèi)；干預(yù)完成（即在干預(yù)第45天）麻醉后從心臟取血。采血后離心（3 000 r/min、10 min），取血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)4 項(xiàng)血脂指標(biāo)即TC、TG、HDL-C、LDL-C濃度。

1.3.4 臟器指數(shù)檢測(cè)

干預(yù)45 d后，禁食不禁水，過夜，次日采用吸入乙醚麻醉，打開胸腔，暴露心臟，從心臟處取血（用肝素鈉負(fù)壓采血管），從心尖部位灌注37 ℃生理鹽水，洗至內(nèi)臟無血色，心臟右心耳流出液體為無色。解剖、取出大鼠的肝臟、脾臟、腎臟并稱質(zhì)量。臟器指數(shù)計(jì)算如下式。

1.3.5 腸道微生物檢測(cè)

大鼠解剖后取出內(nèi)臟，放進(jìn)超凈工作臺(tái)，取出盲腸并將其內(nèi)容物擠進(jìn)滅菌后的EP管內(nèi)，封存并用液氮速凍，于-80 ℃冰箱內(nèi)保存，送至廣州基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行16S rRNA測(cè)序，測(cè)序區(qū)域：16S（V3～V4），引物名稱：341F、806R，引物序列分別為5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’、3’-GGACTACHVGGGTATCTAAT-5’，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠回收，用QuantiFluorTM熒光計(jì)定量分析。等量混合純化的擴(kuò)增產(chǎn)物，連接測(cè)序接頭，構(gòu)建測(cè)序文庫，利用Illumina PE250上機(jī)測(cè)序，使用Krona 2.6軟件計(jì)算每個(gè)物種分類的豐度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析檢驗(yàn)數(shù)據(jù)顯著性差異以及偏相關(guān)性分析，采用Origin軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 高脂血大鼠造模結(jié)果

如圖1所示，與CK組相比，HC組體質(zhì)量、TC、TG、LDL-C、HDL-C濃度均有顯著或極顯著差異（P＜0.05、P＜0.01），表明造模成功。

圖1 造模期大鼠各項(xiàng)指標(biāo)Fig. 1 High-fat diet feeding induced hyperlipidemia in rats

2.2 大鼠生理指標(biāo)變化

2.2.1 大鼠體質(zhì)量變化

實(shí)驗(yàn)期間每3 d稱1 次體質(zhì)量，第42天是實(shí)驗(yàn)結(jié)束前最后1 次稱質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)第12天是體質(zhì)量變化的轉(zhuǎn)折點(diǎn)。高脂血癥大鼠體質(zhì)量表現(xiàn)為持續(xù)快速增長；干預(yù)期第12天后，體質(zhì)量緩慢增長，干預(yù)各組始終低于HC組。如圖2所示，HC組體質(zhì)量在第12和42天均最高，BC、SB、DB干預(yù)組體質(zhì)量明顯低于HC組和DC組。干預(yù)第42天時(shí)，與HC組相比，DC、BC、SB、DB組體質(zhì)量分別減輕1.5%、10.9%、6.3%、13.3%。

圖2 實(shí)驗(yàn)期間大鼠體質(zhì)量變化Fig. 2 Changes in body mass of rats during high-fat diet feeding

2.2.2 大鼠血脂變化

4 項(xiàng)血脂指標(biāo)中TC、TG、LDL-C濃度過高被認(rèn)定為高脂血癥，而HDL-C是有益的膽固醇，可降低血管壁膽固醇沉積，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。由表1可知，豆渣灌胃均能改善大鼠血脂。在整個(gè)干預(yù)期，除HDL-C外，CK組3 項(xiàng)血脂指標(biāo)水平較低且平穩(wěn)，HC組水平較高而平穩(wěn)，說明在無外部因素干預(yù)時(shí)不會(huì)自發(fā)大幅波動(dòng)。DC組在藥物作用下，TC、TG、LDL-C濃度持續(xù)下降，HDL-C濃度持續(xù)上升，在45 d時(shí)與0 d相比，TC濃度下降了19.0%、TG濃度下降30.0%、LDL-C濃度下降35.0%、HDL-C濃度上升了34.9%；45 d與0 d相比，3個(gè)豆渣組TC濃度下降了19.7%～32.0%、TG濃度下降了47.0%～59.3%、LDL-C濃度下降了43.2%～55.3%，HDL-C濃度上升了20.9%～48.5%。結(jié)果表明豆渣對(duì)于高脂血癥改善效果明顯且效果優(yōu)于藥物組。但是豆渣灌胃組在15 d內(nèi)變化明顯，改善效果依次分別是DB組＞SB組＞BC組，15 d之后趨于穩(wěn)定。

