石 楊, 汪夢婷, 靳雨璠, 于 月, 張 旭, 李家豪, 姜 南, 李 斌, 陳 稷, 黃 進(jìn)*

(1. 成都理工大學(xué) 生態(tài)環(huán)境學(xué)院, 成都 610059； 2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院, 成都 611130 )

近年來，隨著人類工業(yè)化進(jìn)程的加快，干旱、鹽堿化和重金屬污染問題對農(nóng)作物的威脅日趨嚴(yán)重，其中重金屬污染問題尤為突出。鎘(Cd)作為一種重金屬，因其具有高毒性，即使在土壤中以較低濃度存在，也會對農(nóng)作物產(chǎn)生極強(qiáng)的毒性，進(jìn)而影響農(nóng)作物的生長發(fā)育(Toppi & Gabbrielli, 1999；金楓等，2010)。水稻(Oryzasativa)作為我國重要的糧食作物，其生長發(fā)育受到土壤中Cd的嚴(yán)重危害(Zheng et al., 2021)。因此，如何改善重金屬對水稻生長發(fā)育的影響并解決籽粒中的重金屬積累問題，對未來培育耐Cd水稻品種以及保障糧食生產(chǎn)安全均具有重要意義。目前，水稻應(yīng)對重金屬脅迫的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究較為廣泛，相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等因?qū)姑{迫功能基因的表達(dá)起著重要調(diào)節(jié)作用，而一直成為研究熱點(diǎn)。多蛋白橋聯(lián)因子1(multi protein bridging factor 1, MBF1)是植物處于生物及非生物脅迫應(yīng)答過程中起重要作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子之一(Wang et al., 2017)。MBF1蛋白主要由N端“MBF1”結(jié)構(gòu)域和C端“α-螺旋-β-轉(zhuǎn)角-α-螺旋”結(jié)構(gòu)域組成，可通過橋聯(lián)轉(zhuǎn)錄激活因子和TBP(TATA-Binding Protein)調(diào)控多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑并激活多種防御因子，最終提高植物在逆境脅迫下的耐受性(Millership et al., 2004；Jaimes-Miranda & Chvez Montes, 2020)。擬南芥(Arabidopsisthaliana)、小麥(Triticumaestivum)、菊花(Chrysanthemummorifolium)中MBF1基因家族可參與調(diào)控植物應(yīng)對熱、氧化和干旱等脅迫反應(yīng)(Suzuki et al., 2005；Pamela et al., 2010； Zhao et al., 2019)。然而，MBF1是否參與植物應(yīng)對重金屬脅迫通路，以及是否可能緩解植物因重金屬而引起氧化損傷等的相關(guān)研究卻少見報道。此外，對MBF1的研究也僅僅局限于擬南芥、小麥等物種，在水稻中潛在的功能和作用機(jī)制的研究則較少，而水稻作為我國重要的糧食作物之一，研究其抗逆機(jī)理顯得尤為重要。

本研究對水稻中的MBF1基因家族進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并以水稻為材料，利用PCR方法克隆得到了OsMBF1c(LOC_Os06g39240)基因的全長編碼區(qū)(coding sequence, CDS)。在此基礎(chǔ)上，采用實(shí)時熒光定量PCR(RT-qPCR)方法對Cd處理下不同水稻組織中OsMBF1c的相對表達(dá)量進(jìn)行分析。旨在探究以下問題：(1)水稻MBF1蛋白家族親緣進(jìn)化關(guān)系、理化性質(zhì)以及結(jié)構(gòu)特征；(2)水稻MBF1基因家族成員在Cd脅迫下的表達(dá)變化情況；(3)水稻MBF1在緩解Cd危害過程中的潛在功能。本研究結(jié)果將為耐鎘水稻品種的培育提供潛在的基因資源，同時為進(jìn)一步解析該基因在水稻中應(yīng)對重金屬脅迫的調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻種子于4 ℃保存。選健康種子放入適量無菌水中，30 ℃催芽48 h。將發(fā)芽種子置于1/2 MS液體培養(yǎng)基中，30 ℃溫室進(jìn)行光照16 h/黑暗8 h交替培養(yǎng)，5 d后選取同一生長階段的幼苗進(jìn)行CdCl2(100 μmol·L-1)脅迫處理，經(jīng)時間梯度(1、6、12 h)處理后采集地上部分和根部，并將其立即用液氮進(jìn)行速凍，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 OsMBF1c基因克隆

