宦智群， 徐小蓉， 耿興敏*， 唐 明

(1. 南京林業(yè)大學(xué) 風(fēng)景園林學(xué)院， 南京 210037； 2. 貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 貴陽(yáng)550001 )

木蘭科(Magnoliaceae)植物作為多心皮類植物的典型代表，是探索被子植物起源與發(fā)展演化的關(guān)鍵材料，科學(xué)研究?jī)r(jià)值極高；該科植物大多為春季觀花木本，樹(shù)形優(yōu)美，葉、果、花均具較高的園林觀賞價(jià)值(楊成華等，2017)，常應(yīng)用于工礦、居住區(qū)、道路、庭院綠化和公園綠地等方面(宋懷芬和劉會(huì)萍，2014)；它們可以作為工業(yè)用材、藥材和香料樹(shù)種(孔焱焱，2018)，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。由于對(duì)木蘭科分類系統(tǒng)和親緣關(guān)系的認(rèn)知分歧，其類群概念至今尚未統(tǒng)一，分類系統(tǒng)眾多，目前國(guó)內(nèi)普遍被大家接受且應(yīng)用最多的是劉玉壺(1997)系統(tǒng)，因此本文也采用該分類系統(tǒng)。據(jù)不同分類系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)，世界木蘭科種類數(shù)目為240～300種；《中國(guó)植物志》 (2004) 中記載中國(guó)有木蘭科植物11屬107種，《中國(guó)木蘭》 (2004) 記載11屬178種，F(xiàn)loraofChina(2008)記載12屬112種。我國(guó)木蘭科的物種豐富度中心在云南、貴州、廣西、湖南、廣東等地，物種豐度由東南、西南地區(qū)向北、東北和西北逐漸減少。

雖然我國(guó)的木蘭科植物種類豐富，但野生資源匱乏與繁殖困難，嚴(yán)重限制了木蘭科植物的推廣栽培，導(dǎo)致其在園林中應(yīng)用的種類十分有限(譚秀梅等，2018)。木蘭科中許多植物自然結(jié)實(shí)率低(向光鋒等，2019)，并且人類活動(dòng)破壞了原有生境，野生資源保存情況不容樂(lè)觀。據(jù)《中國(guó)植物紅皮書(shū)》(1991)記載，木蘭科中被列為國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)的珍稀瀕危植物有39種之多，是被子植物中受到嚴(yán)重威脅種類最多的科；據(jù)《中國(guó)生物多樣性紅色名錄·高等植物卷》(2013)記載，木蘭科植物中存在易危(VU)40種、瀕危(EN)27種、極危(CR)9種、近危(NT)6種、地區(qū)滅絕(RE)1種。木蘭科植物的有性繁殖存在發(fā)芽率低、種源欠缺的問(wèn)題，常規(guī)無(wú)性繁殖中嫁接繁殖不適合工廠化育苗，扦插繁殖生根困難(王歡等，2013；張果等，2016)。

組織培養(yǎng)技術(shù)是木蘭科植物資源保育及開(kāi)發(fā)的有效途徑，可通過(guò)組織器官離體保存保育植物種質(zhì)資源，也可通過(guò)工廠化育苗為園林綠化提供大量苗木以減少對(duì)野生資源的需求。雖然我國(guó)木蘭科植物的部分樹(shù)種在建立優(yōu)良再生體系方面取得了一定的進(jìn)展，但研究種類有限，鮮有應(yīng)用于工廠化生產(chǎn)實(shí)踐，并且組培過(guò)程中存在褐化、生根困難、愈傷組織再分化困難等技術(shù)問(wèn)題。本文對(duì)木蘭科植物不同再生途徑的相關(guān)研究進(jìn)行了論述，總結(jié)組培過(guò)程中普遍存在的褐化、生根困難等技術(shù)難題與解決措施，以期為木蘭科植物高效的再生體系建立提供理論基礎(chǔ)。

1 無(wú)菌短枝扦插途徑

木本植物組織培養(yǎng)有無(wú)菌短枝扦插、器官發(fā)生、體細(xì)胞胚發(fā)生等再生途徑。國(guó)內(nèi)木蘭科植物的組織培養(yǎng)中無(wú)菌短枝扦插途徑研究較多。雖然木蘭屬(Magnolia)和含笑屬(Michelia)的部分種類已經(jīng)建立了完整的再生體系，但種類有限，增殖系數(shù)低、褐化及生根困難等技術(shù)難題仍未得到解決；其他如木蓮屬(Manglietia)、擬單性木蘭屬(Parakmeria)等僅見(jiàn)個(gè)別種有研究，且大多處于初步探索階段。

1.1 無(wú)菌體系的建立

外植體的選擇、取材時(shí)間、處理方式、消毒方式是影響無(wú)菌體系建立的幾個(gè)關(guān)鍵因素。

木蘭科植物的無(wú)菌短枝扦插一般選取莖尖、帶腋芽的幼嫩莖段、頂芽或側(cè)芽作為外植體(表1)。由于新生組織內(nèi)含有的病菌以及酚類物質(zhì)比在自然環(huán)境生長(zhǎng)時(shí)間較長(zhǎng)的植物材料少，因此選取靠近枝條頂端的芽和莖段，這些部位污染率和褐化率相對(duì)低，存活率相對(duì)高(Maria, 2012；唐軍榮等，2014)。