表1 實(shí)驗(yàn)期間大鼠血脂變化Table 1 Changes in blood lipids in rats during the experiment

續(xù)表1

2.2.3 大鼠臟器指數(shù)變化

由表2可見，各組間臟器指數(shù)沒有顯著差異，其中各組間變化較大的是肝臟指數(shù)，與HC組相比，DC、BC、SB、DB組下降了5.4%～12.8%。相比于CK組，高脂乳使肝臟指數(shù)增大；相較于HC組，灌喂藥物和豆渣均使肝臟指數(shù)降低，DB組對(duì)肝臟指數(shù)的改善效果最好，相比HC組下降了12.8%，與CK組的臟器指數(shù)接近。

表2 實(shí)驗(yàn)期大鼠各臟器指數(shù)Table 2 Visceral organ indexes of rats during the experiment

2.3 大鼠腸道微生物物種豐度差異

各組大鼠腸道微生物種群在門、屬、種水平上存在一定差異。由表3可知，在門水平上，主要有厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria），其中CK組Firmicutes相對(duì)豐度占比最高，Bacteroidetes次之，HC組Firmicutes相對(duì)豐度最高，Bacteroidetes最低，通過豆渣喂養(yǎng)改善后Bacteroidetes相對(duì)豐度明顯增大，F(xiàn)irmicutes減少，降低了Firmicutes/Bacteroidetes相對(duì)豐度比值，本實(shí)驗(yàn)中CK組Firmicutes/Bacteroidetes相對(duì)豐度比值為2.72，HC組為3.36，DC組以及3種豆渣膳食纖維組在1.02～1.31之間。

屬水平上主要有乳桿菌屬（Lactobacillus）、腸桿菌志賀菌屬（Escherichia Shigella）和擬桿菌屬（Bactericides）。除了CK、SB組以外，Lactobacillus相對(duì)豐度均比HC組高，且DB組大幅增長；豆渣各組的Escherichia Shigella相對(duì)豐度均較CK和HC組大幅下降；種水平上，主要菌群有產(chǎn)酸擬桿菌（Bacteroides_acidifaciens）和鼠乳桿菌（Lactobacillus_murinus），Lactobacillus_murinus在大鼠腸道內(nèi)為優(yōu)勢(shì)菌，各實(shí)驗(yàn)組Lactobacillus_murinus相對(duì)豐度與HC組對(duì)比均明顯上升，效果依次分別為DB組＞DC組＞BC組＞SB組。

表3 大鼠腸道微生物相對(duì)豐度變化Table 3 Changes in relative abundance of intestinal microorganisms in rats %

在大鼠腸道菌群中，擬桿菌和厚壁菌為主要的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，均與肥胖相關(guān)。腸道中的厚壁菌群比擬桿菌群多，能更多地吸收食物中的熱量，因而增加體質(zhì)量，進(jìn)而導(dǎo)致肥胖。Proteobacteria屬于致病菌，豆渣組腸道中有益菌群增多，而有害菌群減少。綜合來看，DB對(duì)腸道菌群具有有益作用。

2.4 大鼠腸道菌群與體質(zhì)量及血脂指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)大鼠的理化指標(biāo)和腸道菌群發(fā)生一系列變化，因此將兩類指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)，以期找出腸道菌群與健康指標(biāo)之間的相關(guān)性。首先，進(jìn)行一元線性相關(guān)性分析，將具有顯著相關(guān)性的指標(biāo)列入表4，不具有顯著性的腸道菌未列出。其次，將體質(zhì)量作為控制變量，對(duì)微生物菌群與各項(xiàng)血脂指標(biāo)進(jìn)行偏相關(guān)分析，同樣將有顯著相關(guān)的指數(shù)列于表5。