1.2.1 總RNA提取和cDNA第一鏈合成 將CdCl2處理的水稻組織參照Aidlab公司的EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒的說明書進(jìn)行總RNA的提取。提取成功后，取1 000 ng RNA，參照ThermoFisher公司Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

1.2.2OsMBF1c基因的克隆和測序 根據(jù)水稻OsMBF1c基因的CDS序列設(shè)計(jì)引物OsMBF1c-F/OsMBF1c-R(表1)。以水稻cDNA為模板，使用擎科生物科技有限公司的金牌Mix酶對OsMBF1c基因的CDS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收后，利用Vazyme公司的ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit試劑盒連入pGADT7載體，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α菌株。挑取陽性克隆培養(yǎng)后，使用天根生化科技公司的質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒并進(jìn)行酶切驗(yàn)證，送往擎科生物科技有限公司(成都)進(jìn)行測序。

表 1 基因克隆和表達(dá)檢測引物Table 1 Primers used for gene cloning and expression analysis

1.3 生物信息學(xué)分析

從EnsemblPlants數(shù)據(jù)庫(http://plants.ensembl.org/info/data/ftp/index.html)獲得水稻、大麥(Hordeumvulgare)、二粒小麥(Triticumdicocoides)、高粱(Sorghumbicolor)、玉米(Zeamays)的整個基因組以及gff3注釋文件，使用TBtools軟件將整個基因組序列翻譯為蛋白序列。利用OsMBF1c的氨基酸序列在Pfam(http://pfam.xfam.org/)網(wǎng)站中對其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，目的基因編碼蛋白中含有與非生物脅迫相關(guān)的MBF1結(jié)構(gòu)域，先通過Pfam網(wǎng)站得到其HMM結(jié)構(gòu)模型，再通過TBtools軟件的Simple HMM Search功能對水稻、二粒小麥、大麥、高粱和玉米的蛋白序列進(jìn)行分析，篩選確定所選物種中的MBF1基因家族成員。

利用在線ProtParam工具(https://web.expasy.org/protscale/)對OsMBF1c的基本理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測和分析；利用SCOPMA工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；利用水稻OsMBF1c基因編號在Rice Genome Annotation Project網(wǎng)站 (http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml)獲得啟動子序列；通過The PlantCARE網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析啟動子順式作用元件，采用TBtools軟件制圖。

利用在線Multalin軟件(http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/)對其編碼的氨基酸序列進(jìn)行比對；利用MEGA 7.0軟件中Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；通過The MEME Suite網(wǎng)站(https://meme-suite.org/meme/index.html)對其同源蛋白進(jìn)行motif分析，利用TBtools中的Visualize Motif Pattern功能對多序列的motif元件進(jìn)行分析與美化。用STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/cgi/input.pl)，對水稻OsMBF1c蛋白的相互作用進(jìn)行預(yù)測。

1.4 OsMBF1c基因表達(dá)分析

以稀釋20倍的Cd處理水稻的cDNA為模板。采用德國耶拿分析儀器股份公司(Analytikjena)qTOWER3G 實(shí)時熒光定量基因擴(kuò)增儀檢測OsMBF1c、OsMBF1a基因的表達(dá)量。反應(yīng)試劑采用Aidlab的2 × Sybr Green qPCR Mix。擴(kuò)增體系為cDNA 3 μL、SYBR Green 5 μL、引物(2.5 μmol·L-1)各1 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性2 min； 95 ℃變性15 s， 55 ℃復(fù)性15 s， 72 ℃延伸20 s， 72 ℃后延伸3 min，40個循環(huán)。以水稻Ubiquitin作為內(nèi)參基因。每個樣品均設(shè)置3次重復(fù)，以2-ΔΔCt方法分析定量數(shù)據(jù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用Graphpad軟件對不同處理Cd濃度、不同處理時間、不同組織的數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻OsMBF1c基因結(jié)構(gòu)分析及CDS全長克隆

利用Rice Genome Annotation Project(http://rice.plantbiology.msu.edu/)查詢得知，基因OsMBF1c位于水稻全基因組的第六號染色體上，OsMBF1c基因CDS長度為468 bp(圖1：A)?；谒綾DNA文庫，使用OsMBF1c-F/OsMBF1c-R引物擴(kuò)增OsMBF1c基因CDS片段, 獲得大小約為468 bp的目的基因，其共編碼155個氨基酸。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測獲得的PCR產(chǎn)物，條帶大小(圖1：B)與基因組數(shù)據(jù)庫結(jié)果一致。