表 1 木蘭科植物組織培養(yǎng)中無(wú)菌短枝扦插途徑Table 1 In vitro shoot propagation in tissue culture of Magnoliaceae plants

續(xù)表1

外植體的取材時(shí)間極大程度地影響著組培苗的污染率、褐化率與啟動(dòng)率，需綜合考慮三者來(lái)確定取材時(shí)期。一般來(lái)說(shuō)，木蘭科植物夏季(7—8月)取材的外植體褐化嚴(yán)重(黃樹(shù)軍等，2013)，休眠期(12月至翌年1月)取材的外植體污染率、褐化率相對(duì)較低(都婷等，2013；Maria, 2012)，而春季蕾期階段(5月)采集的初代外植體形態(tài)發(fā)生能力強(qiáng)，啟動(dòng)率較高(Konopkova et al., 2020)。

外植體處理方式不同會(huì)影響啟動(dòng)培養(yǎng)的結(jié)果。由于托葉會(huì)阻礙嫩芽的營(yíng)養(yǎng)吸收，外層鱗片影響滅菌效果，因此消毒前去除外層鱗片，消毒后去除托葉的頂芽外植體的啟動(dòng)速度、啟動(dòng)率、頂芽長(zhǎng)勢(shì)均好于對(duì)照(唐軍榮等，2014)。此外，寧陽(yáng)等(2015)研究表明切掉葉柄的莖段外植體較之葉柄已自然掉落的莖段，腋芽萌發(fā)受到抑制且更易褐化。

芽、莖段外植體的消毒均以0.1% HgCl2為佳，滅菌時(shí)間要根據(jù)外植體的采集時(shí)間、幼嫩程度來(lái)確定，休眠期取材的外植體消毒時(shí)間應(yīng)高于生長(zhǎng)期取材的，幼嫩的外植體消毒時(shí)間應(yīng)低于成熟的(都婷等，2013)。對(duì)于滅菌困難的種類，污染嚴(yán)重的可以鑒定其相關(guān)內(nèi)生細(xì)菌，篩選適宜種類和濃度的抑菌劑添加至培養(yǎng)基中。

1.2 啟動(dòng)培養(yǎng)

基礎(chǔ)培養(yǎng)基、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是影響啟動(dòng)培養(yǎng)的關(guān)鍵因素。從表1可以看出，MS培養(yǎng)基是木蘭科植物芽和莖段啟動(dòng)培養(yǎng)的常用基礎(chǔ)培養(yǎng)基。6-BA的用量對(duì)芽的誘導(dǎo)及生長(zhǎng)的影響極大，外植體的啟動(dòng)速度往往隨6-BA濃度的增加而增加(都婷等，2013)，最佳6-BA濃度取決于培養(yǎng)基中蔗糖與氮鹽的比例，6-BA、蔗糖和氮鹽水平不適合會(huì)導(dǎo)致褐化(Wojtania et al., 2015)。6-BA的適宜濃度一般為0.5～2 mg·L-1，并與少量的NAA(0.05～0.2 mg·L-1)、IBA(0.05～0.2 mg·L-1)等生長(zhǎng)素配合使用(表1)。啟動(dòng)培養(yǎng)中，一些種類可能存在腋芽活性較低的現(xiàn)象，僅添加6-BA不足以使芽生長(zhǎng)，此時(shí)需要加入適量的赤霉素(GA3)(0.1～2 mg·L-1)來(lái)打破休眠，并刺激芽的生長(zhǎng)(Wojtania et al., 2019；Cui et al., 2019)，其作用效果依賴于MS培養(yǎng)基中的蔗糖與氮鹽的比例(Wojtania et al., 2015)。

1.3 增殖培養(yǎng)

基礎(chǔ)培養(yǎng)基、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑同樣是影響增殖培養(yǎng)的關(guān)鍵因素。MS培養(yǎng)基是最廣泛用于木蘭科植物增殖培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基(表1)。但是，不同木蘭種和品種的增殖階段對(duì)基本培養(yǎng)基組成的要求是基因特異性的(Konopkova et al., 2020)。Sokolov等(2014)研究表明常用于葡萄離體繁殖的VM培養(yǎng)基與常用于核桃、白蠟、榆樹(shù)等離體繁殖的DKW培養(yǎng)基能提高一些種類的增殖速率和芽的整體質(zhì)量，與MS具有相似的作用，在木蘭科植物的增殖階段具有應(yīng)用前景。