表4 大鼠腸道菌群與體質(zhì)量、血脂指標(biāo)的一元相關(guān)性分析結(jié)果Table 4 Correlation analysis of intestinal microorganisms with body mass and blood lipids indexes in rats

表5 控制體質(zhì)量時(shí)大鼠腸道菌群與血脂的偏相關(guān)分析結(jié)果Table 5 Partial correlation analysis of rat gut microbiota and blood lipids during body mass control

由表4可以看出，在門水平上，F(xiàn)irmicutes并未表現(xiàn)出與體質(zhì)量和血脂指標(biāo)的相關(guān)性（表4中未列出），而在其屬水平的Lactobacillus和種水平的Lactobacillus_murinus卻與體質(zhì)量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），在引起體質(zhì)量增加時(shí)，并不會(huì)導(dǎo)致血脂異常，對(duì)二者的影響沒有同步性。Bacteroidetes與LDL-C濃度之間呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與HDL-C濃度之間呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），顯示出擬桿菌對(duì)血脂健康的有利影響。Proteobacteria及其所屬Escherichia Shigella與HDL-C濃度呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），表明其對(duì)血脂健康的負(fù)面影響。由此可見，腸道菌群的確對(duì)體質(zhì)量和血脂健康有重要影響。

在控制體質(zhì)量干擾的情況下，菌群與血脂之間偏相關(guān)分析的結(jié)果如表5所示。Firmicutes中的Lactobacillus豐度與HDL-C濃度呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），和TC、TG濃度呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），種水平中的Lactobacillus_murinus對(duì)血脂4 項(xiàng)指標(biāo)均表現(xiàn)出有益作用。結(jié)合表4及表5可見，F(xiàn)irmicutes的一些菌群既有利于體質(zhì)量增加，又有利于血脂健康。說明體質(zhì)量增加不一定引起血脂異常，其深層次機(jī)理值得更深入廣泛的進(jìn)行研究。Bacteroidetes及Bacteroides不僅不會(huì)引起體質(zhì)量增加，而且對(duì)血脂多項(xiàng)指標(biāo)的改善有益。Proteobacteria及其所屬的Escherichia Shigella與LDL-C濃度呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），Proteobacteria也與TG濃度呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），表明其對(duì)血脂健康的負(fù)面影響。

3 討 論

膳食纖維有防治高血壓、高血脂、肥胖等疾病的效果。大豆種皮多糖可以減輕體質(zhì)量，降低血清脂質(zhì)[9]。大豆不溶性膳食纖維對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肥胖具有預(yù)防作用[3]，本實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。

近年來，很多研究證實(shí)膳食纖維的減肥作用與腸道菌群的改變相關(guān)。小鼠肥胖的發(fā)展通常伴隨著Firmicutes與Bacteroidetes比例增加以及幾種機(jī)會(huì)性病原體的生長。Turnbaugh等[10]研究指出同窩小鼠中肥胖小鼠厚壁菌豐度高、擬桿菌豐度低，且將其腸道微生物移植到無菌小鼠腸道中，導(dǎo)致后者Firmicutes與Bacteroidetes比例升高，且體脂增加，Thaiss等[11]也獲得了同樣的研究結(jié)果。同樣人體腸道中Firmicutes與Bacteroidetes的比例也與肥胖密切相關(guān)，Turnbaugh等[12]對(duì)肥胖和苗條雙胞胎的核心腸道微生物的研究證實(shí)了上述結(jié)果。腸道微生物群能調(diào)節(jié)宿主代謝，益生菌和益生元可用于治療和管理肥胖及幾種相關(guān)的代謝紊亂[13]，益生元可減少超重或肥胖兒童的體脂并改變腸道微生物群[14]。低聚果糖可降低肥胖小鼠腸道菌群Firmicutes與Bacteroidetes的比例[15]，可以降低飲食誘導(dǎo)小鼠的肥胖風(fēng)險(xiǎn)[16]，也有報(bào)道稱，肥胖的特征是腸道雙歧桿菌數(shù)量減少[17-19]。Daniel等[20]通過薈萃分析發(fā)現(xiàn)，膳食纖維中果聚糖和低聚半乳糖能增加雙歧桿菌和Lactobacillus等腸道益生菌的豐度。