A. OsMBF1c 基因結(jié)構(gòu)分析; B. OsMBF1c CDS擴(kuò)增產(chǎn)物; M. DL2 000 標(biāo)記; L. OsMBF1c基因CDS擴(kuò)增產(chǎn)物。A. Structure analysis of OsMBF1c gene; B. OsMBF1c CDS amplification product; M. DL2 000 Marker; L. CDS amplification product of OsMBF1c gene.圖 1 OsMBF1c基因結(jié)構(gòu)分析及CDS全長擴(kuò)增產(chǎn)物Fig. 1 Gene structure analysis of OsMBF1c and amplification product of OsMBF1c CDS

2.2 水稻OsMBF1c基因的生物信息學(xué)分析

使用ProtParam工具預(yù)測分析OsMBF1c蛋白的基本理化性質(zhì)。結(jié)果顯示，OsMBF1c蛋白含有155個氨基酸，分子式為C698H1184N224O209S3，分子量為16.154 kDa，理論等電點(diǎn)(PI)為10.67，表明此蛋白質(zhì)呈堿性；蛋白質(zhì)不穩(wěn)定性指數(shù)37.59，表現(xiàn)為穩(wěn)定蛋白；進(jìn)一步在Expasy網(wǎng)站上利用ProtScale軟件對OsMBF1c蛋白親/疏水性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，OsMBF1c蛋白多肽鏈的第24位分值最低，為-2.111；第126位分值最高，為1.856，同時OsMBF1c親水區(qū)域大于疏水區(qū)域，屬于親水性蛋白(圖2：A)；二級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)(圖2：B)，在OsMBF1c氨基酸組成中，以無規(guī)則卷曲為主，占46.45%，其次為α-螺旋，占45.16%，β轉(zhuǎn)角占比最少，為4.52%。

A. 疏水性區(qū)域預(yù)測; B. 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。藍(lán)色. α-螺旋; 紅色. 延伸鏈; 綠色. β-轉(zhuǎn)角; 紫色. 無規(guī)則卷曲。A. Hydrophobic region prediction; B. Secondary structure prediction. Blue. α-helix; Red. Extended chain; Green. β- corner; Purple. Random coil.圖 2 OsMBF1c蛋白的生物信息學(xué)分析Fig. 2 Bioinformatics analysis of OsMBF1c protein

2.3 水稻OsMBF1c基因啟動子順式作用元件分析

通過TBtools對OsMBF1c順式作用元件進(jìn)行可視化分析，結(jié)果如圖3所示。OsMBF1c的啟動子序列中含有參與調(diào)節(jié)厭氧感應(yīng)的順式作用元件ARE、GC-motif、光響應(yīng)元件G-box、乙烯響應(yīng)元件ERE等。這些順式作用元件可能在水稻應(yīng)對不同非生物脅迫響應(yīng)機(jī)制中對啟動子的調(diào)控發(fā)揮重要作用，其啟動子中基序的存在說明該基因有可能參與不同類型非生物脅迫的應(yīng)對機(jī)制。

圖 3 OsMBF1c蛋白的順式作用元件分析Fig. 3 Cis-acting element analysis of OsMBF1c protein

2.4 水稻OsMBF1c多重序列比對和同源性分析

將OsMBF1c氨基酸序列與水稻、大麥、小麥、高粱和玉米等5種禾本科常見物種中同源基因的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析 (圖4)。結(jié)果顯示OsMBF1c與這些植物的MBF1氨基酸序列同源性介于41.29%～98.59%之間。其中，水稻OsMBF1c與二粒小麥TdMBF1a.1的同源性最高，而與玉米ZmEDRF 1.1的同源性最低。為進(jìn)一步了解OsMBF1c與其他植物的MBF1蛋白之間的進(jìn)化關(guān)系，利用 MEGA 7.0的Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示OsMBF1c與二粒小麥TdMBF1c.1、TdMBF1c.2、大麥HvMBF1.1的親緣關(guān)系最近，該結(jié)果與基因同源性比對結(jié)果相一致。

2.5 MBF1同源蛋白保守基序分析

利用MEME對17條不同物種中MBF1蛋白進(jìn)行了保守基序分析(圖6)，共鑒定獲得10個保守基序(motif)。除ZmMBF1a外，其他同源蛋白的motif分布相對均勻，其分布數(shù)量與位置也基本相同，且在MBF1的同源蛋白中均存在motif 1與motif 2，這說明此蛋白質(zhì)在進(jìn)化過程中具有高度保守性，進(jìn)而推斷OsMBF1c可能與其他物種中的MBF1具有相同的功能特性。