目前，最適合木蘭科植物增殖培養(yǎng)的細(xì)胞分裂素是6-BA，對(duì)多種木蘭及栽培品種腋芽增殖效果顯著(Parris et al., 2012； Sokolov et al., 2014)，其最佳濃度因基因型的不同而不同，范圍為0.25～5 mg·L-1(Wojtania et al., 2015)。但是，6-BA會(huì)導(dǎo)致某些木蘭組培材料玻璃化，降低芽的質(zhì)量，并抑制生根。MT(meta-Topolin)是一種與6-BA結(jié)構(gòu)相似的細(xì)胞分裂素，可以減少木蘭品種‘Ann’玻璃化苗的產(chǎn)生(Parris et al., 2012)。此外，苯基脲類細(xì)胞分裂素CPPU是6-BA生物活性的10～100倍且價(jià)格低廉，在其他植物的組培中被廣泛用于促進(jìn)側(cè)芽分化與植株生長(zhǎng)(孫曉波等，2020)，在木蘭科植物中尚未見(jiàn)應(yīng)用，可考慮與MT、低劑量的納米碳(馮璐等，2017)等作為6-BA的替代品，應(yīng)用于木蘭科植物的增殖培養(yǎng)。增殖培養(yǎng)期間，組培苗易褐化，需要注意的是在后期應(yīng)適當(dāng)降低6-BA的濃度(Konopkova et al., 2020)且及時(shí)轉(zhuǎn)瓶(周麗華等，2002)。

木蘭科植物外植體的增殖能力具有基因型特異性(Sokolov et al., 2014)，不同基因型的木蘭科植物的增殖分化難易程度不一，在同樣的培養(yǎng)基與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑條件下，二喬玉蘭(Mognolia×sallangiana)的增殖率明顯高于白玉蘭(M.denudata)和紫玉蘭(M.liliflora)(李艷等，2005)，而星花木蘭(M.stellata)腋芽的增殖率高于二喬木蘭(Maria, 2012)。

1.4 生根培養(yǎng)

在木蘭科植物的生根培養(yǎng)過(guò)程中，常通過(guò)降低無(wú)機(jī)鹽濃度和調(diào)整基本培養(yǎng)基組成來(lái)促進(jìn)生根，無(wú)機(jī)鹽含量只需為增殖培養(yǎng)時(shí)的一半，即可滿足生根培養(yǎng)所需養(yǎng)分(鄧演文等，2018)。1/2MS 培養(yǎng)基是目前大多數(shù)木蘭科植物選擇的生根培養(yǎng)基。外植體的生根潛力可能受基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成的影響較小(Sokolov et al., 2014)，白玉蘭在 1/2MS 培養(yǎng)基以及 1/4MS 培養(yǎng)基中都能生根，兩者的生根率和生根數(shù)差別不大(孟雪，2005)。

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑在根原基形成與生長(zhǎng)中起關(guān)鍵作用，多數(shù)木蘭科植物需添加生長(zhǎng)素才會(huì)有較高的生根率，IBA是最常用于木蘭科植物生根培養(yǎng)的生長(zhǎng)素(表1)，不同濃度的IBA能夠調(diào)節(jié)產(chǎn)生根系數(shù)量與長(zhǎng)度(Kamenicka et al., 2000)。木蘭離體生根明顯依賴于IBA和蔗糖水平，且這兩種水平在不同基因型之間是不同的，玉蘭品種‘Elizabeth’‘Burgundy’‘Spectrum’在含有6 mg·L-1IBA和30 g·L-1蔗糖的1/2MS培養(yǎng)基上生根效果最好(Wojtania et al., 2019)。對(duì)于生根困難的種類，則通過(guò)改善生根培養(yǎng)的條件和改變生根的方式等技術(shù)措施來(lái)促進(jìn)生根(具體方法于文章5.2部分詳述)。

1.5 培養(yǎng)條件

光照、溫度和pH值等培養(yǎng)條件是影響木蘭科植物形態(tài)發(fā)生的重要因素，在木蘭科組織培養(yǎng)中所選擇的蔗糖濃度、pH、培養(yǎng)溫度、光照強(qiáng)度和光照時(shí)間相差不大，分別是蔗糖 20～40 g·L-1、pH 5.6 ～ 6.7(木蘭科植物偏好堿性土壤)、培養(yǎng)溫度 23～28 ℃、光照強(qiáng)度 1 000～3 000 lx、光照時(shí)間10～16 h·d-1。

相關(guān)培養(yǎng)條件在不同培養(yǎng)階段與不同基因型的植物中有所差異，有時(shí)需要具體探討。例如，蔗糖是木本植物組織培養(yǎng)中最常用的碳源(Wojtania et al., 2019)，而Kamenicka等(1998)發(fā)現(xiàn)果糖、甘露糖和木糖是二喬玉蘭芽增殖最有效的碳源，其次是蔗糖。培養(yǎng)基中常用的鐵源是硫酸亞鐵(FeSO4)，而Sokolov等(2015)研究表明螯合鐵NaFeEDTA和Fe(III)AC比非螯合鐵FeSO4·7H2O更合適作為廣玉蘭(M.grandiflora)和二喬玉蘭增殖和生根培養(yǎng)基中的鐵源。不同光質(zhì)可能通過(guò)影響相應(yīng)光受體的活性進(jìn)而影響激素水平, 從而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育。由于紅光可以促進(jìn)地上部分生長(zhǎng)，藍(lán)光、遠(yuǎn)紅光則可以促進(jìn)地下部分生長(zhǎng)(任桂萍等，2016)，因此可以考慮在啟動(dòng)和增殖階段使用紅光，在生根階段使用藍(lán)光和遠(yuǎn)紅光來(lái)促進(jìn)組培苗的生長(zhǎng)。