大豆膳食纖維與腸道菌群的關(guān)系研究還較少。Wang Bixiang等[21]報(bào)道不溶性大豆膳食纖維通過增加乳酸桿菌的相對(duì)豐度，改善腸道菌群，降低小鼠肝臟脂質(zhì)含量和脂肪滴數(shù)量。大豆種皮多糖可改善腸道菌群的多樣性[22-23]。大豆多糖可調(diào)節(jié)小鼠和人體的腸道菌群[24-25]。

大豆膳食纖維的減肥降血脂機(jī)理是多方面的，除其飽腹感和吸附作用、降低了營養(yǎng)素及油脂、膽固醇等致胖致高血脂物質(zhì)的攝入外，目前報(bào)道較多的是其調(diào)節(jié)腸道菌群并通過腸道微生物產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸，影響葡萄糖、脂質(zhì)和膽固醇代謝，其乙酸導(dǎo)致肥胖，而丙酸和丁酸有助于減重[26-28]。厚壁菌和擬桿菌都以產(chǎn)生丙酸和丁酸為主，但每種菌只產(chǎn)生一種短鏈脂肪酸。Kim等[29]報(bào)道日常飲食中添加豆渣，可以上調(diào)肥胖小鼠肝臟中過氧化物增殖激活受體α、下調(diào)其細(xì)胞凋亡的膜表面分子表達(dá)水平，從而改善肥胖。

本實(shí)驗(yàn)聚焦于改性豆渣膳食纖維對(duì)肥胖和高血脂癥大鼠的生理及腸道菌群的影響，豐富了大豆不溶性膳食纖維與血脂健康及腸道菌群的關(guān)系研究，對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠的腸道菌群與相關(guān)的生理指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)irmicutes未對(duì)體質(zhì)量和血脂指標(biāo)表現(xiàn)出相關(guān)性，而Lactobacillus、Lactobacillus_murinus雖然與體質(zhì)量呈正相關(guān)，但是有益于血脂健康，二者對(duì)體質(zhì)量與血脂的影響并不同步。Bacteroidetes及其Bacteroides對(duì)HDL-C濃度和LDL-C、TC、TG濃度均有積極影響。Proteobacteria及其所屬的Escherichia Shigella對(duì)血脂健康有負(fù)面影響。有關(guān)研究表明[30-32]，Bacteroidetes參與類固醇、多糖等代謝，F(xiàn)irmicutes促進(jìn)宿主從膳食纖維中吸收能量，但是本研究結(jié)果提示Firmicutes所屬微生物對(duì)體質(zhì)量和血脂的影響存在差異性，值得深入研究厚壁菌微生物種群對(duì)機(jī)體的不同影響，這將有利于更精準(zhǔn)地通過調(diào)整腸道微生物調(diào)理人體的健康狀態(tài)。

4 結(jié) 論

與HC組相比，灌胃豆渣使大鼠體質(zhì)量和肝臟指數(shù)下降，顯著改善4 項(xiàng)血脂指標(biāo)，豆渣改善效果依次為DB組＞SB組＞BC組。豆渣使高脂血癥大鼠的腸道微生物的物種有所改變，其中DB組最為明顯；優(yōu)勢(shì)菌群如Bacteroidetes及Firmicutes中的Lactobacillus、Lactobacillus_murinus相對(duì)豐度增大，有害菌群的Proteobacteria及其所屬的Escherichia Shigella相對(duì)豐度減少，說明改性豆渣對(duì)血脂和肥胖的改善作用是通過調(diào)整腸道菌群實(shí)現(xiàn)的。