2.6 水稻MBF1基因家族表達(dá)特性分析

分析了OsMBF1a、OsMBF1c在水稻進(jìn)行100 μmol·L-1Cd處理下的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在100 μmol·L-1Cd 處理下，地上部分OsMBF1a、OsMBF1c基因的表達(dá)水平均表現(xiàn)為上調(diào)，其中OsMBF1c在1 h達(dá)最高點(diǎn)，約為對照組(0 h)的7倍；隨后呈下降趨勢，處理6 h的基因相對表達(dá)量約為對照組的5.5倍，處理12 h的基因相對表達(dá)量變?yōu)閷φ战M的3.5倍(圖7：A)；OsMBF1a基因表達(dá)量在6 h達(dá)最高點(diǎn)，約為對照組(0 h)的4.2倍，而在12 h時基因表達(dá)量呈下降趨勢，約為對照組(0 h)的0.2倍(圖 7：B)；根部OsMBF1a、OsMBF1c基因的相對表達(dá)量較地上部分變化幅度較小，而與對照相比，個別處理時間呈顯著性差異。結(jié)果還顯示，100 μmol·L-1Cd 處理下，根部OsMBF1c基因在6 h達(dá)最高點(diǎn)，約為對照(0 h)的3倍(圖8：A)，根部OsMBF1a基因在12 h達(dá)最高點(diǎn)，約為對照(0 h)的4.4倍(圖 8：B)。

A. 水稻OsMBF1c基因的表達(dá)分析； B. 水稻OsMBF1a基因的表達(dá)分析； **. 與對照差異顯著(P<0.01); ***. 與對照差異極顯著(P<0.001)。下同。A． OsMBF1c gene expression analysis of rice； B. OsMBF1a gene expression analysis of rice; **. Significant difference compared with control (P<0.01); ***. Extremely significant difference compared with control (P<0.001). The same below.圖 7 100 μmol·L-1 Cd脅迫水稻地上部分中OsMBF1c、OsMBF1a基因的相對表達(dá)量變化Fig. 7 Relative gene expression changes of OsMBF1c and OsMBF1a from the shoot of rice treated under 100 μmol·L-1 Cd stress

A. 水稻OsMBF1c基因的表達(dá)分析。B. 水稻OsMBF1a基因的表達(dá)分析。A. OsMBF1c gene expression analysis of rice; B. OsMBF1a gene expression analysis of rice.圖 8 100 μmol·L-1 Cd脅迫水稻根部中OsMBF1c、OsMBF1a基因的相對表達(dá)量變化Fig. 8 Relative gene expression changes of OsMBF1c and OsMBF1a from the root of rice treated under 100 μmol·L-1 Cd stress

2.7 OsMBF1c蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

利用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了水稻OsMBF1c蛋白的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(圖9)。結(jié)果顯示，OsMBF1c蛋白與OsRRM、HSFA6A和HSFA6B具有較強(qiáng)的相關(guān)性，其中HSFA6A、HSFA6B在植物應(yīng)對高溫、干旱和重金屬等多種非生物脅迫過程中起著重要作用。通過預(yù)測與OsMBF1c蛋白互作的靶蛋白，將更加有助于深入探究水稻OsMBF1c蛋白的功能和調(diào)控機(jī)理。

圖 9 水稻中OsMBF1c蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig. 9 Protein interaction network of OsMBF1c in rice