2 器官發(fā)生途徑

木蘭科植物器官發(fā)生途徑的研究目前仍只限于木蘭屬和含笑屬的少量種類，愈傷組織誘導(dǎo)困難及其不定芽分化困難的問(wèn)題仍沒(méi)有得到有效解決。木蘭科植物的器官發(fā)生途徑除個(gè)別通過(guò)葉片直接分化得到不定芽外(李艷等，2005)，大多通過(guò)間接器官再生途徑，先由外植體形成愈傷組織，再由愈傷組織分化為不定芽。

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)

木蘭科植物可以通過(guò)營(yíng)養(yǎng)器官(頂芽、莖段、葉片、葉柄)和繁殖器官(花托、花瓣、花藥)等誘導(dǎo)出愈傷組織(表2)。外植體來(lái)源不同，愈傷組織的誘導(dǎo)率也會(huì)不同。一般來(lái)說(shuō)，頂芽和莖段較易誘導(dǎo)出愈傷組織，且愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)較好。厚樸(M.officinalissubsp.officinalis)不同取材部位的愈傷組織誘導(dǎo)率為莖段>頂芽>葉片(謝燕燕等，2017)；凹葉厚樸(M.officinalissubsp.biloba)外植體脫分化形成愈傷組織的能力大小為頂芽及莖段>雌蕊>花被>雄蕊>托葉>葉柄(劉葉蔓等，2008)。

表 2 木蘭科植物組織培養(yǎng)中器官發(fā)生途徑Table 2 Organogenesis in tissue culture of Magnoliaceae plants

適宜的基本培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織分化起著關(guān)鍵作用。MS培養(yǎng)基和B5培養(yǎng)基最常用于木蘭科植物的愈傷組織誘導(dǎo)(表2)。實(shí)驗(yàn)證明，MS培養(yǎng)基適合大多數(shù)木蘭科植物的多種外植體的愈傷組織誘導(dǎo)。但是，對(duì)于個(gè)別種類，如厚樸、凹葉厚樸的芽、莖段，以及黃蘭含笑(Micheliachampaca)的葉柄等外植體，MS培養(yǎng)基中NH4+濃度較高，可能會(huì)對(duì)愈傷組織造成毒害，不利于其分化生長(zhǎng)，B5培養(yǎng)基更加適合其愈傷組織誘導(dǎo)(黃樹(shù)軍等，2013；Shukla, 2014；謝燕燕等，2017)。

不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)率存在明顯差異，并且誘導(dǎo)出愈傷組織的形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)和色澤等隨生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類及其配比的不同而不同(何培琦等，2010)。2,4-D(1～5 mg·L-1)和6-BA(1～5 mg·L-1)是木蘭科植物愈傷組織誘導(dǎo)中常用的細(xì)胞分裂素(表2)。適宜濃度的2,4-D或6-BA誘導(dǎo)愈傷組織所需時(shí)間短且愈傷組織生長(zhǎng)良好(黃樹(shù)軍等，2013；Shukla，2014)。6-BA與2,4-D或KT同時(shí)使用能提高誘導(dǎo)率和愈傷組織的質(zhì)量。羅在柒等(2010)對(duì)紫玉蘭的不同外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，從誘導(dǎo)率和增殖系數(shù)來(lái)看，2,4-D 4 mg·L-1+6-BA 1 mg·L-1的組合下誘導(dǎo)效果比較理想；而墨西哥大葉木蘭(Magnoliadealbata)葉片外植體在MS+2,4-D 1.5 mg·L-1+KT 1.5 mg·L-1的培養(yǎng)基上，獲得綠色、致密的愈傷組織(Domínguez et al., 2010)。

在培養(yǎng)條件的選擇中，暗培養(yǎng)比光培養(yǎng)更有利于一些木蘭科植物的愈傷組織的形成和生長(zhǎng)。暗培養(yǎng)下的日本厚樸(M.obovata)頂芽外植體比光培養(yǎng)先誘導(dǎo)出愈傷組織，且在相同時(shí)間內(nèi)，愈傷組織鮮重增長(zhǎng)量大于光培養(yǎng)(付曉云等，2009)。黑暗環(huán)境中厚樸頂芽外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率比光照條件下高且產(chǎn)生的愈傷組織形態(tài)結(jié)構(gòu)較好，可能是光照有利于多酚類物質(zhì)的積累，多酚類物質(zhì)和酚氧化酶產(chǎn)生的化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生有害的醌類物質(zhì)，從而導(dǎo)致外植體死亡(何培琦等，2010)。

2.2 愈傷組織的再分化

木蘭科植物的愈傷組織再分化較困難(表2)，很多外植體誘導(dǎo)出的愈傷組織質(zhì)地松軟或褐化嚴(yán)重，最終未能分化成芽。木蘭科植物愈傷組織能否分化出芽器官，與所用的基本培養(yǎng)基有關(guān)。吳月燕和袁東明(2001)比較了MS、MS’、1/2MS、GS培養(yǎng)基對(duì)樂(lè)昌含笑(Micheliachapensis)葉片愈傷組織再分化的影響，結(jié)果表明MS’培養(yǎng)基是愈傷組織再分化的最佳培養(yǎng)基。

愈傷組織的再分化受細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的濃度與配比影響。GA3是促使愈傷組織分化為芽的有效途徑，常與分裂素6-BA、2,4-D、KT等配合使用。在MS+6-BA 0.6 mg·L-1+GA30.5 mg·L-1培養(yǎng)基上，天女木蘭(Magnoliasieboldii)嫩莖愈傷組織成功分化成芽(孫銘鴻等，2012)；在MS’+6-BA 1mg·L-1+ GA32 mg·L-1培養(yǎng)基上，樂(lè)昌含笑葉片愈傷組織再分化成芽的比率最高(吳月燕和袁東明，2001)。

未來(lái)對(duì)于木蘭科植物愈傷組織再分化困難的問(wèn)題，應(yīng)當(dāng)探索更多用于誘導(dǎo)愈傷組織的外植體種類，同時(shí)致力于抑制愈傷組織的褐化，確保得到的愈傷組織顏色良好，質(zhì)地緊密；此外，還應(yīng)進(jìn)一步探索基本培養(yǎng)基與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)愈傷組織分化的影響。

3 體細(xì)胞胚培養(yǎng)

國(guó)內(nèi)對(duì)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)的相關(guān)研究較少，僅有雜交鵝掌楸(Liriodendron×sinoamericanum)的體細(xì)胞胚培養(yǎng)的研究見(jiàn)于報(bào)道。陳金慧(2003)以雜交鵝掌楸幼胚為外植體，以蔗糖為滲透劑提高滲透壓，在MS+1～4 mg·L-1培養(yǎng)基上有效誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚。體胚發(fā)生初期添加 0.1 mg·L-1的磺肽素(PSK)可以提高未成熟胚的脫分化率并能有效改善培養(yǎng)細(xì)胞的狀態(tài)；0.5 mg·L-1的PSK能夠促進(jìn)胚性愈傷組織的形成和增殖(陳金慧等，2013)。1 μmol·L-1的茉莉酸甲酯(MeJA)可以提高雜交鵝掌楸的體胚發(fā)生率和成熟率、降低畸形胚發(fā)生率，2 mg·L-1ABA能夠增強(qiáng) MeJA 的上述效應(yīng)(成鐵龍等，2017)。

國(guó)外對(duì)木蘭科中木蘭屬植物胚狀體的培養(yǎng)研究相對(duì)較多。幼胚是木蘭科植物適宜的體胚發(fā)生外植體，弗吉尼亞木蘭 (Magnoliavirginiana)、福來(lái)氏木蘭(M.fraseri)、尖頭木蘭(M.acuminata)、金字塔玉蘭(M.pyramata)和北美大葉木蘭(M.macrophylla)、墨西哥大葉木蘭、日本厚樸、黃蘭含笑(Micheliachampaca)都通過(guò)未成熟種子成功誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚(Merkle & Wiecko, 1990; Merkle & Watson, 1993, 1994; Rosas et al., 2006; Kim et al., 2007; Armiyanti, 2012; Park et al., 2012; Cortazar et al., 2020)。

基因型、培養(yǎng)基和發(fā)育時(shí)期等是影響體細(xì)胞胚發(fā)生的關(guān)鍵因素。體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)一般選擇在添加一定濃度2,4-D(0.01～1 mg·L-1)的WPM培養(yǎng)基上進(jìn)行(Armiyanti, 2012; Cortazar et al., 2020)。有機(jī)附加物是木蘭科體胚誘導(dǎo)所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，酪蛋白水解物、谷氨酰胺常被添加至誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。未成熟種子最佳采集時(shí)間為花后3～4周；培養(yǎng)基中添加蔗糖比添加葡萄糖更利于體細(xì)胞胚的形成，蔗糖的最適添加量為3%(Kim et al., 2007)。

成功誘導(dǎo)出的體細(xì)胞胚往往轉(zhuǎn)移到無(wú)激素的培養(yǎng)基上繼續(xù)萌發(fā)成苗，黃蘭含笑體細(xì)胞胚在MS培養(yǎng)基上萌發(fā)率為34%(Armiyanti, 2012)，日本厚樸體細(xì)胞胚在1/2MS培養(yǎng)基上萌發(fā)率在80%以上，并形成正常的初生葉和根(Park et al., 2012)。

體細(xì)胞胚培養(yǎng)存在的問(wèn)題是體胚誘導(dǎo)率和分化成苗率都很低，并且成功誘導(dǎo)出的體細(xì)胞胚中還有相當(dāng)一部分是不能發(fā)育成苗的畸形胚(Merkle & Wiecko, 1990; Merkle & Watson, 1993, 1994; Kim et al., 2007)，在今后的研究中還需進(jìn)一步探索。