3 討論與結(jié)論

水稻在生長發(fā)育過程中可能會受到鹽、低溫、干旱、重金屬等各種逆境脅迫，其中重金屬所產(chǎn)生的危害嚴(yán)重制約著水稻產(chǎn)量和品質(zhì)。水稻在長期進(jìn)化過程中，逐漸形成了一套復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制，以應(yīng)對重金屬逆境脅迫(董蔚等，2018)。MBF1蛋白作為轉(zhuǎn)錄共激活因子，參與植物中各種發(fā)育過程和非生物脅迫反應(yīng)(Jaimes-Miranda & Chvez Montes, 2020)。植物中MBF1研究較多的是模式植物擬南芥，在擬南芥中具有3個MBF1基因，即AtMBF1a、AtMBF1b和AtMBF1c，其中AtMBF1a、AtMBF1c可增強(qiáng)擬南芥對熱、滲透和鹽等非生物脅迫的耐受性(Suzuki et al., 2005；Kim et al., 2007)。Zhang等(2019)研究表明，水稻中存在2個MBF1家族基因，即OsMBF1a、OsMBF1c，這與該文利用生物信息技術(shù)篩選出的結(jié)果一致，而對該家族基因在重金屬脅迫下的功能研究卻較少。OsMBF1c的基因結(jié)構(gòu)中含有1個外顯子，與擬南芥AtMBF1c相同。而OsMBF1c的同源基因OsMBF1a包含4個外顯子，也與擬南芥AtMBF1a、AtMBF1b的外顯子數(shù)相同(Tsuda & Yamazaki, 2004)。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明MBF1在不同植物物種間進(jìn)化具有保守性，但在同一物種內(nèi)的MBF1a/b與MBF1c卻有較大差異。該現(xiàn)象表明植物在進(jìn)化壓力的選擇下，就MBF1基因家族整體而言保持了較強(qiáng)的保守性，但該家族成員之間這種保守的差異卻暗示著MBF1c可能與MBF1a/b分別具有不同的生物學(xué)功能。此外，對水稻OsMBF1c基因啟動子順式作用元件分析表明，該基因啟動子中包括激素、低溫等逆境應(yīng)激元件，由此可推測水稻在重金屬脅迫下，該基因可能發(fā)揮防御和應(yīng)激作用。此外，系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，OsMBF1a、OsMBF1c分別與大麥HvMBF1.2、HvMBF1.1親緣關(guān)系較近。目前，雖無HvMBF1.1、HvMBF1.2基因功能的相關(guān)報道，但在Lai等(2020) 研究發(fā)現(xiàn)，大麥中的MBF1可能受脫落酸影響，并激活參與降低ROS含量的基因。由于重金屬脅迫可使植物產(chǎn)生ROS，因此水稻MBF1蛋白是否與大麥MBF1蛋白家族具有相似功能，通過降低水稻ROS含量來提高水稻重金屬耐受性仍需進(jìn)一步探究。

前人在研究擬南芥、大麥草(Hordeumbrevisubulatum)等植物中MBF1應(yīng)對非生物脅迫中的作用時發(fā)現(xiàn)，MBF1基因的表達(dá)模式與其功能有明顯的相關(guān)性。例如，Zhang等(2020) 研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)350 mmol·L-1NaCl處理6 h后的大麥草中HbMBF1a基因相對表達(dá)量有明顯上調(diào)，經(jīng)過表達(dá)HbMBF1a基因的擬南芥也同時呈現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽性。本研究發(fā)現(xiàn)，Cd脅迫可以顯著誘導(dǎo)水稻各器官中OsMBF1c、OsMBF1a基因的上調(diào)表達(dá)，并在水稻根部和地上部分中對脅迫的響應(yīng)模式不同，該結(jié)果與Zhang等(2020)對鹽脅迫下HbMBF1a表達(dá)情況相類似。同時，通過對比地上和地下部分的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)，在不同Cd處理時間表達(dá)情況呈細(xì)微差異，在地上部分組織中，OsMBF1c普遍呈上調(diào)趨勢，而OsMBF1a在Cd脅迫處理12 h后表達(dá)量卻顯著降低；在根部，OsMBF1c在6 h表達(dá)達(dá)到最高、而OsMBF1a在12 h達(dá)到最高，推測OsMBF1c可能參與水稻早期地上組織應(yīng)對重金屬脅迫的調(diào)控機(jī)制，而OsMBF1a更多地參與水稻后期根部Cd解毒機(jī)制。

目前，尚未有研究證明MBF1蛋白通過何種分子機(jī)制對非生物脅迫做出反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)。但是，可以推測的是MBF1作為轉(zhuǎn)錄輔因子，當(dāng)細(xì)胞從非應(yīng)激狀態(tài)到應(yīng)激狀態(tài)，較為靈活的N端結(jié)構(gòu)域可與不同的脅迫應(yīng)答基因結(jié)合，從而一起參與調(diào)控植物的應(yīng)激反應(yīng)(Millership et al., 2004)。本研究蛋白互作預(yù)測顯示，OsMBF1c蛋白與OsRRM、HSFA6A和HSFA6B等蛋白的相關(guān)性較強(qiáng)，這些蛋白在植物干旱、熱激和鹽等脅迫方面有著重要意義(Norbert et al., 2021)。在水稻中，OsMBF1c是否可與這些蛋白共同調(diào)控重金屬應(yīng)激反應(yīng)以及通過何種分子機(jī)制對重金屬應(yīng)激做出反應(yīng)等問題仍需進(jìn)一步探究。