4 胚培養(yǎng)

木蘭科植物的胚培養(yǎng)大多是幼胚培養(yǎng)。由于帶種皮的種胚消毒不易徹底，因此接種前必須剝?nèi)シN皮。幼胚滅菌時(shí)，相較于帶外種皮與中種皮的種子，只帶內(nèi)種皮的種子污染率更低(徐石等，2008)。0.1% HgCl2消毒醉香含笑(M.macclurei)種胚 6～9 min，能獲得60%～65%無(wú)菌且可萌發(fā)的外植體(劉英， 2021)。天女木蘭種子采用75%酒精30 s+NaClO 10 min滅菌效果最佳，存活率達(dá)48%(于新杰，2016)。

在基本培養(yǎng)基的選擇方面，B5培養(yǎng)基較為適宜，其含有幼胚生長(zhǎng)所需的Ca2+、K+等大量元素和微量元素(杜鳳國(guó)等，2006；于新杰，2016)。在植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的選擇方面，6-BA顯著影響芽的增殖，6-BA 和 NAA 較 ZT、KT、IBA、2,4-D、IAA更適合白玉蘭幼胚離體培養(yǎng)中的增殖培養(yǎng)。天女木蘭幼胚離體培養(yǎng)的最適增殖培養(yǎng)基是B5+6-BA 2 mg·L-1+NAA 0.04 mg·L-1+IBA 0.5 mg·L-1+AC 1 g·L-1，增殖系數(shù)超過(guò)3.6(陸秀君等，2008)。適合凹葉厚樸增殖的培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.5 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1，增殖系數(shù)可達(dá) 6.2(馬英姿等，2014)。由于木蘭科植物種子中酚類物質(zhì)含量較多且易出現(xiàn)褐化，因此在培養(yǎng)基中往往加入AC(陸秀君等，2008)或 4～8 g·L-1的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)來(lái)抑制其褐化(劉英，2021)。

由于木蘭科植物成熟種子休眠期較長(zhǎng)，休眠延長(zhǎng)了種子的萌發(fā)進(jìn)程，因此直接利用木蘭科植物成熟種子啟動(dòng)離體培養(yǎng)的研究相對(duì)較少。目前僅見(jiàn)的報(bào)道是Sokolov等(2014)對(duì)廣玉蘭和二喬玉蘭的研究，具體的做法是先對(duì)種子層積處理30 d和90 d后再進(jìn)行離體培養(yǎng)，其種子萌發(fā)培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg·L-1，萌發(fā)植株生長(zhǎng)良好，層積處理后的種子在離體條件下的發(fā)芽率和成活率均好于直接播種。

5 技術(shù)難點(diǎn)

5.1 褐化

褐化在木蘭科植物的組培過(guò)程中普遍存在，外植體的褐化影響了多種木蘭科植物芽的萌發(fā)、愈傷組織的增殖與分化(劉均利和馬明東，2007；劉葉蔓等，2008)，導(dǎo)致組培效率不高，從而限制了組培苗大規(guī)模的生產(chǎn)(周麗艷等，2008；王歡等，2012)。對(duì)于木蘭科植物易褐化的問(wèn)題，前人通過(guò)外植體類型選擇、采條季節(jié)選擇、外植體預(yù)處理方式、添加抗氧化劑、暗培養(yǎng)等多種方法加以抑制，并取得了較好的效果。

(1)外植體類型選擇：由于不同外植體中多酚氧化酶(PPO)與酚類物質(zhì)各異，因此選擇低PPO活性或低酚類含量的外植體可有效降低褐化程度，如天女木蘭的側(cè)芽作為外植體，褐化程度較之其他部位要低(徐石等，2008；王歡等，2012)。

(2)采條季節(jié)選擇：植物在不同季節(jié)的代謝活動(dòng)有強(qiáng)弱，PPO的活性有所不同，如白玉蘭外植體在春、冬兩季取材PPO活性較低且褐化率較低(周麗艷等，2008；王歡等，2012)。

(3)外植體的預(yù)處理方式：接種前的預(yù)處理包括浸泡外植體與低溫預(yù)處理，如在清水中浸泡12 h以上(王奇等，2009)、在1 g·L-1維生素C(VC)或PVP溶液中浸泡4～6 h(王歡等，2012；王倩穎等，2017)、4 ℃低溫預(yù)處理5～7 d(朱碧華等，2009)、8 ℃低溫暗培養(yǎng)4 d(劉均利和馬明東，2007)都可以有效減輕褐化。

(4)暗培養(yǎng)：黑暗環(huán)境可以抑制PPO的活性，培養(yǎng)初期一定時(shí)間的暗培養(yǎng)可以降低褐化率(周麗艷等，2008；王歡等，2012)。

(5)培養(yǎng)基類型：培養(yǎng)基中NH4+濃度過(guò)高可能會(huì)導(dǎo)致褐化，如相較于高濃度NH4+的MS培養(yǎng)基，B5培養(yǎng)基降低了天女木蘭外植體的褐化率(王歡等，2012)。

(6)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑：6-BA、KT等細(xì)胞分裂素既能促進(jìn)酚類化合物的合成，又能刺激PPO的活性。6-BA對(duì)二喬玉蘭的芽中酚類物質(zhì)的產(chǎn)生具有調(diào)節(jié)作用，隨著6-BA濃度的升高(0.2～1 mg·L-1)，酚類物質(zhì)含量呈上升趨勢(shì)(Wojtania et al., 2015)。

(7)添加抗氧化劑、吸附劑：向培養(yǎng)基中添加適宜濃度的抗氧化劑[如檸檬酸(CA)、VC、硝酸銀(AgNO3)]或吸附劑(如PVP、AC)能有效抑制褐化。CA 通過(guò)降低 POD 活性或結(jié)合培養(yǎng)基中的金屬離子抑制PPO的活性，防止酶促褐變；AgNO3通過(guò)降低MS培養(yǎng)基中易引起酚類物質(zhì)產(chǎn)生的NH4+來(lái)抑制褐變，而AC、PVP則是通過(guò)吸附外植體產(chǎn)生的醌類物質(zhì)來(lái)抑制褐變。適宜的抗褐化劑因基因型與外植體種類的不同而異(王倩穎等，2017)，如Na2S2O3、CA對(duì)白玉蘭外植體的抑褐效果好于PVP、VC(周麗艷等，2008)，而PVP、VC對(duì)天女木蘭外植體抗褐化效果卻更好(王歡等，2012；高紅兵等，2017)。景寧木蘭(Magnoliasinostellata)葉片最佳抗褐化劑為AgNO3，而帶芽莖段和根部的最優(yōu)抗褐化劑為CA(王倩穎等，2017)。由于過(guò)高濃度的 PVP和AC會(huì)抑制芽的增殖和根的形成(Parris et al., 2012)，因此需要探索抗褐化劑的適宜濃度。一般VC使用的最適濃度為500 mg·L-1，PVP最適濃度為1 000～1 500 mg·L-1，CA最適濃度為300 mg·L-1(高紅兵等，2017)，AC濃度以0.5%為佳(曾宋君等，2000；陸秀君等，2008)。

目前，木蘭科植物組培的褐化問(wèn)題主要通過(guò)在培養(yǎng)基中添加抗褐化劑來(lái)抑制，除了上述提到的抗褐化劑外，抗氧化劑一類中的植酸、L-半胱氨酸、甘露醇、血清白蛋白等未見(jiàn)應(yīng)用于木蘭科植物的組培，可在未來(lái)的實(shí)驗(yàn)中嘗試。此外，螯合劑乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)可替代蛋白質(zhì)與多酚氧化酶類進(jìn)行螯合，減少酚的氧化作用；PAL抑制劑2-氨基茚滿-2-膦酸(2-aminoindane-2-phosphonic acid，AIP)可以通過(guò)抑制苯丙氨酸生物合成來(lái)減少褐變(Jones & Saxena, 2013)；表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)可以通過(guò)抑制PPO以抑制褐變(Saeleaw et al., 2017)；高劑量的納米碳可以防止褐化現(xiàn)象(馮璐等，2017)。這些不同抗褐化劑對(duì)褐化的抑制效果，都將成為未來(lái)研究的內(nèi)容。

5.2 生根困難

木本植物組織培養(yǎng)普遍存在生根困難問(wèn)題，如紫花含笑(Micheliacrassipes)組培苗生根率僅有33%(朱碧華等，2009)，紫玉蘭帶芽莖段組培苗生根率僅有35%(陸秀君等，2009)，玉蘭品種‘Ann’的生根率只有16%(Parris et al., 2012)，而有些種類甚至無(wú)法生根，只能進(jìn)行到增殖培養(yǎng)階段(鄭珂媛，2017；楊梅等，2017；尤潤(rùn)等，2019)。

基因型、樹(shù)種產(chǎn)地、培養(yǎng)條件等都可能是影響生根的因素，前人通過(guò)改善生根培養(yǎng)的條件、改變生根的方式等技術(shù)措施來(lái)促進(jìn)生根。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類和濃度等可以促進(jìn)生根，如對(duì)難以生根的木蘭品種‘黃鳥(niǎo)’可以通過(guò)降低其生根培養(yǎng)基中的蔗糖濃度(20 g·L-1)來(lái)促進(jìn)有效生根(Wojtania et al., 2019)；添加低濃度的AC可優(yōu)化生根效果(陳金慧和施季森，2002；Parris et al., 2012)；添加適宜的生根劑如新型植物活性劑DA-6有利于天女木蘭組培苗生根(孫銘鴻等，2012)。對(duì)生根類型為誘導(dǎo)生根型的一些木蘭科植物如紫花含笑(宋曉琛等，2014)，可以適當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)基成分，誘導(dǎo)出愈傷組織，從而促進(jìn)其不定根的形成。改變生根方式，如試管外生根、浸泡生根法是提高生根率的途徑，郭治友等(2008)利用試管外生根將雜交鵝掌楸組培苗的生根率提高至83.3%。此外，間歇浸沒(méi)式培養(yǎng)系統(tǒng)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種植物組織培養(yǎng)系統(tǒng)，較之傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)，具有培養(yǎng)周期短、增殖率高、自動(dòng)化程度高、培養(yǎng)通量大等特點(diǎn)(張杰等，2020)，利用此系統(tǒng)或可促進(jìn)生根。

6 研究展望

在我國(guó)木蘭科植物的組織培養(yǎng)研究中，無(wú)菌短枝扦插途徑的再生體系已相對(duì)完善，從滅菌到啟動(dòng)、增殖、生根的培養(yǎng)基與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的選擇雖有大量研究，但研究的植物種類有限。頂芽、莖段相較于其他外植體易于獲得且誘導(dǎo)率高，無(wú)菌短枝扦插途徑作為木蘭科植物組織培養(yǎng)的主要再生途徑，應(yīng)考慮將更多具有優(yōu)良特性的野生種質(zhì)資源納入研究范圍。

器官發(fā)生途徑、體細(xì)胞胚發(fā)生途徑研究相對(duì)尚淺，器官發(fā)生途徑中選擇的外植體類型有限，其他植物中最常用于誘導(dǎo)愈傷組織的葉片卻因?yàn)楹只y以誘導(dǎo)愈傷，并且僅有極少的種類能誘導(dǎo)愈傷組織再分化為芽。體細(xì)胞胚發(fā)生途徑在國(guó)內(nèi)鮮有研究，并且存在體胚誘導(dǎo)率和分化成苗率低的問(wèn)題。此外，木蘭科植物組培中普遍存在褐化與生根困難的技術(shù)難題，目前尚未從根源上得到解決，這也限制了組培苗的大批量繁殖。

針對(duì)上述問(wèn)題，未來(lái)木蘭科植物的組織培養(yǎng)需圍繞以下幾個(gè)方面重點(diǎn)展開(kāi)研究。(1)全面探索木蘭科不同植物種類的組織培養(yǎng)，特別是木蘭屬、含笑屬以外的種類，通過(guò)組培的技術(shù)手段，保存更多珍稀瀕危的野生種質(zhì)資源；對(duì)于已經(jīng)建立再生體系的品種，可進(jìn)一步優(yōu)化再生培養(yǎng)條件，提高再生效率，以備工廠化育苗之需。(2)探索更多種類的外植體的離體再生，嘗試雄蕊、雌蕊、花被、花柱、花托、子房、葉柄、根等不常見(jiàn)的外植體種類。(3)針對(duì)增殖系數(shù)普遍較低的問(wèn)題，可以通過(guò)研究增殖期間內(nèi)源激素的變化來(lái)確定適宜的外源激素濃度與配比，并考慮環(huán)境因子如溫度和光照對(duì)增殖的影響。(4)對(duì)于褐化問(wèn)題，除探討外植體類型與取材時(shí)期、預(yù)處理方式、不同種類的抗氧化劑、吸附劑對(duì)于褐化的抑制效果外，應(yīng)結(jié)合酚類物質(zhì)、PPO等相關(guān)酶的活性測(cè)定，鑒定褐化反應(yīng)的底物，并研究組培褐化的分子調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步揭示褐化機(jī)理，從而通過(guò)改變相關(guān)基因的表達(dá)從根源上減少褐化。(5)對(duì)于生根困難問(wèn)題，可以通過(guò)改善生根培養(yǎng)的條件、改變生根的方式和添加適宜的生根劑來(lái)促進(jìn)生根，并對(duì)生根的組培苗生理生化指標(biāo)進(jìn)行分析，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行解剖學(xué)觀察，判斷生根類型、研究生根機(jī)理。(6)體細(xì)胞胚胎培養(yǎng)作為再生途徑之一，可以克服生根困難的問(wèn)題，但在國(guó)內(nèi)卻鮮有研究，應(yīng)作為未來(lái)探索的重點(diǎn)。

在組培技術(shù)的應(yīng)用方面，木蘭科植物中珍稀瀕危的種類眾多，少數(shù)種如景寧木蘭(Magnoliasinostellata)、華木蓮(Manglietiadecidua)等的組織培養(yǎng)雖有初步研究(王倩穎等，2017；尤潤(rùn)等，2019)，以及結(jié)合液滴玻璃化技術(shù)低溫保存‘Ashei’木蘭 (Magnoliamacrophyllavar.ashei)離體莖尖的例子(Folgado & Panis, 2019)，但木蘭科更多的瀕危物種的種質(zhì)資源有待利用組培技術(shù)保存。木蘭科中一些種類如厚樸和凹葉厚樸等具有重要的藥用價(jià)值，其組織培養(yǎng)和高產(chǎn)細(xì)胞系的建立能夠?yàn)榕可a(chǎn)中藥材原料藥和厚樸酚類藥物奠定基礎(chǔ)。此外，組培技術(shù)還是基因工程技術(shù)的基礎(chǔ)，將在木蘭科植物基因功能驗(yàn)證、品種改良及優(yōu)良新品種選育等方面發(fā)揮更大作用。